本發(fā)明涉及基因編輯領(lǐng)域，特別是規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)。具體而言，本發(fā)明涉及一種活性提高的突變的cas12j蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：：1、crispr/cas技術(shù)是一種被廣泛使用的基因編輯技術(shù)，它通過(guò)rna引導(dǎo)對(duì)基因組上的靶序列進(jìn)行特異性結(jié)合并切割dna產(chǎn)生雙鏈斷裂，利用生物非同源末端連接或同源重組進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯。2、crispr/cas9系統(tǒng)是最常用的ii型crispr系統(tǒng)，它識(shí)別3’-ngg的pam基序，對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行平末端切割。crispr/cas?type?v系統(tǒng)是一類(lèi)新發(fā)現(xiàn)的crispr系統(tǒng)，它具有5’-ttn的基序，對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行粘性末端切割，例如cpf1,c2c1,casx,casy。然而目前存在的不同的crispr/cas各有不同的優(yōu)點(diǎn)和缺陷。例如cas9,c2c1和casx均需要兩條rna進(jìn)行指導(dǎo)rna，而cpf1只需要一條指導(dǎo)rna而且可以用來(lái)進(jìn)行多重基因編輯。casx具有980個(gè)氨基酸的大小，而常見(jiàn)的cas9，c2c1，casy和cpf1通常大小在1300個(gè)氨基酸左右。此外，cas9，cpf1，casx，casy的pam序列都比較復(fù)雜多樣，而c2c1識(shí)別嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?’-ttn，因此它的靶標(biāo)位點(diǎn)比其他系統(tǒng)容易被預(yù)測(cè)從而降低了潛在的脫靶效應(yīng)。3、中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利cn111770992b中公開(kāi)了一種cas蛋白cas12j.19，還公開(kāi)了該蛋白可以在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯，但是，其編輯活性并不高，為了提高該蛋白的編輯效率，本技術(shù)對(duì)該蛋白進(jìn)行了優(yōu)化，提高了其在真核細(xì)胞中的編輯效率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路1、本技術(shù)的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)和反復(fù)摸索，通過(guò)對(duì)cas12j.19(本技術(shù)中將其稱(chēng)之為，cas12j19)蛋白的定點(diǎn)突變，提高了其編輯活性，擴(kuò)展了其應(yīng)用范圍。2、cas效應(yīng)蛋白3、一方面，本發(fā)明提供了一種活性改善或活性提高的cas突變蛋白，所述突變蛋白與親本cas蛋白的氨基酸序列相比，在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列的以下任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)處存在突變：第3位、第4位、第99位、第154位、第228位、第231位、第400位、第411位、第647位、第649位或第658位。4、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述突變蛋白與親本cas蛋白的氨基酸序列相比，在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列的以下任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)處存在突變：第3位、第4位、第99位、第154位、第228位、第231位、第400位、第411位、第647位、第649位或第658位；所述任意幾個(gè)選自：任意2個(gè)、任意3個(gè)、任意4個(gè)、任意5個(gè)、任意6個(gè)、任意7個(gè)、任意8個(gè)、任意9個(gè)、任意10個(gè)或任意11個(gè)。5、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas突變蛋白與親本cas蛋白的氨基酸序列相比，在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列還包括以下氨基酸位點(diǎn)的突變：第100位。6、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas突變蛋白與親本cas蛋白的氨基酸序列相比，在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列的以下氨基酸位點(diǎn)處存在突變：7、第100位氨基酸和第3位氨基酸同時(shí)突變；8、或，第100位氨基酸和第99位氨基酸同時(shí)突變；9、或，第100位氨基酸和第154位氨基酸同時(shí)突變；10、或，第100位氨基酸和第231位氨基酸同時(shí)突變；11、或，第100位氨基酸和第400位氨基酸同時(shí)突變；12、或，第100位氨基酸和第411位氨基酸同時(shí)突變；13、或，第100位氨基酸和第647位氨基酸同時(shí)突變；14、或，第100位氨基酸和第649位氨基酸同時(shí)突變；15、或，第100位氨基酸和第658位氨基酸同時(shí)突變；16、或，第100位氨基酸、第400位氨基酸和第763位氨基酸同時(shí)突變；17、或，第100位氨基酸、第400為氨基酸、第763位氨基酸和第45位氨基酸同時(shí)突變。18、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第3位氨基酸突變?yōu)榉莝的氨基酸，例如，a，v，g，l，d，f，w，y，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。19、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第4位氨基酸突變?yōu)榉莥的氨基酸，例如，a，v，g，l，d，f，w，s，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。20、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第99位氨基酸突變?yōu)榉莑的氨基酸，例如，a，v，g，y，d，f，w，s，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。21、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第154位氨基酸或第231位氨基酸突變?yōu)榉莂的氨基酸，例如，l，v，g，y，d，f，w，s，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。22、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第228位氨基酸或第400位氨基酸突變?yōu)榉莝的氨基酸，例如，a，v，g，y，d，f，w，l，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。23、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第411位氨基酸或第647位氨基酸突變?yōu)榉莟的氨基酸，例如，a，v，g，l，d，f，w，y，n，e，q，k，m，s，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。24、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第649位氨基酸或第658位氨基酸突變?yōu)榉莇的氨基酸，例如，a，v，g，l，s，f，w，y，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。25、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第100位氨基酸突變?yōu)榉莈的氨基酸，例如，a，v，g，l，s，f，w，y，n，d，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閗。26、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第763位氨基酸突變?yōu)榉莑的氨基酸，例如，a，v，g，y，d，f，w，s，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閞。27、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第45位氨基酸突變?yōu)榉莝的氨基酸，例如，a，v，g，y，d，f，w，l，n，e，q，k，m，t，c，p，h，r，i；優(yōu)選，突變?yōu)閠。28、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述親本cas蛋白的氨基酸序列與seq?id?no.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。29、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述親本cas蛋白為cas12家族的cas蛋白，優(yōu)選，cas12j家族的cas蛋白，例如，cn111770992b公開(kāi)的cas12j.3-cas12j.22等；在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述親本cas蛋白為cas12j19；所述cas12j19的氨基酸序列與seq?id?no.1相比具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％或100％的序列同一性。30、來(lái)自多種生物體的cas蛋白或cas12j蛋白都可以用作親本cas蛋白，在一些實(shí)施方式中，所述親本cas蛋白或cas12j蛋白具有核酸酶活性。在一些實(shí)施方案中，所述親本cas蛋白是核酸酶，即切割靶雙螺旋核酸(例如，雙螺旋dna)的兩條鏈。在一些實(shí)施方案中，所述親本cas蛋白是切口酶，即切割靶雙螺旋核酸(例如，雙螺旋dna)的單鏈。31、在一些實(shí)施方案中，所述親本cas蛋白為天然野生型cas蛋白；在其他的實(shí)施方式中，所述親本cas蛋白為經(jīng)過(guò)工程化改造后的cas蛋白。32、本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，可以改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)而不對(duì)其活性和功能性產(chǎn)生不利影響，例如，可以在蛋白質(zhì)氨基酸序列中引入一個(gè)或多個(gè)保守性氨基酸取代，而不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)分子的活性和/或三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚保守性氨基酸取代的實(shí)例以及實(shí)施方式。具體的說(shuō)，可以用與待取代位點(diǎn)屬于相同組的另一氨基酸殘基取代該氨基酸殘基，即用非極性氨基酸殘基取代另一非極性氨基酸殘基，用極性不帶電荷的氨基酸殘基取代另一極性不帶電荷的氨基酸殘基，用堿性氨基酸殘基取代另一堿性氨基酸殘基，和用酸性氨基酸殘基取代另一酸性氨基酸殘基。這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的。只要取代不導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物活性的失活，則一種氨基酸被屬于同組的其他氨基酸替換的保守取代落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一個(gè)或多個(gè)保守性取代,這些保守性取代最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。另外，本發(fā)明也涵蓋還包含一個(gè)或多個(gè)其他非保守取代的蛋白，只要該非保守取代不顯著影響本發(fā)明的蛋白質(zhì)的所需功能和生物活性即可。33、保守氨基酸置換可以在一個(gè)或多個(gè)預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基處進(jìn)行。“非必需”氨基酸殘基是可以發(fā)生改變(缺失、取代或置換)而不改變生物活性的氨基酸殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所需的?！氨Ｊ匕被嶂脫Q”是其中氨基酸殘基被具有類(lèi)似側(cè)鏈的氨基酸殘基替代的置換。氨基酸置換可以在上述cas突變蛋白的非保守區(qū)域中進(jìn)行。一般而言，此類(lèi)置換不對(duì)保守的氨基酸殘基，或者不對(duì)位于保守基序內(nèi)的氨基酸殘基進(jìn)行，其中此類(lèi)殘基是蛋白質(zhì)活性所需的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，功能變體可以具有較少的在保守區(qū)域中的保守或非保守改變。34、表135、 最初的殘基 代表性的取代 優(yōu)選的取代 ala(a) val；leu；ile val arg(r) lys；gln；asn lys asn(n) gln；his；lys；arg gln asp(d) glu glu cys(c) ser ser gln(q) asn asn glu(e) asp asp gly(g) pro；ala ala his(h) asn；gln；lys；arg arg ile(i) leu；val；met；ala；phe leu leu(l) ile；val；met；ala；phe ile lys(k) arg；gln；asn arg met(m) leu；phe；ile leu phe(f) leu；val；ile；ala；tyr leu pro(p) ala ala ser(s) thr thr thr(t) ser ser trp(w) tyr；phe tyr tyr(y) trp；phe；thr；ser phe val(v) ile；leu；met；phe；ala leu 36、本領(lǐng)域熟知，可以從蛋白質(zhì)的n和/或c末端改變(置換、刪除、截短或插入)一或多個(gè)氨基酸殘基而仍保留其功能活性。因此，從cas蛋白的n和/或c末端改變了一或多個(gè)氨基酸殘基、同時(shí)保留了其所需功能活性的蛋白，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些改變可以包括通過(guò)現(xiàn)代分子方法例如pcr而引入的改變，所述方法包括借助于在pcr擴(kuò)增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸編碼序列而改變或延長(zhǎng)蛋白質(zhì)編碼序列的pcr擴(kuò)增。37、應(yīng)認(rèn)識(shí)到，蛋白質(zhì)可以以各種方式進(jìn)行改變，包括氨基酸置換、刪除、截短和插入，用于此類(lèi)操作的方法是本領(lǐng)域通常已知的。例如，可以通過(guò)對(duì)dna的突變來(lái)制備上述蛋白的氨基酸序列變體。還可以通過(guò)其他誘變形式和/或通過(guò)定向進(jìn)化來(lái)完成，例如，使用已知的誘變、重組和/或改組(shuffling)方法，結(jié)合相關(guān)的篩選方法，來(lái)進(jìn)行單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失和/或插入。38、領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，本發(fā)明cas蛋白中的這些微小氨基酸變化可以出現(xiàn)(例如天然存在的突變)或者產(chǎn)生(例如使用r-dna技術(shù))而不損失蛋白質(zhì)功能或活性。如果這些突變出現(xiàn)在蛋白的催化結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)或其它功能結(jié)構(gòu)域中，則多肽的性質(zhì)可改變，但多肽可保持其活性。如果存在的突變不接近催化結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)或其它功能結(jié)構(gòu)域中，則可預(yù)期較小影響。39、本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如定位誘變或蛋白進(jìn)化或生物信息系的分析，來(lái)鑒定本發(fā)明cas突變蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化結(jié)構(gòu)域、活性位點(diǎn)或其它功能結(jié)構(gòu)域也能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)的物理分析而確定，如通過(guò)以下這些技術(shù)：如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記，結(jié)合推定的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸的突變來(lái)確定。40、本發(fā)明中，氨基酸殘基可以用單字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(ala，a)，纈氨酸(val，v)，甘氨酸(gly，g)，亮氨酸(leu，l)，谷酰胺酸(gln，q)，苯丙氨酸(phe，f)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，天冬氨酸(asp，d)，天冬酰胺(asn，n)，谷氨酸(glu，e)，賴(lài)氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，絲氨酸(ser，s)，蘇氨酸(thr，t)，半胱氨酸(cys，c)，脯氨酸(pro，p)，異亮氨酸(ile，i)，組氨酸(his，h)，精氨酸(arg，r)。41、術(shù)語(yǔ)“axxb”表示第xx位的氨基酸a變?yōu)榘被醔，如無(wú)特別說(shuō)明，均是從n端起第xx位的氨基酸a變?yōu)榘被醔。例如，e100k表示第100位的e突變?yōu)閗。多個(gè)氨基酸位點(diǎn)同時(shí)存在突變時(shí)，可以采用e100k-s3r類(lèi)似的形式進(jìn)行表述，例如，e100k-s3r代表第100位e突變?yōu)閗同時(shí)第3位s突變?yōu)閞。42、本發(fā)明所述蛋白質(zhì)內(nèi)的特定氨基酸位置(編號(hào))是利用標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)工具通過(guò)將目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列與seq?id?no.1進(jìn)行比對(duì)而確定的，譬如用smith-waterman運(yùn)算法則或用clustalw2運(yùn)算法則比對(duì)兩個(gè)序列，其中當(dāng)比對(duì)得分最高時(shí)認(rèn)為所述序列是對(duì)準(zhǔn)的。比對(duì)得分可依照wilbur,w.j.and?lipman,d.j.(1983)rapid?similarity?searchesofnucleic?acid?and?protein?data?banks.proc.natl.acad.sci.usa,80:726-730中所述的方法進(jìn)行計(jì)算。在clustalw2(1.82)運(yùn)算法則中優(yōu)選使用默認(rèn)參數(shù)：蛋白質(zhì)缺口開(kāi)放罰分＝10.0；蛋白質(zhì)缺口延伸罰分＝0.2；蛋白質(zhì)矩陣＝gonnet；蛋白質(zhì)/dna端隙＝-1；蛋白質(zhì)/dnagapdist＝4。優(yōu)選采用alignx程序(vectornti組中的一部分)，以適于多重比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)(缺口開(kāi)放罰分:10og缺口延伸罰分0.05)通過(guò)將蛋白質(zhì)的氨基酸序列與seq?idno.1進(jìn)行比來(lái)確定本發(fā)明所述蛋白質(zhì)內(nèi)特定氨基酸的位置。43、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas突變蛋白選自以下i-iii任意一組：44、i、由seq?id?no.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)處產(chǎn)生突變得到的cas突變蛋白：第3位、第4位、第99位、第154位、第228位、第231位、第400位、第411位、第647位、第649位或第658位；45、ii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的cas突變蛋白；46、iii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加的序列；所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包括1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)，6個(gè)，7個(gè)，8個(gè)，9個(gè)或10個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加。47、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas突變蛋白選自以下i-iii任意一組：48、i、由seq?id?no.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)處產(chǎn)生突變得到的cas突變蛋白：第3位、第4位、第99位、第154位、第228位、第231位、第400位、第411位、第647位、第649位或第658位；并且，所述cas突變蛋白還在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列的第100位、第763位或第43位氨基酸的任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在突變；49、ii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的cas突變蛋白；50、iii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加的序列；所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包括1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)，6個(gè)，7個(gè)，8個(gè)，9個(gè)或10個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加。51、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas突變蛋白選自以下i-iii任意一組：52、i、由seq?id?no.1所示氨基酸序列在包含以下任一或任意幾個(gè)氨基酸位點(diǎn)處產(chǎn)生突變得到的cas突變蛋白：第3位、第4位、第99位、第154位、第228位、第231位、第400位、第411位、第647位、第649位或第658位；并且，所述cas突變蛋白在對(duì)應(yīng)于seq?id?no.1所示氨基酸序列的第100位氨基酸位點(diǎn)為k；53、ii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的cas突變蛋白；54、iii、與i所述的cas突變蛋白相比，具有i中所述的突變位點(diǎn)；并且，與i所述的cas突變蛋白相比，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加的序列；所述一個(gè)或多個(gè)氨基酸包括1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)，5個(gè)，6個(gè)，7個(gè)，8個(gè)，9個(gè)或10個(gè)氨基酸的置換、缺失或添加。所述cas蛋白的生物學(xué)功能包括但不限于，與指導(dǎo)rna結(jié)合的活性、核酸內(nèi)切酶活性、在指導(dǎo)rna引導(dǎo)下與靶序列特定位點(diǎn)結(jié)合并切割的活性，包括但不限于cis切割活性和trans切割活性。55、本發(fā)明中，“cas突變蛋白”也可以稱(chēng)之為突變的cas蛋白，或者cas蛋白變體。56、本發(fā)明還提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括如上所述的cas突變蛋白和其他的修飾部分。57、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾部分選自另外的蛋白或多肽、可檢測(cè)的標(biāo)記或其任意組合。58、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾部分選自表位標(biāo)簽、報(bào)告基因序列、核定位信號(hào)(nls)序列、靶向部分、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(例如，vp64)、轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域(例如，krab結(jié)構(gòu)域或sid結(jié)構(gòu)域)、核酸酶結(jié)構(gòu)域(例如，fok1)，以及具有選自下列的活性的結(jié)構(gòu)域：核苷酸脫氨酶，腺苷脫氨酶，胞苷脫氨酶，甲基化酶活性,去甲基化酶,轉(zhuǎn)錄激活活性,轉(zhuǎn)錄抑制活性,轉(zhuǎn)錄釋放因子活性,組蛋白修飾活性,核酸酶活性,單鏈rna切割活性,雙鏈rna切割活性,單鏈dna切割活性,雙鏈dna切割活性和核酸結(jié)合活性；以及其任意組合。所述nls序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其實(shí)例包括但不限于所述，sv40大t抗原，egl-13，c-myc以及tus蛋白。59、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述nls序列位于、靠近或接近本發(fā)明的cas蛋白的末端(例如，n端、c端或兩端)。60、所述表位標(biāo)簽(epitope?tag)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于his、v5、flag、ha、myc、vsv-g、trx等，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇其他合適的表位標(biāo)簽(例如，純化、檢測(cè)或示蹤)。61、所述報(bào)告基因序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，其實(shí)例包括但不限于gst、hrp、cat、gfp、hcred、dsred、cfp、yfp、bfp等。62、在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含能夠與dna分子或細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，例如麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)、lex?a的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dbd)、gal4的dbd等。63、在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含可檢測(cè)的標(biāo)記，例如熒光染料，例如fitc或dapi。64、在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的cas蛋白任選地通過(guò)接頭與所述修飾部分偶聯(lián)、綴合或融合。65、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾部分直接連接至本發(fā)明的cas蛋白的n端或c端。66、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾部分通過(guò)接頭連接至本發(fā)明的cas蛋白的n端或c端。這類(lèi)接頭是本領(lǐng)域熟知的，其實(shí)例包括但不限于包含一個(gè)或多個(gè)(例如，1個(gè)，2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)或5個(gè))氨基酸(如，glu或ser)或氨基酸衍生物(如，ahx、β-ala、gaba或ava)的接頭，或peg等。67、本發(fā)明的cas蛋白、蛋白衍生物或融合蛋白不受其產(chǎn)生方式的限定，例如，其可以通過(guò)基因工程方法(重組技術(shù))產(chǎn)生，也可以通過(guò)化學(xué)合成方法產(chǎn)生。68、cas蛋白的核酸69、另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其包含：70、(a)編碼本發(fā)明的cas突變蛋白或融合蛋白的多核苷酸序列；71、或者，與(a)所述的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。72、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的核苷酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。73、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞。74、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。75、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，例如栽培植物(如木薯、玉米、高粱、小麥或水稻)、藻類(lèi)、樹(shù)或蔬菜具有的細(xì)胞。76、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的多核苷酸優(yōu)選是單鏈的或雙鏈的。77、指導(dǎo)rna(grna)78、另一方面，本發(fā)明提供了一種grna，所述grna包括第一區(qū)段和第二區(qū)段；所述第一區(qū)段又稱(chēng)為“骨架區(qū)”、“蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)段”、“蛋白質(zhì)結(jié)合序列”、或者“同向重復(fù)(directrepeat)序列”；所述第二區(qū)段又稱(chēng)為“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向區(qū)段”，或者“靶向靶序列的引導(dǎo)序列”。79、所述grna的第一區(qū)段能夠與本發(fā)明的cas蛋白相互作用，從而使cas蛋白和grna形成復(fù)合物。80、在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述第一區(qū)段為如上所述的同向重復(fù)序列。81、本發(fā)明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向區(qū)段包含與靶核酸中的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。換言之，本發(fā)明靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向區(qū)段經(jīng)過(guò)雜交(即，堿基配對(duì))以序列特異性方式與靶核酸相互作用。因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向區(qū)段可改變，或可被修飾以雜交靶核酸內(nèi)的任何希望的序列。所述核酸選自dna或rna。82、靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向區(qū)段與靶核酸的靶序列之間的互補(bǔ)百分比可為至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。83、本發(fā)明grna的“骨架區(qū)”、“蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū)段”、“蛋白質(zhì)結(jié)合序列”、或者“同向重復(fù)序列”可以與crispr蛋白(或者，cas蛋白)相互作用。本發(fā)明grna經(jīng)過(guò)靶向核酸的靶向序列的作用將其相互作用的cas蛋白引導(dǎo)至靶核酸內(nèi)的特異性核苷酸序列。84、優(yōu)選的，所述指導(dǎo)rna從5’至3’方向包含第一區(qū)段和第二區(qū)段。85、本發(fā)明中，所述第二區(qū)段還可以理解為與靶序列雜交的引導(dǎo)序列。86、本發(fā)明的grna能夠與所述cas蛋白形成復(fù)合物。87、載體88、本發(fā)明還提供了一種載體，其包含如上述的cas突變蛋白、分離的核酸分子或多核苷酸；優(yōu)選的，其還包括與之可操作連接的調(diào)控元件。89、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的調(diào)控元件選自下組中的一種或多種：增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)座子、啟動(dòng)子、終止子、前導(dǎo)序列、多腺苷酸序列、標(biāo)記基因。90、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、整合載體。91、在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)中包括的載體是病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)載體和單純皰疹載體)，還可以是質(zhì)粒、病毒、粘粒、噬菌體等類(lèi)型，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。92、crispr系統(tǒng)93、本發(fā)明提供了一種工程化的非天然存在的載體系統(tǒng)，或者是crispr-cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括cas突變蛋白或編碼所述cas突變蛋白的核酸序列以及編碼一種或多種指導(dǎo)rna的核酸。94、在一種實(shí)施方式中，所述編碼所述cas突變蛋白的核酸序列和編碼一種或多種指導(dǎo)rna的核酸是人工合成的。95、在一種實(shí)施方式中，所述編碼所述cas突變蛋白的核酸序列和編碼一種或多種指導(dǎo)rna的核酸并不共同天然存在。96、該一種或多種指導(dǎo)rna在細(xì)胞中靶向一個(gè)或多個(gè)靶序列。所述一個(gè)或多個(gè)靶序列與編碼一種或多種基因產(chǎn)物的dna分子的基因組座位雜交，并且引導(dǎo)該cas蛋白到達(dá)所述一種或多種基因產(chǎn)物的dna分子的基因組座位部位，cas蛋白到達(dá)靶序列位置后對(duì)靶序列進(jìn)行修飾、編輯或切割，由此該一種或多種基因產(chǎn)物的表達(dá)被改變或修飾。97、本發(fā)明的細(xì)胞包括動(dòng)物、植物或微生物中的一種或多種。98、在一些實(shí)施例中，該cas蛋白是密碼子優(yōu)化的，用于在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。99、在一些實(shí)施例中，該cas蛋白指導(dǎo)切割在該靶序列位置處的一條或兩條鏈。100、本發(fā)明還提供了一種工程化的非天然存在的載體系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)可以包括一種或多種載體，該一種或多種載體包括：101、a)第一調(diào)控元件，該第一調(diào)控元件可操作地與grna連接，102、b)第二調(diào)控元件，該第二調(diào)控元件可操作地與所述cas蛋白連接；103、其中組分(a)和(b)位于該系統(tǒng)的相同或不同載體上。104、所述第一和第二調(diào)控元件包括啟動(dòng)子(例如，組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、增強(qiáng)子(例如35s?promoter或35s?enhanced?promoter)、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)、和其他表達(dá)控制元件(例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，如多聚腺苷酸化信號(hào)和多聚u序列)。105、在一些實(shí)施方案中，所述系統(tǒng)中的載體是病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體，腺病毒載體，腺相關(guān)載體和單純皰疹載體)，還可以是質(zhì)粒、病毒、粘粒、噬菌體等類(lèi)型，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。106、在一些實(shí)施例中，本文提供的系統(tǒng)處于遞送系統(tǒng)中。在一些實(shí)施方案中，遞送系統(tǒng)是納米顆粒，脂質(zhì)體，外體，微泡和基因槍。107、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶序列是來(lái)自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的dna或rna序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶序列是非天然存在的dna或rna序列。108、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶序列存在于細(xì)胞內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶序列存在于細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)(例如，細(xì)胞器)內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。109、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述cas蛋白連接有一個(gè)或多個(gè)nls序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)nls序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述nls序列連接至所述蛋白的n端或c端。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述nls序列融合至所述蛋白的n端或c端。110、另一方面，本發(fā)明涉及一種工程化的crispr系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含上述cas蛋白以及一種或多種指導(dǎo)rna，其中，所述指導(dǎo)rna包括同向重復(fù)序列和能夠與靶核酸雜交的間隔序列，所述cas蛋白能夠結(jié)合所述指導(dǎo)rna并靶向與間隔序列互補(bǔ)的靶核酸序列。111、蛋白-核酸復(fù)合物/組合物112、另一方面，本發(fā)明提供了一種復(fù)合物或者組合物，其包含：113、(i)蛋白組分，其選自：上述cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意組合；和114、(ii)核酸組分，其包含(a)能夠與靶序列雜交的引導(dǎo)序列；以及(b)能夠與本發(fā)明的cas蛋白結(jié)合的同向重復(fù)序列。115、所述蛋白組分與核酸組分相互結(jié)合形成復(fù)合物。116、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核酸組分是crispr-cas系統(tǒng)中的指導(dǎo)rna。117、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述復(fù)合物或組合物是非天然存在的或經(jīng)修飾的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述復(fù)合物或組合物中的至少一個(gè)組分是非天然存在的或經(jīng)修飾的。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一組分是非天然存在的或經(jīng)修飾的；和/或，所述第二組分是非天然存在的或經(jīng)修飾的。118、活化的crispr復(fù)合物119、另一方面，本發(fā)明還提供了一種活化的crispr復(fù)合物，所述活化的crispr復(fù)合物包含：(1)蛋白組分，其選自：本發(fā)明的cas蛋白、衍生化蛋白或融合蛋白，及其任意組合；(2)grna，其包含(a)能夠與靶序列雜交的引導(dǎo)序列；以及(b)能夠與本發(fā)明的cas蛋白結(jié)合的同向重復(fù)序列；以及(3)結(jié)合在grna上的靶序列。優(yōu)選的，所述結(jié)合為通過(guò)grna上的靶向核酸的靶向序列與靶核酸進(jìn)行的結(jié)合。120、本文所用術(shù)語(yǔ)“活化的crispr復(fù)合物”，“活化復(fù)合物”或“三元復(fù)合物”是指crispr系統(tǒng)中cas蛋白、grna與靶核酸結(jié)合或修飾后的復(fù)合物。121、本發(fā)明的cas蛋白和grna可以形成二元復(fù)合物，該二元復(fù)合物在與核酸底物結(jié)合時(shí)被活化，形成活化的crispr復(fù)合物該核酸底物與grna中的間隔序列(或者稱(chēng)之為，與靶核酸雜交的引導(dǎo)序列)互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，grna的間隔序列與靶底物完全匹配。在其它實(shí)施方案中，grna的間隔序列與靶底物的部分(連續(xù)或不連續(xù))匹配。122、在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述活化的crispr復(fù)合物可以表現(xiàn)出側(cè)枝核酸酶切活性，所述側(cè)枝核酸酶切活性是指活化的crispr復(fù)合物表現(xiàn)的對(duì)單鏈核酸的非特異切割活性或亂切活性，在本領(lǐng)域又稱(chēng)之為trans切割活性。123、遞送及遞送組合物124、本發(fā)明的cas蛋白、grna、融合蛋白、核酸分子、載體、系統(tǒng)、復(fù)合物和組合物，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行遞送。此類(lèi)方法包括但不限于，電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、顯微注射、聲孔效應(yīng)、基因槍、磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、樹(shù)枝狀轉(zhuǎn)染、熱激轉(zhuǎn)染、核轉(zhuǎn)染、磁轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、穿刺轉(zhuǎn)染、光學(xué)轉(zhuǎn)染、試劑增強(qiáng)性核酸攝取、以及經(jīng)由脂質(zhì)體、免疫脂質(zhì)體、病毒顆粒、人工病毒體等的遞送。125、因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種遞送組合物，其包含遞送載體，以及選自下列的一種或任意幾種：本發(fā)明的cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、載體、系統(tǒng)、復(fù)合物和組合物。126、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述遞送載體是粒子。127、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述遞送載體選自脂質(zhì)顆粒、糖顆粒、金屬顆粒、蛋白顆粒、脂質(zhì)體、外泌體、微泡、基因槍或病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒)。128、宿主細(xì)胞129、本發(fā)明還涉及一種體外的、離體的或體內(nèi)的細(xì)胞或細(xì)胞系或它們的子代，所述細(xì)胞或細(xì)胞系或它們的子代包含：本發(fā)明所述的cas蛋白、融合蛋白、核酸分子、蛋白-核酸復(fù)合物、活化的crispr復(fù)合物、載體、本發(fā)明遞送組合物。130、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。131、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、羊、豬、犬、猴、兔、嚙齒類(lèi)(如大鼠或小鼠)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是非哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞，例如家禽鳥(niǎo)類(lèi)(如雞)、魚(yú)類(lèi)或甲殼動(dòng)物(如蛤蜊、蝦)的細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，例如單子葉植物或雙子葉植物具有的細(xì)胞或栽培植物或糧食作物如木薯、玉米、高粱、大豆、小麥、燕麥或水稻具有的細(xì)胞，例如藻類(lèi)、樹(shù)或生產(chǎn)植物、果實(shí)或蔬菜(例如，樹(shù)類(lèi)如柑橘樹(shù)、堅(jiān)果樹(shù)；茄屬植物、棉花、煙草、番茄、葡萄、咖啡、可可等)。132、在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是干細(xì)胞或干細(xì)胞系。133、在某些情況下，本發(fā)明的宿主細(xì)胞包含基因或基因組的修飾，該修飾是在其野生型中不存在的修飾。134、基因編輯方法和應(yīng)用135、本發(fā)明的cas突變蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物或者上述宿主細(xì)胞可用于以下任一或任意幾個(gè)用途：靶向和/或編輯靶核酸；切割雙鏈dna、單鏈dna或單鏈rna；非特異性切割和/或降解側(cè)枝核酸；非特異性切割單鏈核酸；核酸檢測(cè)；檢測(cè)目標(biāo)樣品中的核酸；特異性地編輯雙鏈核酸；堿基編輯雙鏈核酸；堿基編輯單鏈核酸。在其他的實(shí)施方式中，還可以用于制備用于上述任一或任意幾個(gè)用途的試劑或試劑盒。136、本發(fā)明還提供了上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物在基因編輯、基因靶向或基因切割中的應(yīng)用；或者，在制備用于基因編輯、基因靶向或基因切割的試劑或試劑盒中的用途。137、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述基因編輯、基因靶向或基因切割為在細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外進(jìn)行基因編輯、基因靶向或基因切割。138、本發(fā)明還提供了一種編輯靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸的方法，所述方法包括將靶核酸與上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物進(jìn)行接觸。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法為在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外編輯靶核酸、靶向靶核酸或切割靶核酸。139、所述基因編輯或編輯靶核酸包括修飾基因、敲除基因、改變基因產(chǎn)物的表達(dá)、修復(fù)突變、和/或插入多核苷酸、基因突變。140、所述編輯可以在原核細(xì)胞和/或真核細(xì)胞中進(jìn)行編輯。141、另一方面，本發(fā)明還提供了上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物在核酸檢測(cè)中的應(yīng)用，或在制備用于核酸檢測(cè)的試劑或試劑盒中的用途。142、另一方面，本發(fā)明還提供了一種切割單鏈核酸的方法，所述方法包括，使核酸群體與上述cas蛋白和grna接觸，其中所述核酸群體包含靶核酸和多個(gè)非靶單鏈核酸，所述cas蛋白切割所述多個(gè)非靶單鏈核酸。143、所述grna能夠結(jié)合所述cas蛋白。144、所述grna能夠靶向所述靶核酸。145、所述接觸可以是在體外、離體或體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)部。146、優(yōu)選的，所述切割單鏈核酸為非特異性的切割。147、另一方面，本發(fā)明還提供了上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物在非特異性的切割單鏈核酸中的應(yīng)用，或在制備用于非特異性的切割單鏈核酸的試劑或試劑盒中的用途。148、另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于基因編輯、基因靶向或基因切割的試劑盒，所述試劑盒包括上述cas蛋白、grna、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物、上述活化的crispr復(fù)合物或上述宿主細(xì)胞。149、另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)樣品中的靶核酸的試劑盒，所述試劑盒包含：(a)cas蛋白，或編碼所述cas蛋白的核酸；(b)指導(dǎo)rna，或編碼所述指導(dǎo)rna的核酸，或包含所述指導(dǎo)rna的前體rna，或編碼所述前體rna的核酸；和(c)為單鏈的且不與所述指導(dǎo)rna雜交的單鏈核酸檢測(cè)器。150、本領(lǐng)域知曉，前體rna可被切割或加工成為上述成熟的指導(dǎo)rna。151、另一方面，發(fā)明提供了上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物、上述活化的crispr復(fù)合物或上述宿主細(xì)胞在制備制劑或試劑盒中的用途，所述制劑或試劑盒用于：152、(i)基因或基因組編輯；153、(ii)靶核酸檢測(cè)和/或診斷；154、(iii)編輯靶基因座中的靶序列來(lái)修飾生物或非人類(lèi)生物；155、(iv)疾病的治療；156、(iv)靶向靶基因。157、優(yōu)選的，上述基因或基因組編輯為在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外進(jìn)行基因或基因組編輯。158、優(yōu)選的，所述靶核酸檢測(cè)和/或診斷為在體外進(jìn)行靶核酸檢測(cè)和/或診斷。159、優(yōu)選的，所述疾病的治療為治療由靶基因座中的靶序列的缺陷引起的病癥。160、另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括將樣品與所述cas蛋白、grna(指導(dǎo)rna)和單鏈核酸檢測(cè)器接觸，所述grna包括與所述cas蛋白結(jié)合的區(qū)域和與靶核酸雜交的指導(dǎo)序列；檢測(cè)由所述cas蛋白切割單鏈核酸檢測(cè)器產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)，從而檢測(cè)靶核酸；所述單鏈核酸檢測(cè)器不與所述grna雜交。161、特異性修飾靶核酸的方法162、另一方面，本發(fā)明還提供了一種特異性修飾靶核酸的方法，方法包括：使靶核酸與上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物接觸。163、該特異性修飾可以發(fā)生在體內(nèi)或者體外。164、該特異性修飾可以發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)或者細(xì)胞外。165、在一些情況下，細(xì)胞選自原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，例如，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或微生物細(xì)胞。166、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾是指所述靶序列的斷裂，如，dna的單鏈/雙鏈斷裂，或者rna的單鏈斷裂。167、在一些情況下，所述方法還包括使靶核酸與供體多核苷酸接觸，其中將供體多核苷酸、供體多核苷酸的部分、供體多核苷酸的拷貝或供體多核苷酸的拷貝的部分整合到靶核酸中。168、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述修飾還包括將編輯模板(例如外源核酸)插入所述斷裂中。169、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述方法還包括：將編輯模板與所述靶核酸接觸，或者遞送至包含所述靶核酸的細(xì)胞中。在此實(shí)施方式中，所述方法通過(guò)與外源模板多核苷酸同源重組修復(fù)所述斷裂的靶基因；在一些實(shí)施方式中，所述修復(fù)導(dǎo)致一種突變，包括所述靶基因的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、缺失、或取代，在其他的實(shí)施方式中，所述突變導(dǎo)致在從包含該靶序列的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變。170、檢測(cè)(非特異切割)171、另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)樣品中靶核酸的方法，所述方法包括將樣品與上述cas蛋白、核酸、上述組合物、上述cirspr/cas系統(tǒng)、上述載體系統(tǒng)、上述遞送組合物或上述活化的crispr復(fù)合物和單鏈核酸檢測(cè)器接觸；檢測(cè)由所述cas蛋白切割單鏈核酸檢測(cè)器產(chǎn)生的可檢測(cè)信號(hào)，從而檢測(cè)靶核酸。172、本發(fā)明中，所述靶核酸包括核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸；包括單鏈核酸、雙鏈核酸，例如單鏈dna、雙鏈dna、單鏈rna、雙鏈rna。173、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶核酸來(lái)源于病毒、細(xì)菌、微生物、土壤、水源、人體、動(dòng)物、植物等樣品。優(yōu)選的，所述靶核酸為pcr、nasba、rpa、sda、lamp、had、near、mda、rca、lcr、ram等方法富集或擴(kuò)增的產(chǎn)物。174、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶核酸為病毒核酸、細(xì)菌核酸、與疾病相關(guān)的特異核酸，如特定的突變位點(diǎn)或snp位點(diǎn)或與對(duì)照有差異的核酸；優(yōu)選地，所述病毒為植物病毒或動(dòng)物病毒，例如，乳頭瘤病毒，肝dna病毒，皰疹病毒，腺病毒，痘病毒，細(xì)小病毒，冠狀病毒；優(yōu)選地，所述病毒為冠狀病毒，優(yōu)選地，sars、sars-cov2(covid-19)、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63、hcov-hku1、mers-cov。175、本發(fā)明中，所述grna與靶核酸上的靶序列至少有50％的匹配度，優(yōu)選至少60％，優(yōu)選至少70％，優(yōu)選至少80％，優(yōu)選至少90％。176、在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)所述的靶序列含有一個(gè)或多個(gè)特征位點(diǎn)(如特定的突變位點(diǎn)或snp)時(shí)，所述的特征位點(diǎn)與grna完全匹配。177、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述檢測(cè)方法中可以包含一種或多種導(dǎo)向序列互不相同的grna，其靶向不同的靶序列。178、本發(fā)明中，所述單鏈核酸檢測(cè)器包括但不限于單鏈dna、單鏈rna、dna-rna雜交體、核酸類(lèi)似物、堿基修飾物、以及含有無(wú)堿基間隔物的單鏈核酸檢測(cè)器等；“核酸類(lèi)似物”包括但不限于：鎖核酸、橋核酸、嗎啉核酸、乙二醇核酸、己糖醇核酸、蘇糖核酸、阿拉伯糖核酸、2’氧甲基rna、2’甲氧基乙酰基rna、2’氟rna、2’氨基rna、4’硫rna及其組合，包括任選的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸殘基。179、本發(fā)明中，所述可檢測(cè)信號(hào)通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：基于視覺(jué)的檢測(cè)，基于傳感器的檢測(cè)，顏色檢測(cè)，基于熒光信號(hào)的檢測(cè)，基于金納米顆粒的檢測(cè)，熒光偏振，膠體相變/分散，電化學(xué)檢測(cè)和基于半導(dǎo)體的檢測(cè)。180、本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述單鏈核酸檢測(cè)器的兩端分別設(shè)置熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，當(dāng)所述單鏈核酸檢測(cè)器被切割后，可以表現(xiàn)出可檢測(cè)的熒光信號(hào)。所述熒光基團(tuán)選自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas?red或lc?red460中的一種或任意幾種；所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一種或任意幾種。181、在其他的實(shí)施方式中，所述單鏈核酸檢測(cè)器的5’端和3’端分別設(shè)置不同的標(biāo)記分子，通過(guò)膠體金檢測(cè)的方式，檢測(cè)所述單鏈核酸檢測(cè)器被cas蛋白切割前和被cas蛋白切割后的膠體金測(cè)試結(jié)果；所述單鏈核酸檢測(cè)器被cas蛋白切割前和被cas蛋白切割后在膠體金的檢測(cè)線(xiàn)和質(zhì)控線(xiàn)上將表現(xiàn)出不同的顯色結(jié)果。182、在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)靶核酸的方法還可以包括將可檢測(cè)信號(hào)的電平與參考信號(hào)電平進(jìn)行比較，以及基于可檢測(cè)信號(hào)的電平確定樣品中靶核酸的量。183、在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)靶核酸的方法還可以包括在不同的通道上使用rna報(bào)告核酸和dna報(bào)告核酸(例如，熒光顏色)，并通過(guò)測(cè)量rna和dna報(bào)告分子的信號(hào)電平，以及通過(guò)測(cè)量rna和dna報(bào)告分子中靶核酸的量來(lái)確定可檢測(cè)信號(hào)的電平，基于組合(例如，使用最小或乘積)可檢測(cè)信號(hào)的電平來(lái)采樣。184、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶基因存在于細(xì)胞內(nèi)。185、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是原核細(xì)胞。186、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。187、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是動(dòng)物細(xì)胞。188、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。189、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞，例如栽培植物(如木薯、玉米、高粱、小麥或水稻)、藻類(lèi)、樹(shù)或蔬菜具有的細(xì)胞。190、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶基因存在于體外的核酸分子(例如，質(zhì)粒)中。191、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述靶基因存在于質(zhì)粒中。192、術(shù)語(yǔ)定義193、在本發(fā)明中，除非另有說(shuō)明，否則本文中使用的科學(xué)和技術(shù)名詞具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、化學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、基因組學(xué)和重組dna等操作步驟均為相應(yīng)領(lǐng)域內(nèi)廣泛使用的常規(guī)步驟。同時(shí)，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關(guān)術(shù)語(yǔ)的定義和解釋。194、本文中的核酸切割或切割核酸包括:由本文所述cas酶產(chǎn)生的靶核酸中的dna或rna斷裂(cis切割)、dna或rna在側(cè)枝核酸底物(單鏈核酸底物)中的斷裂(即非特異性或非靶向性，trans切割)。在一些實(shí)施方式中，所述切割是雙鏈dna斷裂。在一些實(shí)施方案中，切割是單鏈dna斷裂或單鏈rna斷裂。195、crispr系統(tǒng)196、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(crispr)-crispr-相關(guān)(cas)(crispr-cas)系統(tǒng)”或“crispr系統(tǒng)”可互換地使用并且具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義，其通常包含與crispr相關(guān)(“cas”)基因的表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其他元件，或者能夠指導(dǎo)所述cas基因活性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或其他元件。197、crispr/cas復(fù)合物198、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“crispr/cas復(fù)合物”是指，指導(dǎo)rna(guide?rna)或成熟crrna與cas蛋白結(jié)合所形成的復(fù)合體，其包含雜交到靶序列的引導(dǎo)序列上并且與cas蛋白結(jié)合的同向重復(fù)序列，該復(fù)合體能夠識(shí)別并切割能與該指導(dǎo)rna或成熟crrna雜交的多核苷酸。199、指導(dǎo)rna(guide?rna，grna)200、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“指導(dǎo)rna(guide?rna，grna)”、“成熟crrna”、“指導(dǎo)序列”可互換地使用并且具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。一般而言，指導(dǎo)rna可以包含同向重復(fù)序列(direct?repeat)和引導(dǎo)序列，或者基本上由或由同向重復(fù)序列和引導(dǎo)序列組成。201、在某些情況下，指導(dǎo)序列是與靶序列具有足夠互補(bǔ)性從而與所述靶序列雜交并引導(dǎo)crispr/cas復(fù)合物與所述靶序列的特異性結(jié)合的任何多核苷酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)最佳比對(duì)時(shí)，指導(dǎo)序列與其相應(yīng)靶序列之間的互補(bǔ)程度為至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％。確定最佳比對(duì)在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。例如，存在公開(kāi)和可商購(gòu)的比對(duì)算法和程序，諸如但不限于clustalw、matlab中的史密斯-沃特曼算法(smith-waterman)、bowtie、geneious、biopython以及seqman。202、靶序列203、“靶序列”是指被grna中的引導(dǎo)序列所靶向的多核苷酸，例如與該引導(dǎo)序列具有互補(bǔ)性的序列，其中靶序列與引導(dǎo)序列之間的雜交將促進(jìn)crispr/cas復(fù)合物(包括cas蛋白和grna)的形成。完全互補(bǔ)性不是必需的，只要存在足夠互補(bǔ)性以引起雜交并且促進(jìn)一種crispr/cas復(fù)合物的形成即可。204、靶序列可以包含任何多核苷酸，如dna或rna。在某些情況下，所述靶序列位于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外。在某些情況下，所述靶序列位于細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中。在某些情況下，該靶序列可位于真核細(xì)胞的一個(gè)細(xì)胞器例如線(xiàn)粒體或葉綠體內(nèi)?？杀挥糜谥亟M到包含該靶序列的靶基因座中的序列或模板被稱(chēng)為“編輯模板”或“編輯多核苷酸”或“編輯序列”。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述編輯模板為外源核酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，該重組是同源重組。205、在本發(fā)明中，“靶序列”或“靶多核苷酸”或“靶核酸”可以是對(duì)細(xì)胞(例如，真核細(xì)胞)而言任何內(nèi)源或外源的多核苷酸。例如，該靶多核苷酸可以是一種存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞核中的多核苷酸。該靶多核苷酸可以是一個(gè)編碼基因產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的序列或一個(gè)非編碼序列(例如，調(diào)節(jié)多核苷酸或無(wú)用dna)。在某些情況下，該靶序列應(yīng)該與原間隔序列臨近基序(pam)相關(guān)。206、單鏈核酸檢測(cè)器207、本發(fā)明所述的單鏈核酸檢測(cè)器是指含有2-200個(gè)核苷酸的序列，優(yōu)選，具有2-150個(gè)核苷酸，優(yōu)選，3-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選，3-30個(gè)核苷酸，優(yōu)選，4-20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選，5-15個(gè)核苷酸。優(yōu)選為單鏈dna分子、單鏈rna分子或單鏈dna-rna雜交體。208、所述的單鏈核酸檢測(cè)器兩端包括不同的報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記分子，當(dāng)其處于初始狀態(tài)(即未被切割狀態(tài)時(shí))不呈現(xiàn)報(bào)告信號(hào)，當(dāng)該單鏈核酸檢測(cè)器被切割后，呈現(xiàn)出可檢測(cè)的信號(hào)，即切割后與切割前表現(xiàn)出可檢測(cè)的區(qū)別。209、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的報(bào)告基團(tuán)或標(biāo)記分子包括熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，所述熒光基團(tuán)選自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas?red或lc?red460中的一種或任意幾種；所述淬滅基團(tuán)選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一種或任意幾種。210、在一個(gè)實(shí)施方式中，所述的單鏈核酸檢測(cè)器具有連接至5’端第一分子(如fam或fitc)和連接至3’端的第二分子(如生物素)。所述的含有單鏈核酸檢測(cè)器的反應(yīng)體系與流動(dòng)條配合用以檢測(cè)靶核酸(優(yōu)選，膠體金檢測(cè)方式)。所述的流動(dòng)條被設(shè)計(jì)為具有兩條捕獲線(xiàn)，在樣品接觸端(膠體金)設(shè)有結(jié)合第一分子的抗體(即第一分子抗體)，在第一線(xiàn)(control?line)處含有結(jié)合第一分子抗體的抗體，在第二線(xiàn)(test?line)處含有與第二分子結(jié)合的第二分子的抗體(即第二分子抗體，如親和素)。當(dāng)反應(yīng)沿著條帶流動(dòng)時(shí)，第一分子抗體與第一分子結(jié)合攜帶切割或未切割的寡核苷酸至捕獲線(xiàn)，切割的報(bào)告子將在第一個(gè)捕獲線(xiàn)處結(jié)合第一分子抗體的抗體，而未切割的報(bào)告子將在第二捕獲線(xiàn)處結(jié)合第二分子抗體。報(bào)告基團(tuán)在各條線(xiàn)的結(jié)合將導(dǎo)致強(qiáng)讀出/信號(hào)(例如顏色)。隨著更多的報(bào)告子被切割，更多的信號(hào)將在第一捕獲線(xiàn)處累積，并且在第二線(xiàn)處將出現(xiàn)更少的信號(hào)。在某些方面，本發(fā)明涉及如本文所述的流動(dòng)條用于檢測(cè)核酸的用途。在某些方面，本發(fā)明涉及用本文定義的流動(dòng)條檢測(cè)核酸的方法，例如(側(cè))流測(cè)試或(側(cè))流免疫色譜測(cè)定。在某些方面，所述單鏈核酸檢測(cè)器中的分子可相互替換，或改變分子的位置，只要其報(bào)告原理與本發(fā)明相同或相近，所改進(jìn)的方式也均包含在本發(fā)明中。211、本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，可用于待檢測(cè)靶核酸的定量檢測(cè)。所述的定量檢測(cè)指標(biāo)可以根據(jù)報(bào)告基團(tuán)的信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)行定量，如根據(jù)熒光基團(tuán)的發(fā)光強(qiáng)度，或根據(jù)顯色條帶的寬度等。212、野生型213、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“野生型”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義，其表示生物、菌株、基因的典型形式或者當(dāng)它在自然界存在時(shí)區(qū)別于突變體或變體形式的特征，其可從自然中的來(lái)源分離并且沒(méi)有被人為有意地修飾。214、衍生化215、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“衍生化”是指，對(duì)氨基酸、多肽或蛋白的化學(xué)修飾，其中一個(gè)或多個(gè)取代基已與所述氨基酸、多肽或蛋白共價(jià)連接。取代基也可稱(chēng)為側(cè)鏈。216、衍生化的蛋白是該蛋白的衍生物，通常，蛋白的衍生化不會(huì)不利影響該蛋白的期望活性(例如，與指導(dǎo)rna結(jié)合的活性、核酸內(nèi)切酶活性、在指導(dǎo)rna引導(dǎo)下與靶序列特定位點(diǎn)結(jié)合并切割的活性)，也就是說(shuō)蛋白的衍生物與蛋白有相同的活性。217、衍生化蛋白218、又稱(chēng)“蛋白衍生物”，是指蛋白的經(jīng)修飾形式，例如其中所述蛋白的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可以被缺失、插入、修飾和/或取代。219、非天然存在的220、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“非天然存在的”或“工程化的”可互換地使用并且表示人工的參與。當(dāng)這些術(shù)語(yǔ)用于描述核酸分子或多肽時(shí)，其表示該核酸分子或多肽至少基本上從它們?cè)谧匀唤缰谢蛉绨l(fā)現(xiàn)于自然界中的與其結(jié)合的至少另一種組分游離出來(lái)。221、直系同源物(orthologue,ortholog)222、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“直系同源物(orthologue,ortholog)”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義。作為進(jìn)一步指導(dǎo)，如本文中所述的蛋白質(zhì)的“直系同源物”是指屬于不同物種的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)執(zhí)行與作為其直系同源物的蛋白相同或相似的功能。223、同一性224、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“同一性”用于指兩個(gè)多肽之間或兩個(gè)核酸之間序列的匹配情況。當(dāng)兩個(gè)進(jìn)行比較的序列中的某個(gè)位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞單元占據(jù)時(shí)(例如，兩個(gè)dna分子的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被腺嘌呤占據(jù)，或兩個(gè)多肽的每一個(gè)中的某個(gè)位置都被賴(lài)氨酸占據(jù))，那么各分子在該位置上是同一的。兩個(gè)序列之間的“百分?jǐn)?shù)同一性”是由這兩個(gè)序列共有的匹配位置數(shù)目除以進(jìn)行比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩個(gè)序列的10個(gè)位置中有6個(gè)匹配，那么這兩個(gè)序列具有60％的同一性。例如，dna序列ctgact和caggtt共有50％的同一性(總共6個(gè)位置中有3個(gè)位置匹配)。通常，在將兩個(gè)序列比對(duì)以產(chǎn)生最大同一性時(shí)進(jìn)行比較。這樣的比對(duì)可通過(guò)使用，例如，可通過(guò)計(jì)算機(jī)程序例如align程序(dnastar,inc.)方便地進(jìn)行的needleman等人(1970)j.mol.biol.48：443-453的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。還可使用已整合入align程序(版本2.0)的e.meyers和w.miller(comput.applbiosci.，4:11-17(1988))的算法，使用pam120權(quán)重殘基表(weight?residue?table)、12的缺口長(zhǎng)度罰分和4的缺口罰分來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。此外，可使用已整合入gcg軟件包(可在www.gcg.com上獲得)的gap程序中的needleman和wunsch(j?moibiol.48:444-453(1970))算法，使用blossum?62矩陣或pam250矩陣以及16、14、12、10、8、6或4的缺口權(quán)重(gap?weight)和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度權(quán)重來(lái)測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分?jǐn)?shù)同一性。225、載體226、術(shù)語(yǔ)“載體”是指一種核酸分子，它能夠運(yùn)送與其連接的另一種核酸分子。載體包括但不限于，單鏈、雙鏈、或部分雙鏈的核酸分子；包括一個(gè)或多個(gè)自由端、無(wú)自由端(例如環(huán)狀的)的核酸分子；包括dna、rna、或兩者的核酸分子；以及本領(lǐng)域已知的其他多種多樣的多核苷酸。載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)或者轉(zhuǎn)染導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使其攜帶的遺傳物質(zhì)元件在宿主細(xì)胞中獲得表達(dá)。一種載體可以被引入到宿主細(xì)胞中而由此產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、或肽，包括由如本文所述的蛋白、融合蛋白、分離的核酸分子等(例如，crispr轉(zhuǎn)錄物，如核酸轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、或酶)。一種載體可以含有多種控制表達(dá)的元件，包括但不限于，啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、選擇元件及報(bào)告基因。另外，載體還可含有復(fù)制起始位點(diǎn)。227、一種類(lèi)型的載體是“質(zhì)?！保涫侵钙渲锌梢岳缤ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)插入另外的dna片段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)。228、另一種類(lèi)型的載體是病毒載體，其中病毒衍生的dna或rna序列存在于用于包裝病毒(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒、復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、復(fù)制缺陷型腺病毒、以及腺相關(guān)病毒)的載體中。病毒載體還包含由用于轉(zhuǎn)染到一種宿主細(xì)胞中的病毒攜帶的多核苷酸。某些載體(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)能夠在它們被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制。229、其他載體(例如，非附加型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞后整合到該宿主細(xì)胞的基因組中，并且由此與該宿主基因組一起復(fù)制。而且，某些載體能夠指導(dǎo)它們可操作連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在此被稱(chēng)為“表達(dá)載體”。230、宿主細(xì)胞231、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”是指，可用于導(dǎo)入載體的細(xì)胞，其包括但不限于，如大腸桿菌或枯草菌等的原核細(xì)胞，如微生物細(xì)胞、真菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞的真核細(xì)胞。232、本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可取決于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所希望的表達(dá)水平等因素。233、調(diào)控元件234、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(ires)、和其他表達(dá)控制元件(例如轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，如多聚腺苷酸化信號(hào)和多聚u序列)，其詳細(xì)描述可參考戈德?tīng)?goeddel)，《基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法》(gene?expressiontechnology:methods?in?enzymology)185，學(xué)術(shù)出版社(academic?press)，圣地亞哥(sandiego)，加利福尼亞州(1990)。在某些情況下，調(diào)控元件包括指導(dǎo)一個(gè)核苷酸序列在許多類(lèi)型的宿主細(xì)胞中的組成型表達(dá)的那些序列以及指導(dǎo)該核苷酸序列只在某些宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些序列(例如，組織特異型調(diào)節(jié)序列)。組織特異型啟動(dòng)子可主要指導(dǎo)在感興趣的期望組織中的表達(dá)，所述組織例如肌肉、神經(jīng)元、骨、皮膚、血液、特定的器官(例如肝臟、胰腺)、或特殊的細(xì)胞類(lèi)型(例如淋巴細(xì)胞)。在某些情況下，調(diào)控元件還可以時(shí)序依賴(lài)性方式(如以細(xì)胞周期依賴(lài)性或發(fā)育階段依賴(lài)性方式)指導(dǎo)表達(dá)，該方式可以是或者可以不是組織或細(xì)胞類(lèi)型特異性的。在某些情況下，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控元件”涵蓋的是增強(qiáng)子元件，如wpre；cmv增強(qiáng)子；在htlv-i的ltr中的r-u5’片段((mol.cell.biol.，第8(1)卷，第466-472頁(yè)，1988)；sv40增強(qiáng)子；以及在兔β-珠蛋白的外顯子2與3之間的內(nèi)含子序列(proc.natl.acad.sci.usa.，第78(3)卷，第1527-31頁(yè)，1981)。235、啟動(dòng)子236、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的含義，其是指一段位于基因的上游能啟動(dòng)下游基因表達(dá)的非編碼核苷酸序列。組成型(constitutive)啟動(dòng)子是這樣的核苷酸序列：當(dāng)其與編碼或者限定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地相連時(shí)，在細(xì)胞的大多數(shù)或者所有生理?xiàng)l件下，其導(dǎo)致細(xì)胞中基因產(chǎn)物的產(chǎn)生。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是這樣的核苷酸序列，當(dāng)可操作地與編碼或者限定基因產(chǎn)物的多核苷酸相連時(shí)，基本上只有當(dāng)對(duì)應(yīng)于所述啟動(dòng)子的誘導(dǎo)物在細(xì)胞中存在時(shí)，其導(dǎo)致所述基因產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生。組織特異性啟動(dòng)子是這樣的核苷酸序列：當(dāng)可操作地與編碼或者限定基因產(chǎn)物的多核苷酸相連時(shí)，基本上只有當(dāng)細(xì)胞是該啟動(dòng)子對(duì)應(yīng)的組織類(lèi)型的細(xì)胞時(shí)，其才導(dǎo)致在細(xì)胞中產(chǎn)生基因產(chǎn)物。237、nls238、“核定位信號(hào)”或“核定位序列”(nls)是對(duì)蛋白質(zhì)“加標(biāo)簽”以通過(guò)核轉(zhuǎn)運(yùn)導(dǎo)入細(xì)胞核的氨基酸序列，即，具有nls的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核。典型地，nls包含暴露在蛋白質(zhì)表面的帶正電荷的lys或arg殘基。示例性核定位序列包括但不限于來(lái)自以下的nls：sv40大t抗原，egl-13，c-myc以及tus蛋白。在一些實(shí)施例中，該nls包含pkkkrkv序列。在一些實(shí)施例中，該nls包含avkrpaatkkagqakkkkld序列。在一些實(shí)施例中，該nls包含paakrvkld序列。在一些實(shí)施例中，該nls包含msrrrkanptklsenakklakeven序列。在一些實(shí)施例中，該nls包含klkikrpvk序列。其他核定位序列包括但不限于hnrnp?a1的酸性m9結(jié)構(gòu)域、酵母轉(zhuǎn)錄抑制子matα2中的序列kipik和py-nls。239、可操作地連接240、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”旨在表示感興趣的核苷酸序列以一種允許該核苷酸序列的表達(dá)的方式被連接至該一種或多種調(diào)控元件(例如，處于一種體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)該載體被引入到宿主細(xì)胞中時(shí)，處于該宿主細(xì)胞中)。241、互補(bǔ)性242、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)性”是指核酸與另一個(gè)核酸序列借助于傳統(tǒng)的沃森-克里克或其他非傳統(tǒng)類(lèi)型形成一個(gè)或多個(gè)氫鍵的能力?；パa(bǔ)百分比表示一個(gè)核酸分子中可與一個(gè)第二核酸序列形成氫鍵(例如，沃森-克里克堿基配對(duì))的殘基的百分比(例如，10個(gè)之中有5、6、7、8、9、10個(gè)即為50％、60％、70％、80％、90％、和100％互補(bǔ))?！巴耆パa(bǔ)”表示一個(gè)核酸序列的所有連續(xù)殘基與一個(gè)第二核酸序列中的相同數(shù)目的連續(xù)殘基形成氫鍵。如本文使用的“基本上互補(bǔ)”是指在一個(gè)具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸的區(qū)域上至少為60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、或100％的互補(bǔ)程度，或者是指在嚴(yán)格條件下雜交的兩個(gè)核酸。243、嚴(yán)格條件244、如本文中所使用的，對(duì)于雜交的“嚴(yán)格條件”是指與靶序列具有互補(bǔ)性的一個(gè)核酸主要地與該靶序列雜交并且基本上不雜交到非靶序列上的條件。嚴(yán)格條件通常是序列依賴(lài)性的，并且取決于許多因素而變化。一般而言，該序列越長(zhǎng)，則該序列特異性地雜交到其靶序列上的溫度就越高。245、雜交246、術(shù)語(yǔ)“雜交”或“互補(bǔ)的”或“基本上互補(bǔ)的”是指核酸(例如rna、dna)包含使其能夠非共價(jià)結(jié)合的核苷酸序列，即以序列特異性，反平行的方式(即核酸特異性結(jié)合互補(bǔ)核酸)與另一核酸形成堿基對(duì)和/或g/u堿基對(duì)，“退火”或“雜交”。247、雜交需要兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)序列，盡管堿基之間可能存在錯(cuò)配。兩個(gè)核酸之間雜交的合適條件取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度，這是本領(lǐng)域公知的變量。典型地，可雜交核酸的長(zhǎng)度為8個(gè)核苷酸或更多(例如，10個(gè)核苷酸或更多，12個(gè)核苷酸或更多，15個(gè)核苷酸或更多，20個(gè)核苷酸或更多，22個(gè)核苷酸或更多，25個(gè)核苷酸或更多，或30個(gè)核苷酸或更多)。248、應(yīng)當(dāng)理解，多核苷酸的序列不需要與其靶核酸的序列100％互補(bǔ)以特異性雜交。多核苷酸可包含60％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，99％或更高，99.5％或更高，或與其雜交的靶核酸序列中的靶區(qū)域的序列互補(bǔ)性為100％。249、靶序列與grna的雜交代表靶序列和grna的核酸序列至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的可以雜交，形成復(fù)合物；或者代表靶序列和grna的核酸序列至少有12個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)或更多個(gè)堿基可以互補(bǔ)配對(duì)，雜交形成復(fù)合物。250、表達(dá)251、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指，藉此從dna模板轉(zhuǎn)錄成多核苷酸(如轉(zhuǎn)錄成mrna或其他rna轉(zhuǎn)錄物)的過(guò)程和/或轉(zhuǎn)錄的mrna隨后藉此翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)錄物和編碼的多肽可以總稱(chēng)為“基因產(chǎn)物”。如果多核苷酸來(lái)源于基因組dna，表達(dá)可以包括真核細(xì)胞中mrna的剪接。252、接頭253、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“接頭”是指，由多個(gè)氨基酸殘基通過(guò)肽鍵連接形成的線(xiàn)性多肽。本發(fā)明的接頭可以為人工合成的氨基酸序列，或天然存在的多肽序列，例如具有鉸鏈區(qū)功能的多肽。此類(lèi)接頭多肽是本領(lǐng)域眾所周知的(參見(jiàn)例如，holliger,p.等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa?90:6444-6448；poljak,r.j.等人(1994)structure?2:1121-1123)。254、治療255、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“治療”是指，治療或治愈病癥，延緩病癥的癥狀的發(fā)作，和/或延緩病癥的發(fā)展。256、受試者257、如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“受試者”包括但不限于各種動(dòng)物、植物和微生物。258、動(dòng)物259、例如哺乳動(dòng)物，例如?？苿?dòng)物、馬科動(dòng)物、羊科動(dòng)物、豬科動(dòng)物、犬科動(dòng)物、貓科動(dòng)物、兔科動(dòng)物、嚙齒類(lèi)動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(例如，獼猴或食蟹猴)或人。在某些實(shí)施方式中，所述受試者(例如人)患有病癥(例如，疾病相關(guān)基因缺陷所導(dǎo)致的病癥)。260、植物261、術(shù)語(yǔ)“植物”應(yīng)理解為能夠進(jìn)行光合作用的任何分化的多細(xì)胞生物，在包括處于任何成熟或發(fā)育階段的作物植物，特別是單子葉或雙子葉植物，蔬菜作物，包括洋薊、球莖甘藍(lán)、芝麻菜、韭蔥、蘆筍、萵苣(例如，結(jié)球萵苣、葉萵苣、長(zhǎng)葉萵苣)、小白菜(bok?choy)、黃肉芋、瓜類(lèi)(例如，甜瓜、西瓜、克倫肖瓜(crenshaw)、白蘭瓜、羅馬甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘藍(lán)、卷心菜、花椰菜、西蘭花、羽衣甘藍(lán)、無(wú)頭甘藍(lán)、大白菜、小白菜)、刺菜薊、胡蘿卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋蔥、芹菜、歐芹、鷹嘴豆、歐洲防風(fēng)草、菊苣、胡椒、馬鈴薯、葫蘆(例如，西葫蘆、黃瓜、小西葫蘆、倭瓜、南瓜)、蘿卜、干球洋蔥、蕪菁甘藍(lán)、紫茄子(也稱(chēng)為茄子)、婆羅門(mén)參、苣菜、青蔥、苦苣、大蒜、菠菜、綠洋蔥、倭瓜、綠葉菜類(lèi)(greens)、甜菜(糖甜菜和飼料甜菜)、甘薯、唐萵苣、山葵、西紅柿、蕪菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如蘋(píng)果、杏、櫻桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、櫻桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、開(kāi)心果、胡桃、柑橘、藍(lán)莓、博伊增莓(boysenberry)、小紅莓、穗醋栗、羅甘莓、樹(shù)莓、草莓、黑莓、葡萄、鱷梨、香蕉、獼猴桃、柿子、石榴、菠蘿、熱帶水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三葉草、苜蓿、月見(jiàn)草、白芒花、玉米/玉蜀黍(飼料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、紅花、小粒谷類(lèi)作物(大麥、燕麥、黑麥、小麥等)、高粱、煙草、木棉、豆科植物(豆類(lèi)、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、橄欖、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、擬南芥屬、纖維植物(棉花、亞麻、黃麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一種植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡膠植物；和/或花壇植物，如開(kāi)花植物、仙人掌、肉質(zhì)植物和/或觀賞植物，以及樹(shù)如森林(闊葉樹(shù)和常綠樹(shù)，如針葉樹(shù))、果樹(shù)、觀賞樹(shù)、以及結(jié)堅(jiān)果的樹(shù)(nut-bearing?tree)、以及灌木和其他苗木。262、發(fā)明的有益效果263、本發(fā)明通過(guò)突變提高了cas12j19蛋白的活性，具有廣泛的應(yīng)用前景。264、下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，下列附圖和實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實(shí)施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將變得顯然。當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12