本發(fā)明大體上涉及用于在體外誘導(dǎo)全能干細胞的組合物和方法，所述全能干細胞在功能上和分子上類似于來自全能胚胎的細胞。

背景技術(shù)：

1、在發(fā)育過程中，早期卵裂球是全能細胞，其具有在單細胞水平上產(chǎn)生完整個體（包括胚胎和胚外成分兩者）的潛力。早期卵裂球的全潛能在胚泡期逐漸受到限制，分化為外胚層、滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層。胚泡可分化出不同的自我更新的干細胞，包括多能干細胞、滋養(yǎng)層干細胞和胚外內(nèi)胚層細胞，它們分別保留了外胚層、滋養(yǎng)外胚層和原始內(nèi)胚層的發(fā)育潛能。重要的是，這些干細胞類型的發(fā)育潛能受到譜系限制，因為它們難以跨越胚胎和胚外譜系界限，特別是在體內(nèi)(papaioannou,?v.?e.,?mcburney,?m.?w.,?gardner,?r.?l.?&evans,?m.?j.?fate?of?teratocarcinoma?cells?injected?into?early?mouse?embryos.nature?258,?70-73,?doi:10.1038/258070a0?(1975);?gardner,?r.?l.?&?rossant,?j.investigation?of?the?fate?of?4-5?day?post-coitum?mouse?inner?cell?mass?cellsby?blastocyst?injection.?j?embryol?exp?morphol?52,?141-152?(1979);beddington,?r.?s.?&?robertson,?e.?j.?an?assessment?of?the?developmentalpotential?of?embryonic?stem?cells?in?the?midgestation?mouse?embryo.development?105,?733-737?(1989))。與這些胚泡來源的干細胞類型相比，全能胚胎細胞具有最大的發(fā)育潛能，人們對從體外全能胚胎捕獲這種干細胞具有極大的科學(xué)興趣，其不受限制的潛能將在干細胞生物學(xué)和再生醫(yī)學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。

2、先前的研究表明，在小鼠胚胎干(es)細胞培養(yǎng)物中存在一種罕見的2細胞胚胎(2c)樣亞群，這種亞群表達2細胞卵裂球分子標記，具有胚胎和胚外發(fā)育潛能(macfarlan,t.?s.等人.?embryonic?stem?cell?potency?fluctuates?with?endogenous?retrovirusactivity.?nature?487,?57-63,?doi:10.1038/?nature11244?(2012);?rodriguez-terrones,?d.等人.?a?molecular?roadmap?for?the?emergence?of?early-embryonic-like?cells?in?culture,?nature?genetics?50,?106-119,?doi:10.1038/s41588-017-0016-5?(2018))。2c樣細胞的主要局限性在于，它們只是小鼠胚胎干細胞培養(yǎng)物中的小群體，并且處于短暫的中間狀態(tài)，在體外不能穩(wěn)定。近年來，我們的團隊和其他人已經(jīng)表明，小分子組合可以擴大多能干細胞向胚外譜系的發(fā)育潛能。重要的是，擴展多能干細胞(eps)可以被誘導(dǎo)成胚泡樣結(jié)構(gòu)(wo2017025061a1)。盡管它們的發(fā)育潛能擴大，這些細胞在轉(zhuǎn)錄組學(xué)上仍然不同于2細胞胚胎。此外，與全能胚胎相比，它們的胚外分化潛能仍然有限(posfai,?e.等人.?evaluating?totipotency?using?criteria?of?increasingstringency.?nature?cell?biology?23,?49-60,?doi:10.1038/s41556-020-00609-2(2021))。因此，在體外捕獲和維持真正的全能干細胞仍然是一個重大挑戰(zhàn)。

3、因此，本發(fā)明的一個目的是在體外提供全能干細胞。

4、本發(fā)明的一個目的也是提供在體外誘導(dǎo)分離的多能干細胞的全能性的組合物。

5、本發(fā)明的一個目的也是提供在體外誘導(dǎo)分離的多能干細胞的全能性的方法。

6、本發(fā)明的另一個目的是提供具有全能性的細胞的使用方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、已鑒定出可用于在體外誘導(dǎo)分離細胞全能性的多種因子的混合物，本文將其稱為全能性化學(xué)誘導(dǎo)劑(cdt)。cdt可以在體外由胚胎（例如2細胞胚胎）以及由多能細胞（例如擴展多能干細胞），直接建立全能樣干細胞，稱為全潛能干細胞(tps)。誘導(dǎo)的全能樣干細胞可以在體外長期穩(wěn)定維持，具有類似于2細胞至4細胞卵裂球的分子特征。此外，它們可以在單細胞水平上在體內(nèi)產(chǎn)生胚胎譜系和胚外譜系，并在體外形成胚泡樣結(jié)構(gòu)。

2、cdt包括：(1)hdac抑制劑，(2)dot1l抑制劑，(3)rarγ激動劑，(4)任選地gsk抑制劑。在優(yōu)選實施方案中，hdac抑制劑是hdac1抑制劑和/或hdac2抑制劑，例如，選自vpa(“v”)、tsa、ms275、scriptaid、saha、lbh589、fk228、pxd101、丁酸鈉、laq824、cudc-101、jnj-26481585、sb939、pci-24781、acy-1215、ci994、cudc-907、rgfp109、resminostat、姜黃素、雙丙戊酸鈉、4-pba、gsk3117391、cay10433、cm-675和mgcd0103中的一個；dot1l抑制劑選自例如epz004777(“e”)、epz5676和sgc0946；rarγ激動劑選自例如cd1530(“d”)、am580、ch55、帕羅伐?。╬alovarotene）、cd3254、cd5789、cd437、ttnpb、agn205327和ra；gsk抑制劑是gsk3抑制劑，例如選自chir99021(“c”)、azd2858、ly2090314、bio、chir?98014、sb415286、azd1080、brd3731、a?1070722、bip-135和sb216763中的一個。

3、還提供了一種通過使用本文公開的cdt培養(yǎng)供體細胞或源自供體細胞的細胞來誘導(dǎo)分離的多能干細胞的全能性的方法。待誘導(dǎo)細胞(即供體細胞)與cdt接觸有效誘導(dǎo)全能性的時間。在優(yōu)選實施方案中，細胞在含有cdt的培養(yǎng)基中培養(yǎng)15-150天之間的一段時間，例如15、30、45、60、75、90、105、120、135、150天。

4、還公開了一種分離的化學(xué)誘導(dǎo)的全潛能干細胞(citpsc)。本文公開的分離的化學(xué)誘導(dǎo)的全潛能干細胞被鑒定為基于包括以下的特性的全能干細胞：i)?任選地在10次或更多次傳代之后，與未處理的相應(yīng)細胞相比，存在選自zscan4,?zfp352,?tcstv1,?tcstv3,mervl,?dux,?dub1a,?eif1al6,?eif1al9,?gm4340和tdpoz4中的任何一個或更多個，優(yōu)選所有的全能標記基因的細胞表達，和/或ii)與未處理的相應(yīng)細胞相比，選自oct4、nanog和sox2中的任何一個或更多個，優(yōu)選所有的多能標記基因的細胞表達下調(diào)。上調(diào)或下調(diào)是通過比較從其獲得citpsc的相應(yīng)細胞中測量的因子的水平來確定的。本文公開的citpsc至少可以通過用于產(chǎn)生它們的方法，即通過它們的起源，與小鼠胚胎細胞、esc或擴展多能干細胞區(qū)分開來。當小鼠胚胎細胞或esc是天然存在的細胞時，另一方面，當用本文所述的多種因子的組合處理供體細胞獲得citpsc時，citpsc不是天然存在的。

5、citpsc可以培養(yǎng)或誘導(dǎo)分化為所需類型的細胞。citpsc及其后代可用于許多應(yīng)用，包括但不限于細胞治療和組織工程。