本發(fā)明屬于尿液有形成分分析，具體是一種紅細(xì)胞模擬物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、尿液有形成分分析是對尿液中的有形成分進(jìn)行檢查，是臨床體檢中最常見的“三大常規(guī)”項目之一，其通過識別尿液中細(xì)胞、結(jié)晶、管型、細(xì)菌、寄生蟲等各種病理成分，能夠輔助泌尿系統(tǒng)疾病的診斷、定位、鑒別診斷及判斷預(yù)后。全身或泌尿系統(tǒng)相鄰器官病變可能會引起尿液有形成分檢測中出現(xiàn)紅細(xì)胞和白細(xì)胞。其中，出現(xiàn)紅細(xì)胞是常見的臨床表現(xiàn)，可反映急性腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、腎結(jié)石、腎結(jié)核、尿路感染、血友病等，由此可見，尿液有形成分中紅細(xì)胞檢測對于診斷尿路系統(tǒng)疾病具有重要意義。尿液有形成分分析多依靠顯微鏡或?qū)Ｓ迷O(shè)備進(jìn)行觀察，因此在尿液有形成分檢測和分析中，質(zhì)控物質(zhì)對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性起著關(guān)鍵作用。

2、目前，尿液中紅細(xì)胞分析所用到的質(zhì)控物質(zhì)還存在一些不足，例如：(1)市場方面，尿液中紅細(xì)胞分析用的質(zhì)控物質(zhì)相對較少。(2)原料方面，有的質(zhì)控物質(zhì)采用乳膠等原料制備而成，與人體紅細(xì)胞形態(tài)差異較大，容易造成儀器檢測不準(zhǔn)確；有的質(zhì)控物質(zhì)采用尿液作為紅細(xì)胞來源，該來源得到的紅細(xì)胞原料存在細(xì)胞皺縮、突起等不均一的明顯現(xiàn)象，使得質(zhì)控物質(zhì)中紅細(xì)胞形態(tài)差異較大且存在明顯的批間差，限制了尿液中紅細(xì)胞分析的準(zhǔn)確性和可靠性，若引入原料篩選標(biāo)準(zhǔn)則可能導(dǎo)致多批次原料報廢，原料利用率較低。(3)制備工藝方面，現(xiàn)有的質(zhì)控物質(zhì)制備方法存在操作復(fù)雜、工藝不穩(wěn)定等問題，主要體現(xiàn)在成品中紅細(xì)胞形態(tài)不均一性顯著、紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血現(xiàn)象、紅細(xì)胞在長期儲存中容易發(fā)生聚集等，使得所制備得到的質(zhì)控物質(zhì)存在紅細(xì)胞穩(wěn)定性差、保存時間較短、生產(chǎn)成本較高、臨床應(yīng)用受限等不足。

3、因此，迫切需要發(fā)明一種尿液中紅細(xì)胞分析用的新型質(zhì)控物質(zhì)及其制備方法，以便以較低的成本、簡單的生產(chǎn)工藝得到具有紅細(xì)胞均一性好、穩(wěn)定性高的質(zhì)控物質(zhì)，以滿足尿液中紅細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性和可靠性要求。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于此，本發(fā)明的目的在于提供一種紅細(xì)胞模擬物及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法操作簡單，有利于產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)；所制備得到的紅細(xì)胞模擬物中紅細(xì)胞均一性好、性能穩(wěn)定，且該紅細(xì)胞模擬物中的紅細(xì)胞與人體尿液中紅細(xì)胞形態(tài)近似，將該紅細(xì)胞模擬物用于制備尿液有形成分分析用的質(zhì)控物質(zhì)，能滿足尿液中紅細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性和可靠性要求。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種紅細(xì)胞模擬物的制備方法，所述制備方法包括：

4、(1)預(yù)處理：獲得哺乳動物全血并純化，得到紅細(xì)胞；

5、(2)均一化處理：用均一化試劑對步驟(1)得到的紅細(xì)胞進(jìn)行均一化處理；

6、(3)細(xì)胞修復(fù)處理：用細(xì)胞修復(fù)液對步驟(2)得到紅細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞修復(fù)處理；

7、(4)固定處理：用固定劑對步驟(3)得到紅細(xì)胞進(jìn)行固定處理。

8、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑是含表面活性劑的高滲透壓試劑。

9、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑中表面活性劑的濃度為0.25～0.4g/l。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑中表面活性劑的濃度為0.25～0.4g/l是指在均一化試劑中表面活性劑的含量可以選自以下濃度中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：0.25、0.3、0.35、0.4g/l。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述表面活性劑選自十二烷基三甲基氯化銨、十二烷基磺酸鈉、十二烷基二甲基甜菜堿、十四烷基二甲基甜菜堿中的一種或兩種以上。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑的滲透壓為518～540mosm/kg。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑還包括滲透壓調(diào)節(jié)劑；優(yōu)選地，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑為氯化鈉、氯化鉀中的一種或兩種；更優(yōu)選地，所述均一化試劑中滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度為7.8～9g/l。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑的ph值為7.0～8.0。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑還包括ph值調(diào)節(jié)劑；優(yōu)選地，所述ph值調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉、氫氧化鉀中的一種或兩種。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述均一化試劑還包括緩沖液；優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；更優(yōu)選地，所述均一化試劑中磷酸鹽緩沖液的濃度為50～100mmol/l。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液包括如下組分：3～8g/l丙酮酸鈉、0.1～1g/l腺嘌呤核苷、10～15g/l肌苷。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液包括3～8g/l丙酮酸鈉是指在細(xì)胞修復(fù)液中丙酮酸鈉的含量可以選自以下濃度中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8g/l。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液包括0.1～1g/l腺嘌呤核苷是指在細(xì)胞修復(fù)液中腺嘌呤核苷的含量可以選自以下濃度中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1g/l。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液包括10～15g/l肌苷是指在細(xì)胞修復(fù)液中肌苷的含量可以選自以下濃度中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15g/l。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液的ph值為7.0±0.2，滲透壓為340～510mosm/kg。

22、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞修復(fù)液還包括緩沖液；優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞修復(fù)液中磷酸鹽緩沖液的濃度為50～100mmol/l。

23、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述固定劑包括如下組分：甲醛和戊二醛；優(yōu)選地，在固定劑中，所述甲醛的體積濃度為1～5％，優(yōu)選為5％，所述戊二醛的體積濃度為1～5％，優(yōu)選為2.5％。

24、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述固定劑的ph為7.0±0.2，滲透壓為350～450mosm/kg。

25、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述固定劑還包括緩沖液；優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；更優(yōu)選地，所述固定劑中磷酸鹽緩沖液的濃度為10～100mmol/l。

26、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述固定劑中甲醛的體積濃度為1～5％是指在固定劑中甲醛的含量可以選自以下體積百分比中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％。

27、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述固定劑中戊二醛的體積濃度為1～5％是指在固定劑中戊二醛的含量可以選自以下體積百分比中任意數(shù)值或其任意兩者之間的任意數(shù)值：1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％。

28、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(1)中純化包括進(jìn)行過濾以除去白細(xì)胞的操作；優(yōu)選地，所述過濾為采用白細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾。

29、所述步驟(1)中純化過程具體包括：對哺乳動物全血進(jìn)行離心，棄去上層清液，然后往下層血漿中加入磷酸緩沖液，再離心棄去上層清液，再次加入磷酸緩沖液，然后采用白細(xì)胞過濾器進(jìn)行過濾，回收濾液中的紅細(xì)胞；優(yōu)選地，每次離心的條件相同或不同，各自滿足以下條件：轉(zhuǎn)數(shù)為2000～3000rpm，時間為5～15min。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(2)中均一化處理包括將紅細(xì)胞于1～3倍體積的均一化試劑中處理40～80min。

31、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(2)還包括對經(jīng)均一化試劑處理后的紅細(xì)胞用磷酸緩沖液進(jìn)行清洗，優(yōu)選地，清洗1～5次。

32、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(3)中細(xì)胞修復(fù)處理包括將紅細(xì)胞于1～3倍體積的細(xì)胞修復(fù)液中，在35～40℃條件下處理20～40min；或所述步驟(3)中細(xì)胞修復(fù)處理包括將紅細(xì)胞用細(xì)胞修復(fù)液清洗2～5次。

33、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(3)還包括對經(jīng)細(xì)胞修復(fù)液處理后的紅細(xì)胞用磷酸緩沖液進(jìn)行清洗，優(yōu)選地，清洗1～5次。

34、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述步驟(4)中固定處理包括將紅細(xì)胞于10～20倍體積的固定劑中固定15～20h。

35、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述哺乳動物為豬、兔、狗、牛、人等。

36、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述哺乳動物全血是由哺乳動物新鮮血液經(jīng)抗凝處理得到的血樣；更優(yōu)選地，所述抗凝劑為edta-2na。

37、在本發(fā)明的一些實施方式中，用于制備紅細(xì)胞模擬物的哺乳動物全血應(yīng)自從哺乳動物獲取后在7天內(nèi)使用。

38、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述方法還包括將固定處理得到的紅細(xì)胞保存在細(xì)胞保存液中。

39、在本發(fā)明的一些實施方式中，對經(jīng)固定處理得到的紅細(xì)胞先用磷酸緩沖液進(jìn)行清洗，優(yōu)選清洗1～5次，再將紅細(xì)胞保存在細(xì)胞保存液中。

40、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞保存液的ph值為6.7～8.0，滲透壓為280～450mosm/kg。

41、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞保存液組分包括10g/l海藻糖、5g/l甘露醇、6g/l甘氨酸。

42、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細(xì)胞保存液還包括緩沖液；優(yōu)選地，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液；更優(yōu)選地，所述細(xì)胞保存液中磷酸鹽緩沖液的濃度為50～150mmol/l。

43、在本發(fā)明的一些實施方式中，保存在細(xì)胞保存液中的紅細(xì)胞的濃度控制在1100～1300個/μl。

44、第二方面，本發(fā)明提供了一種由第一方面所述的制備方法制備得到的紅細(xì)胞模擬物。

45、第三方面，本發(fā)明提供了第二方面所述的紅細(xì)胞模擬物在制備尿液有形成分分析用的質(zhì)控物質(zhì)中的應(yīng)用。

46、第四方面，本發(fā)明提供了一種尿液有形成分分析用的質(zhì)控物質(zhì)，其包含第二方面所述的紅細(xì)胞模擬物。

47、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述質(zhì)控物質(zhì)還包含有白細(xì)胞模擬物。

48、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述質(zhì)控物質(zhì)中紅細(xì)胞為800～1250個/μl，白細(xì)胞為184～280個/μl；例如質(zhì)控物質(zhì)中紅細(xì)胞為1050個/μl，白細(xì)胞為250個/μl。

49、本發(fā)明的有益效果如下：

50、本發(fā)明首次提出了對來源于哺乳動物全血的紅細(xì)胞依次進(jìn)行均一化處理、細(xì)胞修復(fù)處理、固定處理的生產(chǎn)工藝，以解決現(xiàn)有紅細(xì)胞模擬物生產(chǎn)工藝中所存在的產(chǎn)品中紅細(xì)胞均一性差、穩(wěn)定性低的問題。

51、本發(fā)明首次提出了通過含表面活性劑的高滲透壓試劑對紅細(xì)胞原料進(jìn)行均一化處理，以提高紅細(xì)胞的均一性。而且，本發(fā)明用高滲透壓的試劑對紅細(xì)胞進(jìn)行處理，還能很好地避免紅細(xì)胞內(nèi)容物破出，可以有效較低紅細(xì)胞模擬物的“溶血”現(xiàn)象。

52、本發(fā)明首次提出了利用含特定組分的細(xì)胞修復(fù)液對經(jīng)過均一化處理的紅細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)處理，以提高紅細(xì)胞模擬物中紅細(xì)胞的穩(wěn)定性。本發(fā)明選用包含特定濃度的丙酮酸鈉、腺嘌呤核苷和肌苷的試劑對紅細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)處理，能有效提高紅細(xì)胞的穩(wěn)定性，降低紅細(xì)胞溶血和凝集的現(xiàn)象。

53、本發(fā)明的制備方法操作簡單，有利于產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)；所制備得到的紅細(xì)胞模擬物中紅細(xì)胞均一性好、性能穩(wěn)定，且該紅細(xì)胞模擬物中的紅細(xì)胞與人體尿液中紅細(xì)胞形態(tài)近似，將該紅細(xì)胞模擬物用于制備尿液有形成分分析用的質(zhì)控物質(zhì)，能滿足尿液中紅細(xì)胞檢測的準(zhǔn)確性和可靠性要求，而且能適用于不同的機(jī)型，例如：邁克生物全自動尿液分析儀u2000s、優(yōu)利特urit全自動尿液分析系統(tǒng)us-1681、olympus光學(xué)尿液分析儀bxbf。