本發(fā)明涉及水稻基因檢測，尤其涉及一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法。

背景技術：

1、水稻是我國最重要的糧食作物之一，隨著人們生活水平的提高，人們對稻米品質的要求也越來越高。稻米的蒸煮食味品質主要包括直鏈淀粉含量，膠稠度和糊化溫度，其中糊化溫度的測定以堿消值法最可靠。堿消值高的稻米食味品質也較高。因此，開發(fā)快速檢測高堿消值功能位點的方法，并用于分子標記輔助選擇育種對水稻品質改良用重要的實際研究意義。

2、gao等水稻中alk基因是調控稻米堿消值的主效基因，一般在基因的第4327和4328位堿基都為t的單倍型下，其稻米的堿消值較高，達5.7-7.0。劉利平等對雜交水稻骨干親本材料的alk等位變異與蒸煮食味品質進行關聯(lián)分析，結果表明第8外顯子864/865(gc/tt)變異位點，也就是基因的第4327和4328位堿基變異位點與堿消值的關聯(lián)指數(shù)最大(應用與環(huán)境生物學報，2023)。王軍等利用基于hrm技術開發(fā)了alk基因的功能標記alkh5和alkh5，并對81份秈稻品種和279份粳稻品種進行了alk基因型檢測，結果發(fā)現(xiàn)了212份粳稻和62份秈稻含有g-tt基因型(中國水稻科學，2023)。

3、現(xiàn)有技術中一般利用hrm技術對alk基因的第4327和4328位堿基進行gc/tt基因分型，通過溶解曲線峰圖判斷基因型，但通過溶解曲線判斷tt和gc位點較為復雜，耗時間。

技術實現(xiàn)思路

1、1.要解決的技術問題

2、本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術中通過溶解曲線判斷tt和gc位點較為復雜，耗時間的問題，而提出的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法。

3、2.技術方案

4、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

5、一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，包括以下步驟：

6、步驟1：提取水稻植株的基因組dna；

7、步驟2：qrt-pcr擴增：將的2條引物alk-tt-f和alk-tt-r同時加入到反應體系中，并對的水稻植株中的alk基因功能位點處的215bp進行擴增；

8、步驟3：讀取ct值。

9、優(yōu)選地，所述步驟1中通過ctab提取法獲得水稻的基因組dna。

10、優(yōu)選地，所述步驟2中水稻堿消值調控基因alk的qrt-pcr的引物如下：alk-tt-f：aaccagctctacgccat，alk-tt-r：ccgcgcacctggtaa。

11、優(yōu)選地，所述步驟2中pcr反應程序為：1)預變性：95℃，1min；2)39個循環(huán)反應：95℃，20sec；60℃，30sec。

12、優(yōu)選地，所述步驟2中qrt-pcr反應體系為25μl：12.5μl2×sybr?green?mastermix，0.3μl?10mm?alk-tt-f引物，0.3μl?10mm?alk-tt-r引物，5μl模板dna，6.9μl?ddh2o。

13、優(yōu)選地，所述步驟3中如果ct值小于30，則為高堿消值功能位點；如果ct值大于33，則為低堿消值功能位點。

14、3.有益效果

15、相比于現(xiàn)有技術，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

16、本發(fā)明中，基于quantitative?real?time?pcr(qrt-pcr)技術，及alk基因序列第4327和4328位堿基變異位點，設計僅能擴增alk高堿消值功能位點的引物(由2條引物構成alk-tt-f：aaccagctctacgccat，alk-tt-r：ccgcgcacctggtaa)，通過qrt-pcr，直接讀取ct值，獲得包含水稻高堿消值的基因型數(shù)據(jù)，用于篩選較高蒸煮品質的水稻品種。

技術特征：

1.一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，所述步驟1中通過ctab提取法獲得水稻的基因組dna。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，所述步驟2中水稻堿消值調控基因alk的qrt-pcr的引物如下：alk-tt-f：aaccagctctacgccat，alk-tt-r：ccgcgcacctggtaa。

4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，所述步驟2中pcr反應程序為：1)預變性：95℃，1min；2)39個循環(huán)反應：95℃，20sec；60℃，30sec。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，所述步驟2中qrt-pcr反應體系為25μl：12.5μl?2×sybr?green?mastermix，0.3μl?10mm?alk-tt-f引物，0.3μl?10mm?alk-tt-r引物，5μl模板dna，6.9μl?ddh2o。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種基于qrt-pcr技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，其特征在于，所述步驟3中如果ct值小于30，則為高堿消值功能位點；如果ct值大于33，則為低堿消值功能位點。

技術總結
本發(fā)明公開了一種基于qRT?PCR技術快速檢測水稻高堿消值功能位點的方法，包括以下步驟：步驟1：提取水稻植株的基因組DNA；步驟2：qRT?PCR擴增：將的2條引物ALK?TT?F和ALK?TT?R同時加入到反應體系中，并對的水稻植株中的ALK基因功能位點處的215bp進行擴增；步驟3：讀取Ct值。本發(fā)明基于Quantitative?Real?Time?PCR(qRT?PCR)技術，及ALK基因序列第4327和4328位堿基變異位點，設計僅能擴增ALK高堿消值功能位點的引物(由2條引物構成ALK?TT?F：AACCAGCTCTACGCCAT，ALK?TT?R：CCGCGCACCTGGTAA)，通過qRT?PCR，直接讀取Ct值，獲得包含水稻高堿消值的基因型數(shù)據(jù)，用于篩選較高蒸煮品質的水稻品種。

技術研發(fā)人員：鄧國富,戴高興,卿冬進,陳韋韋,周維永,李經成,伍豪,潘英華,黃娟,彭德
受保護的技術使用者：廣西壯族自治區(qū)農業(yè)科學院
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/23