本發(fā)明屬于細胞免疫治療，具體涉及靶向cll1的雙表位car、雙表位car-t細胞及其應用。

背景技術：

1、急性髓細胞白血病(acute?myeloid?leukemia，aml)是一種髓系造血干/祖細胞惡性疾病，以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細胞異常增生為主要特征，臨床表現(xiàn)為貧血、出血、感染和發(fā)熱、臟器浸潤、代謝異常等，多數(shù)病例病情急重，預后兇險，如不及時治療?？晌＜吧?。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)，以cll1為靶點的免疫靶向療法治療aml的效果顯著。c型凝集素樣分子1(c-type?lectin-like?molecule?1，cll1)也稱為c型凝集素結構域家族12成員a(c-type?lectin?domain?family?12member?a，clec12a)，是一種ⅱ型跨膜糖蛋白，作為抑制性受體在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用。cll1存在于外周血和骨髓的髓系細胞以及大部分aml細胞中，同時表達于多數(shù)aml的cd34+cd38-干細胞上，正常人的cd34+cd38-干細胞則不表達。cll1因其特殊的表達模式成為aml治療和診斷的潛在靶點。此外，cll1還在骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic?syndromes，mds)和慢性髓細胞白血病(chronic?myeloidleukemia，cml，慢性粒細胞白血病)細胞上表達。

2、嵌合抗原受體t細胞(car-t細胞)療法是指通過基因修飾技術將帶有特異性抗原識別結構域及t細胞激活信號的遺傳物質轉入t細胞，使t細胞直接與腫瘤細胞表面的特異性抗原結合而被激活、增殖，從而發(fā)揮靶向殺傷腫瘤細胞的作用。隨著腫瘤免疫治療和臨床技術的發(fā)展，car-t免疫治療是目前最具發(fā)展前景的腫瘤免疫治療方法之一。通常，嵌合抗原受體(car)包含細胞外抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域。胞外抗原結合結構域可以包含靶向腫瘤抗原的單鏈可變片段(scfv)或單域抗體(sdab)。在與靶腫瘤抗原結合后，car可以激活t細胞以抗原依賴性方式產生特異性抗腫瘤反應，而不受靶腫瘤抗原的特定主要組織相容性復合物(mhc)的限制。單域抗體(sdab)只有單個單體抗體可變域。單域抗體因其分子量小，也被稱為納米抗體(nanobody，nb)，是迄今為止最小的具有抗原結合功能的抗體片段，其與抗原結合的能力及其穩(wěn)定性同完全抗體基本一致或具有更高的特異性抗原親和力。與傳統(tǒng)抗體相比，單域抗體還具有許多獨特的性質，比如穩(wěn)定性好、可抵達特殊抗原表位、可砌塊模式任意組合、生產成本低等。

3、目前，car-t細胞治療在b細胞等血液系統(tǒng)腫瘤中取得了令人鼓舞的療效，但是髓系的抗原屬性與b系有著本質的區(qū)別，正常髓系細胞被car-t殺滅會導致骨髓衰竭并且缺乏相應的替代治療，這使得aml的car-t治療進展一直非常緩慢，car-t技術成功應用于急性髓細胞白血病(aml)還面臨諸多挑戰(zhàn)。此外，開發(fā)多重重定向的car-t，通過識別腫瘤抗原的兩個非重疊表位，可能是有效根除腫瘤細胞所必需的。因此，深入研究和開發(fā)新型有效的car-t細胞、提高car-t細胞療效對于aml的免疫細胞治療具有重要的理論意義和臨床應用價值。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是如何提高靶向cll1的嵌合抗原受體細胞對cll1陽性腫瘤細胞的殺傷活性和/或抵抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。所要解決的技術問題不限于所描述的技術主題，本領域技術人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術主題。

2、為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了嵌合抗原受體(chimeric?antigenreceptor，car)，所述嵌合抗原受體可包括抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內信號結構域，所述抗原結合結構域可包括特異性靶向cll1的單域抗體1和單域抗體2，所述單域抗體1的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第22-150位所示，所述單域抗體2的氨基酸序列可如seqid?no.1的第166-294位所示。

3、進一步地，所述嵌合抗原受體從n端到c端依次包括抗原結合結構域、跨膜結構域和細胞內信號結構域。

4、進一步地，所述單域抗體1可位于所述單域抗體2的n端或c端。

5、具體地，所述單域抗體1可位于所述單域抗體2的n端。

6、上述嵌合抗原受體中，所述跨膜結構域可來源于cd8a、cd4、cd28、cd137、cd80、cd86或cd152。

7、進一步地，所述跨膜結構域可為cd8a跨膜區(qū)。

8、進一步地，所述cd8a跨膜區(qū)的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第340-363位所示。

9、進一步地，所述嵌合抗原受體還可包括鉸鏈結構域，所述鉸鏈結構域可位于所述抗原結合結構域的c-末端和所述跨膜結構域的n-末端之間。

10、進一步地，所述鉸鏈結構域可來源于cd8a。

11、進一步地，所述鉸鏈結構域可為cd8a鉸鏈區(qū)。

12、進一步地，所述cd8a鉸鏈區(qū)的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第295-339位所示。

13、上述嵌合抗原受體中，所述細胞內信號結構域可包括共刺激結構域4-1bb和激活結構域cd3ζ。

14、進一步地，所述共刺激結構域4-1bb的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第364-410位所示。

15、進一步地，所述激活結構域cd3ζ的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第411-522位所示。

16、進一步地，所述嵌合抗原受體還可包括接頭(linker)，所述接頭可用于連接所述單域抗體1和所述單域抗體2。

17、進一步地，所述接頭可為柔性肽接頭。

18、進一步地，所述接頭可為包括甘氨酸和/或絲氨酸殘基的肽接頭。

19、進一步地，所述接頭的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第151-165位所示。

20、進一步地，所述嵌合抗原受體還可包括位于所述嵌合抗原受體n端的信號肽(signal)。

21、進一步地，所述信號肽可來源于cd8。

22、進一步地，所述信號肽的氨基酸序列可如seq?id?no.1的第1-21位所示。

23、在本發(fā)明的一個實施方案中，所述嵌合抗原受體自n-末端至c-末端依次可為所述信號肽(signal)、所述單域抗體1(也可稱為單域抗體cll1-vhh-1)、所述linker、所述單域抗體2(也可稱為單域抗體cll1-vhh-16)、所述cd8a鉸鏈區(qū)(hinge)、所述cd8a跨膜區(qū)、所述共刺激結構域4-1bb和所述激活結構域cd3ζ。

24、進一步地，所述嵌合抗原受體可為下述任一種：

25、a1)氨基酸序列是seq?id?no.1的第22-522位所示的蛋白質；

26、a2)在a1)的n端和/或c端連接標簽或信號肽得到的與a1)具有相同功能的融合蛋白質。

27、a2)中所述信號肽的氨基酸序列可為seq?id?no.1的第1-21位。

28、進一步地，所述嵌合抗原受體名稱可為cll1?de?car，所述cll1?de?car的氨基酸序列可為seq?id?no.1。

29、本文所述嵌合抗原受體可為雙表位嵌合抗原受體(雙表位car)。

30、本發(fā)明還提供了融合蛋白，所述融合蛋白可包括本文中任一所述的嵌合抗原受體和嵌合轉換受體，所述嵌合轉換受體的氨基酸序列可如seq?id?no.3的第545-788位所示。

31、所述嵌合轉換受體可位于所述嵌合抗原受體的c端。

32、所述嵌合抗原受體和所述嵌合轉換受體可通過自剪切肽連接。

33、所述自剪切肽可為p2a、f2a、t2a或e2a。

34、所述p2a的氨基酸序列可為seq?id?no.5。所述f2a的氨基酸序列可為seq?idno.6。所述t2a的氨基酸序列可為seq?id?no.7。所述e2a的氨基酸序列可為seq?idno.8。

35、具體地，所述自剪切肽為p2a。

36、進一步地，所述融合蛋白可為下述任一種：

37、b1)氨基酸序列是seq?id?no.3的第22-788位所示的蛋白質；

38、b2)在b1)的n端和/或c端連接標簽或信號肽得到的與b1)具有相同功能的融合蛋白質。

39、b2)中所述信號肽的氨基酸序列可為seq?id?no.1的第1-21位。

40、進一步地，所述融合蛋白名稱可為cll1?de?car-cr，所述cll1?de?car-cr的氨基酸序列可為seq?id?no.3。

41、本文所述融合蛋白也可稱為雙表位嵌合抗原受體(雙表位car)。

42、本文所述標簽包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉移酶)標簽蛋白、his標簽蛋白(his-tag)、mbp(麥芽糖結合蛋白)標簽蛋白、flag標簽蛋白、sumo標簽蛋白、ha標簽蛋白、myc標簽蛋白、gfp(綠色熒光蛋白)、cfp(青色熒光蛋白)、yfp(黃綠色熒光蛋白)、mcherry(單體紅色熒光蛋白)或avitag標簽蛋白。

43、本發(fā)明還提供了生物材料，所述生物材料可為下述任一種：

44、c1)編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子；

45、c2)編碼所述融合蛋白的核酸分子；

46、c3)含有c1)或c2)所述核酸分子的表達盒；

47、c4)含有c1)或c2)所述核酸分子的重組載體、或含有c3)所述表達盒的重組載體；

48、c5)含有c1)或c2)所述核酸分子的重組微生物、或含有c3)所述表達盒的重組微生物、或含有c4)所述重組載體的重組微生物；

49、c6)含有c1)或c2)所述核酸分子的重組細胞、或含有c3)所述表達盒的重組細胞、或含有c4)所述重組載體的重組細胞。

50、上述生物材料中，所述核酸分子可為下述任一種：

51、d1)編碼序列是seq?id?no.2或seq?id?no.2的第64-1566位、seq?id?no.4或seqid?no.4的第64-2367位所示的dna分子；

52、d2)核苷酸序列是seq?id?no.2或seq?id?no.2的第64-1566位、seq?id?no.4或seqid?no.4的第64-2367位所示的dna分子。

53、seq?id?no.2所示的dna分子名稱可為cll1?de?car基因，其編碼氨基酸序列為seqid?no.1的嵌合抗原受體cll1?de?car。seq?id?no.2的第64-1566位所示的dna分子編碼不含信號肽的嵌合抗原受體cll1?de?car。

54、seq?id?no.4所示的dna分子名稱可為cll1?de?car-cr基因，其編碼氨基酸序列為seq?id?no.3的融合蛋白cll1?de?car-cr。seq?id?no.4的第64-2367位所示的dna分子編碼不含信號肽的融合蛋白cll1?de?car-cr。

55、本發(fā)明還提供了修飾的免疫效應細胞，所述修飾的免疫效應細胞可包含本文中任一所述的嵌合抗原受體、所述融合蛋白或本文中任一所述的核酸分子。

56、進一步地，所述修飾的免疫效應細胞可為本文中任一所述嵌合抗原受體修飾的免疫效應細胞，或本文中任一所述融合蛋白修飾的免疫效應細胞。

57、進一步地，所述修飾的免疫效應細胞可含有編碼本文中任一所述嵌合抗原受體的核酸分子。

58、進一步地，所述修飾的免疫效應細胞可含有編碼本文任一所述融合蛋白的核酸分子。

59、進一步地，所述免疫效應細胞可包括t細胞、nk細胞、nkt細胞、γδt細胞、巨噬細胞、外周血單核細胞(pbmc)和多能干細胞。

60、具體地，所述免疫效應細胞為t淋巴細胞(t細胞)。

61、進一步地，所述免疫效應細胞可包括自體或非自體的免疫效應細胞。所述非自體的免疫效應細胞可為同種異體的免疫效應細胞?！白泽w的”意在指源自相同個體。“同種異體的”意在指源自屬于相同的物種但遺傳上不同的個體。

62、進一步地，所述修飾的免疫效應細胞可包括car-t細胞、car-nk細胞、car-nkt細胞、car-γδt細胞、car-巨噬細胞(car-m細胞)、car-ipsc細胞和car-psc細胞。

63、進一步地，所述修飾的免疫效應細胞可為car-t細胞，所述car-t細胞可表達本文中任一所述的嵌合抗原受體或融合蛋白，其靶向c型凝集素樣分子1(c-type?lectin-likemolecule?1，cll1)。

64、進一步地，本文所述car-t細胞可為cll1?de?car-t細胞或cll1?de?car-cr-t細胞，所述cll1?de?car-t細胞含有seq?id?no.2所示的cll1?de?car基因；所述cll1?de?car-cr-t細胞含有seq?id?no.4所示的cll1?de?car-cr基因。

65、本文所述car-t細胞可靶向cll1抗原的雙表位，也可稱為雙表位car-t細胞。

66、本文所述car-t細胞(雙表位car-t細胞)可具有下述任一種特性：

67、f1)分泌t細胞特異性效應分子ifn-γ；

68、f2)特異性殺傷cll1陽性腫瘤細胞；

69、f3)抑制cll1陽性腫瘤生長。

70、進一步地，所述cll1?de?car-cr-t細胞可具有下述任一種特性：

71、g1)分泌t細胞特異性效應分子ifn-γ；

72、g2)特異性殺傷cll1陽性腫瘤細胞；

73、g3)抑制cll1陽性腫瘤生長；

74、g4)將car-t細胞中的pd-1抑制信號轉換為cd27刺激信號；

75、g5)抗腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用。

76、本發(fā)明還提供了本文中任一所述的嵌合抗原受體、所述融合蛋白、所述生物材料或所述修飾的免疫效應細胞在制備具有如下任一種功能的產品中的應用：

77、e1)預防或治療腫瘤；

78、e2)預防或治療cll1靶點相關疾??；

79、e3)殺傷cll1陽性的腫瘤細胞；

80、e4)抑制cll1陽性的腫瘤生長；

81、e5)促進細胞因子ifn-γ釋放；

82、e6)檢測表達cll1的癌細胞。

83、上述應用中，所述腫瘤可為cll1陽性的腫瘤。

84、上述應用中，所述cll1靶點相關疾病可為cll1陽性癌癥(即表達cll1的癌癥)。

85、進一步地，所述cll1陽性的腫瘤或所述cll1靶點相關疾病可為急性髓細胞白血病(acute?myeloid?leukemia，aml)、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic?syndromes，mds)或慢性髓細胞白血病(chronic?myeloidleukemia，cml，慢性粒細胞白血病)。

86、本文所述產品可包括試劑、試劑盒、藥物或藥物組合物。

87、本發(fā)明還提供了用于預防或治療cll1靶點相關疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包括所述修飾的免疫效應細胞和一種或多種藥學上可接受的載體。

88、所述藥學上可接受的載體選自稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、吸附載體、表面活性劑和潤滑劑。

89、為了將所述藥物組合物制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑(載體)，例如，水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、乙醇、聚乙二醇、1,3-丙二醇、乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油等載體，此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑、ph調節(jié)劑等載體。

90、所述藥物組合物還可包括細胞凍存液(含二甲基亞砜、氯化鈉、人血白蛋白等)。

91、本發(fā)明還提供了試劑盒，所述試劑盒含有本文中任一所述的嵌合抗原受體、所述融合蛋白或所述修飾的免疫效應細胞。

92、本發(fā)明還提供了預防或治療cll1靶點相關疾病的方法，所述方法包括向患有cll1靶點相關疾病的受試者施用所述修飾的免疫效應細胞或所述藥物組合物。

93、上述方法中，所述cll1靶點相關疾病可為cll1陽性癌癥。

94、上述方法中，所述cll1陽性癌癥可為急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征或慢性髓細胞白血病。

95、本發(fā)明還提供了制備所述修飾的免疫效應細胞的方法，所述方法包括：將本文中所述的核酸分子轉入免疫效應細胞中穩(wěn)定表達，得到所述修飾的免疫效應細胞。

96、上述方法中，所述免疫效應細胞選自t細胞、nk細胞、nkt細胞、γδt細胞、巨噬細胞、外周血單核細胞和多能干細胞。

97、上述方法中，所述免疫效應細胞可為t細胞。

98、上述方法中，所述方法可包括如下步驟：

99、(1)將cll1?de?car基因(seq?id?no.2)或cll1?de?car-cr基因(seq?idno.4)克隆到逆轉錄病毒載體中，得到重組逆轉錄病毒載體；

100、(2)將所述重組逆轉錄病毒載體導入包裝細胞進行包裝，得到重組逆轉錄病毒；

101、(3)將所述重組逆轉錄病毒感染人的t細胞，得到重組細胞。

102、本發(fā)明還提供了所述修飾的免疫效應細胞在制備用于預防或治療cll1靶點相關疾病的藥物中的用途。

103、進一步地，所述逆轉錄病毒載體可為逆轉錄病毒載體mp71。

104、進一步地，所述包裝細胞可為phoenix?ecotropic(eco)細胞和pg13細胞。

105、本發(fā)明首先設計了一種結合單一腫瘤抗原(cll1)的兩個單獨表位的雙表位嵌合抗原受體(雙表位car)cll1?de?car(seq?id?no.1)，結構如圖1所示。在此基礎上，進一步通過自剪切肽連接一個嵌合轉換受體(cr)pd-1&cd27，設計得到cll1?de?car-cr(seq?idno.3)，結構如圖2所示。進一步地，利用上述設計的cll1?de?car編碼基因(seq?id?no.2)和cll1?de?car-cr編碼基因(seq?id?no.4)對t細胞進行修飾，得到靶向cll1的雙表位car-t細胞：cll1?de?car-t細胞和cll1?de?car-cr-t細胞。對構建好的car-t細胞進行功能驗證，實驗結果表明，本發(fā)明的雙表位car-t細胞能夠很好地分泌t細胞特異性效應分子ifn-γ，有效地特異性殺傷cll1+靶細胞，具有良好的體內殺瘤活性，不僅可以顯著抑制腫瘤細胞在小鼠體內的增殖，還能顯著延長小鼠的生存時間。其中cll1?de?car-cr-t細胞因其含有嵌合轉換受體，還具有逆轉car-t細胞中pd-1抑制信號為cd27刺激信號的功能，進而具有抵御免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的能力，使其具有更強的體內持久性。其分泌ifn-γ的效果、其特異性細胞毒作用及其體內殺瘤活性均優(yōu)于cll1?de?car-t細胞。本發(fā)明的雙表位car-t細胞抗腫瘤能力好，可用于cll1靶點相關疾病(如急性髓細胞白血病、骨髓增生異常綜合征或慢性髓細胞白血病)的免疫治療，具有廣闊的臨床應用前景。