本發(fā)明屬于病毒檢測，具體涉及一種用于同時檢測多種辣椒病毒的引物組合物、微流控芯片、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

1、辣椒（capsicum?annuum?l.）是茄科辣椒屬的一年生或有限多年生植物，作為世界上最重要的香料作物之一，其具有優(yōu)異的表型、園藝、農(nóng)藝和生物多樣性，商業(yè)價值極高。長期以來，病毒病一直是制約辣椒生產(chǎn)的主要因素之一，嚴(yán)重威脅辣椒產(chǎn)量、品質(zhì)和經(jīng)濟效益。

2、辣椒既能被dna病毒侵染，更能被rna病毒侵染。辣椒病毒可在其他寄主上越冬，種子也可帶毒。分子生物學(xué)檢測是從核酸水平檢測病毒，其靈敏度高，特異性強，能克服血清學(xué)及其他檢測方法中的一些缺點，在大批量的樣本檢測中較為適用，是目前最具應(yīng)用前景的病毒檢測技術(shù)。如rt-pcr技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、雙鏈rna（dsrna）電泳技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等在病毒檢測中的應(yīng)用日趨廣泛。

3、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（loop-mediated?isothermal?amplification，lamp）是2000年由日本研究人員notomi等發(fā)明的一種新型的體外等溫擴增特異性核酸片段的技術(shù)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4~6種特異性引物，在鏈置換dna聚合酶（bst?dna?polymerase）的作用下，60~65℃等溫擴增，1小時內(nèi)即可實現(xiàn)109～1010倍的核酸擴增，具有操作簡單、特異性強、產(chǎn)物易檢測等特點。

4、微流控芯片提供了一種精確控制和處理微量樣本的方法，并且具有成本低、體積小和高通量等特點。此外，芯片設(shè)計靈活，整個體系操作方便、可控；其樣品量相對于微陣列芯片大大減少；密閉的操作環(huán)境增加了檢測的抗污染能力；其增強物質(zhì)傳遞效率的性能可縮短反應(yīng)時間以及提高靈敏度。

5、中國大多數(shù)辣椒產(chǎn)區(qū)以黃瓜花葉病毒和煙草花葉病毒為優(yōu)勢種群，但蠶豆萎蔫病毒、辣椒輕斑駁病毒等病毒也逐漸成為中國辣椒主產(chǎn)區(qū)的重要病毒病原，馬鈴薯病毒對辣椒的侵染也呈上升趨勢。基于當(dāng)前茄科植物病毒感染現(xiàn)狀，提供操作簡便、快速高效、成本低的病毒檢測方法已經(jīng)成為亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足之處，提供一種新的引物組合物以及包含該引物組合物的微流控芯片、檢測試劑盒和相應(yīng)的檢測方法。由此，本發(fā)明基于lamp手段，并結(jié)合微流控技術(shù)，在多個獨立反應(yīng)池中獨立地進(jìn)行單一靶基因序列檢測，還可以利用微流控芯片的回路設(shè)計工藝及壓力驅(qū)動驅(qū)使整個檢測反應(yīng)完成，與普通管式lamp相比，其具有單次加樣檢測多種靶標(biāo)基因的優(yōu)勢，具備操作簡便、快速高效、成本低等特點。

2、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗和研究，選取辣椒輕斑駁病毒（pmmov，煙草花葉病毒屬）、番茄褐色皺紋果病毒（tobrfv，煙草花葉病毒屬）、番茄斑駁花葉病毒（tommv，煙草花葉病毒屬）、鳳果花葉病毒（pepmv，馬鈴薯x病毒屬）、番茄斑萎病毒（tswv，番茄斑萎病毒屬）和番茄環(huán)斑病毒（torsv，豇豆花葉病毒科）六種辣椒相關(guān)rna病毒作為檢測靶標(biāo)，并將lamp與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，僅需單次加樣即可實現(xiàn)同時對多種辣椒病毒的高效、精確檢測。本發(fā)明的優(yōu)勢體現(xiàn)在操作簡便，設(shè)備需求低，適合在現(xiàn)場環(huán)境下進(jìn)行快速、高靈敏度的病毒檢測。

3、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

4、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增同時檢測多種辣椒病毒的引物組合物，其包括以下的引物組：用于檢測辣椒輕斑駁病毒（pmmov）的引物組、用于檢測番茄褐色皺紋果病毒（tobrfv）的引物組、用于檢測番茄斑駁花葉病毒（tommv）的引物組、用于檢測鳳果花葉病毒（pepmv）的引物組、用于檢測番茄斑萎病毒（tswv）的引物組和用于檢測番茄環(huán)斑病毒（torsv）的引物組。

5、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述用于采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增同時檢測多種辣椒病毒的引物組合物還包括用于檢測辣椒rbcl基因的引物組。

6、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測pmmov的引物組包括：

7、外引物對pmmov-f3和pmmov-b3（pmmov-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.1和2所示；

8、內(nèi)引物對pmmov-fip和pmmov-bip（pmmov-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?idno.?3和4所示；和

9、環(huán)引物對pmmov-lf和pmmov-lb（pmmov-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.5和6所示。

10、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對pmmov-f3/b3、內(nèi)引物對pmmov-fip/bip和環(huán)引物對pmmov-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

11、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測tobrfv的引物組包括：

12、外引物對tobrfv-f3和tobrfv-b3（tobrfv-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?idno.?7和8所示；

13、內(nèi)引物對tobrfv-fip和tobrfv-bip（tobrfv-fip/bip），其核苷酸序列分別如seqid?no.?9和10所示；和

14、環(huán)引物對tobrfv-lf和tobrfv-lb（tobrfv-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?idno.?11和12所示。

15、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對tobrfv-f3/b3、內(nèi)引物對tobrfv-fip/bip和環(huán)引物對tobrfv-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

16、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測tommv的引物組包括：

17、外引物對tommv-f3和tommv-b3（tommv-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.13和14所示；

18、內(nèi)引物對tommv-fip和tommv-bip（tommv-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?idno.?15和16所示；和

19、環(huán)引物對tommv-lf和tommv-lb（tommv-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.17和18所示。

20、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對tommv-f3/b3、內(nèi)引物對tommv-fip/bip和環(huán)引物對tommv-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

21、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測pepmv的引物組包括：

22、外引物對pepmv-f3和pepmv-b3（pepmv-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.19和20所示；

23、內(nèi)引物對pepmv-fip和pepmv-bip（pepmv-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?idno.?21和22所示；和

24、環(huán)引物對pepmv-lf和pepmv-lb（pepmv-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.23和24所示。

25、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對pepmv-f3/b3、內(nèi)引物對pepmv-fip/bip和環(huán)引物對pepmv-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

26、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測tswv的引物組包括：

27、外引物對tswv-f3和tswv-b3（tswv-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.?25和26所示；

28、內(nèi)引物對tswv-fip和tswv-bip（tswv-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?id?no.27和28所示；和

29、環(huán)引物對tswv-lf和tswv-lb（tswv-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.?29和30所示。

30、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對tswv-f3/b3、內(nèi)引物對tswv-fip/bip和環(huán)引物對tswv-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

31、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測torsv的引物組包括：

32、外引物對torsv-f3和torsv-b3（torsv-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.31和32所示；

33、內(nèi)引物對torsv-fip和torsv-bip（torsv-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?idno.?33和34所示；和

34、環(huán)引物對torsv-lf和torsv-lb（torsv-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.35和36所示。

35、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對torsv-f3/b3、內(nèi)引物對torsv-fip/bip和環(huán)引物對torsv-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

36、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述用于檢測rbcl基因的引物組包括：

37、外引物對rbcl-f3和rbcl-b3（rbcl-f3/b3），其核苷酸序列分別如seq?id?no.?37和38所示；

38、內(nèi)引物對rbcl-fip和rbcl-bip（rbcl-fip/bip），其核苷酸序列分別如seq?id?no.39和40所示；和

39、環(huán)引物對rbcl-lf和rbcl-lb（rbcl-lf/lb），其核苷酸序列分別如seq?id?no.?41和42所示。

40、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述外引物對rbcl-f3/b3、內(nèi)引物對rbcl-fip/bip和環(huán)引物對rbcl-lf/lb的摩爾比為1：3~9：1~5，優(yōu)選為1：8：4。

41、本發(fā)明中，各靶標(biāo)引物組分別包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，而且每對引物中的引物之間的摩爾比均為1：1。如pmmov靶標(biāo)的外引物對pmmov-f3/b3中pmmov-f3和pmmov-b3的摩爾比為1：1，內(nèi)引物對pmmov-fip/bip中pmmov-fip和pmmov-bip的摩爾比為1：1，環(huán)引物對pmmov-lf/lb中pmmov-lf和pmmov-lb修改的摩爾比為1：1。

42、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于同時檢測多種辣椒病毒的微流控芯片，其中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的引物組合物中的每種引物組分別包含在所述微流控芯片的不同反應(yīng)池中。

43、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述微流控芯片還包括用于包含陰性對照和/或陽性對照的反應(yīng)池。

44、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，在每組反應(yīng)池中，根據(jù)本發(fā)明第一方面的引物組合物中的每種引物組分別包含在所述微流控芯片的不同反應(yīng)池中。所述微流控芯片設(shè)置多組反應(yīng)池可以實現(xiàn)多個樣品的同時檢測，快速、簡便、同步且高效。

45、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，每個所述反應(yīng)池包含每種引物組、rna環(huán)介導(dǎo)等溫擴增預(yù)混液和熒光染料的凍干混合物，其中所述rna環(huán)介導(dǎo)等溫擴增預(yù)混液包含逆轉(zhuǎn)錄酶、dna聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（dntps）和反應(yīng)緩沖液。

46、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，每個所述反應(yīng)池還包含tte?uvrd解旋酶和超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白（et?ssb）；優(yōu)選地，所述tte?uvrd解旋酶為耐受高溫（70℃）的tte?uvrd解旋酶；優(yōu)選地，所述超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白為耐受極高溫（95℃）的超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白。本發(fā)明使用的tte?uvrd解旋酶（例如耐受高溫（70℃）的tte?uvrd解旋酶）能夠在擴增反應(yīng)時高效打開dna雙鏈結(jié)構(gòu)，提高反應(yīng)特異性；本發(fā)明使用的超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白（et?ssb）（例如耐受極高溫（95℃）的超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白）能夠穩(wěn)定單鏈結(jié)構(gòu)，有利于引物快速結(jié)合，提高反應(yīng)靈敏度。

47、本發(fā)明引入常規(guī)lamp技術(shù)不會使用的tte?uvrd解旋酶和et?ssb，相較于常規(guī)lamp技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)更高的特異性和靈敏度。其中，集成了tte?uvrd解旋酶和et?ssb的lamp技術(shù)的基本原理如圖2所示。

48、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述微流控芯片還包括透氣孔、加樣池、定量池和廢液池。

49、在本發(fā)明的微流控芯片中，透氣孔用于進(jìn)出氣，同時保證后續(xù)順利加樣；加樣池用于液體加樣，加樣液體為反應(yīng)液（如lamp反應(yīng)液）與樣品的混合液；定量池用于液體定量，確保反應(yīng)體積固定；反應(yīng)池用于反應(yīng)，池內(nèi)預(yù)埋有凍干混合物（包含每種引物組、rna環(huán)介導(dǎo)等溫擴增預(yù)混液和熒光染料的混合物凍干粉）；廢液池用于儲存多余廢液。

50、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述微流控芯片還包括與其底部鍵合的底膜和與其頂部鍵合的頂膜，并且所述底膜和頂膜將所述微流控芯片封閉。

51、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述頂膜還包括封口膜。

52、第三方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)本發(fā)明第二方面的微流控芯片的制備方法，其包括：

53、（1）將根據(jù)本發(fā)明第一方面的引物組合物中的每種引物組、rna環(huán)介導(dǎo)等溫擴增預(yù)混液和熒光染料分別溶解至無菌水中，得到混合溶液；

54、（2）分別將所述混合溶液點樣至微流控芯片的反應(yīng)孔中；

55、（3）將底膜覆蓋在芯片底部，在45~65℃，優(yōu)選60℃以及0.1~1mpa，優(yōu)選0.5mpa下加熱0.5~3分鐘，優(yōu)選2分鐘，使底膜與芯片底部鍵合；

56、（4）凍干后，將頂膜覆蓋在芯片頂部，在45~65℃，優(yōu)選60℃以及0.1~1mpa，優(yōu)選0.5mpa下加熱0.5~3分鐘，優(yōu)選2分鐘，使頂膜與芯片頂部鍵合。

57、優(yōu)選地，所述凍干包括以下步驟：

58、（4-1）將芯片置于1~100kpa和-60~-40℃，優(yōu)選100kpa和-50℃下預(yù)凍30~200分鐘，優(yōu)選120分鐘，然后置于1~100pa和-60~-40℃，優(yōu)選100pa和-50℃下干燥30~200分鐘，優(yōu)選120分鐘；

59、（4-2）在1~10pa，優(yōu)選1pa的真空度下繼續(xù)干燥：升溫至-50~-30℃，優(yōu)選-40℃，保持30~200分鐘，優(yōu)選120分鐘，再升溫至-40~-20℃，優(yōu)選-30℃，保持30~200分鐘，優(yōu)選120分鐘，然后升溫至-30~0℃，優(yōu)選-20℃，保持30~200分鐘，優(yōu)選120分鐘，升溫至20~30℃，優(yōu)選25℃。

60、本發(fā)明提供的微流控芯片通過熱壓鍵合工藝將芯片與底膜、頂膜封閉為一個整體，其中底膜用于封閉芯片底層，頂膜（含封口膜）用于封閉芯片頂層，所述封口膜用于加樣后封口。熱壓鍵合工藝包括底膜和頂膜的貼膜、壓膜程序，底膜采用的材料可以為塑料，頂膜（含封口膜）采用的材料可以為塑料，二者生物兼容性好，透光性強，適用于真實操作。

61、具體地，熱壓鍵合工藝包括點樣完成后在芯片底部貼上完整的圓形膜9596r，壓膜溫度為60℃，壓膜壓力為0.5mpa，壓膜時間為2min；芯片凍干完成后，在芯片頂部貼上含扇形封口膜的圓形膜4970c，壓膜溫度為60℃，壓膜壓力為0.5mpa，壓膜時間為2min。凍干工藝包括將芯片放入冷凍干燥機后，-50℃下停留120min，開啟真空泵（100kpa），-50℃下停留120min（真空度100pa）；開啟加熱，保持真空度1pa，升溫至-40℃，保持120min，繼續(xù)升溫至-30℃，保持120min，然后升溫至-20℃，保持120min，升溫至25℃，關(guān)閉凍干機。其中，底膜材料為塑料，頂膜（含封口膜）材料為塑料。芯片凍干完成后取鋁袋抽真空進(jìn)行芯片封裝，再置于25℃恒溫箱過夜放置，即得。

62、本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量實驗和研究發(fā)現(xiàn)。使用其他鍵合工藝存在不同程度的缺點：（1）激光焊接對被融合材料吸收激光的性質(zhì)有要求，一般需要兩種鍵合材料有一定程度相似的吸光性質(zhì)；（2）溶劑鍵合存在膠容易滲入到通道中導(dǎo)致通道堵塞的問題，而且此工藝對加熱的溫度和時間的準(zhǔn)確度要求較高，固化過程中還可能產(chǎn)生一些氣體產(chǎn)物，引起芯片腔體環(huán)境的污染；（3）雙面膠鍵合存在膠滲入到通道中導(dǎo)致通道堵塞的缺點，而且雙面膠鍵合還具有非特異吸附樣品或標(biāo)記物等明顯缺點；（4）單面膠膜鍵合對膠膜的產(chǎn)品質(zhì)量要求非常高，而且貼合的壓力很難控制，目前常用的貼膜工藝是人工刮膜，此工藝存在很大的不可控性，對于貼合不到的地方，在pcr擴增過程中容易產(chǎn)生泄漏風(fēng)險；（5）超聲焊接對焊線要求較高，焊線高低不平會導(dǎo)致有虛焊的點，容易發(fā)生漏液，且虛焊的點無法檢查出來。

63、而本發(fā)明采用熱壓鍵合方式克服了上述存在的缺點，其還具備以下較大的優(yōu)勢：其一是主要依靠鍵合溫度、鍵合壓力和鍵合時間的配合使得微流控芯片與pc膜實現(xiàn)分子水平的鍵合，無需使用任何輔助粘結(jié)劑，不存在鍵合盲點，同時微通道上無污染物滲透附著；其二是經(jīng)熱壓鍵合處理過的芯片的力學(xué)性能、熱性能不變；其三是熱壓所用膜的成本相對較低，且機器設(shè)計和制造相對簡單，方便實際操作。

64、此外，本發(fā)明采用預(yù)凍加階梯升溫凍干工藝，其中預(yù)凍固化自由水，賦予產(chǎn)品干燥前后同一形態(tài)；退火重塑冰晶形態(tài)和大小，促使后續(xù)水分快速升華；一次干燥（升華干燥）使固化自由水升華逸出，若過早進(jìn)入二次干燥易導(dǎo)致產(chǎn)品塌陷或回融；二次干燥（解析干燥）去除部分結(jié)合水，使水分降至更低。

65、第四方面，本發(fā)明提供了一種用于同時檢測多種辣椒病毒的試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā)明第二方面的微流控芯片。

66、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述試劑盒還包含用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的其它試劑；優(yōu)選地，所述用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的其它試劑包含mg2+和無酶水；更優(yōu)選地，所述用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的其它試劑中的mg2+濃度為3~6mm。

67、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述試劑盒還包含陽性對照品，其中所述陽性對照品包括以下的辣椒病毒靶標(biāo)以及辣椒rbcl基因的目標(biāo)擴增基因片段：pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv；優(yōu)選地，所述pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv靶標(biāo)以及辣椒rbcl基因的目標(biāo)擴增基因片段的核苷酸序列分別如seq?id?no.?115~121所示。將采用pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv靶標(biāo)和辣椒rbcl基因的目標(biāo)擴增基因片段構(gòu)建得到的凍干質(zhì)粒干粉置于所述試劑盒中。

68、本發(fā)明的pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv靶標(biāo)以及辣椒rbcl基因的目標(biāo)擴增基因片段的核苷酸序列如下表所示：

69、

70、

71、

72、

73、

74、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述試劑盒還包含刮片。

75、基于lamp手段并結(jié)合微流控技術(shù)得到的本發(fā)明的檢測試劑盒僅需單次加樣即可實現(xiàn)同時對多種辣椒病毒的高效、精確檢測，其還可疊加加入耐受高溫（70℃）的tte?uvrd解旋酶和耐受極高溫（95℃）的超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白（et?ssb），從而較使用常規(guī)lamp技術(shù)能具有更高的特異性和靈敏度。

76、第五方面，本發(fā)明提供了一種用于同時檢測多種辣椒病毒的方法，其包括采用根據(jù)本發(fā)明第二方面的微流控芯片或根據(jù)本發(fā)明的第四方面的試劑盒進(jìn)行檢測。

77、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述方法包括采用根據(jù)本發(fā)明第二方面的微流控芯片或根據(jù)本發(fā)明第四方面的試劑盒對待測樣品進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)，并根據(jù)產(chǎn)生的熒光曲線確定待測樣品的病毒感染情況。

78、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)的溫度為60℃~65℃，優(yōu)選為62℃。

79、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)的時間為30~60分鐘，優(yōu)選為45分鐘。

80、根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，所述待測樣品中的pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv、torsv或rbcl基因的靶序列濃度不低于5000拷貝/ml，更優(yōu)選不低于1000拷貝/ml。換句話說，本發(fā)明采用上述微流控芯片或試劑盒的檢測方法對所述各種辣椒病毒rna的最低檢測限為5000拷貝/ml，優(yōu)選為1000拷貝/ml。

81、在本發(fā)明中，基于辣椒內(nèi)源基因rbcl以及pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv基因的靶序列擴增結(jié)果判斷辣椒病毒感染情況。當(dāng)檢測得到的熒光曲線中的基因rbcl出現(xiàn)s型曲線且pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv病毒檢測靶標(biāo)中的任意一種或多種出現(xiàn)s型曲線時，表示待測樣品為辣椒樣本且存在一種或多種對應(yīng)的辣椒相關(guān)病毒感染；當(dāng)pmmov、tobrfv、tommv、pepmv、tswv和torsv病毒檢測指標(biāo)均不出現(xiàn)s型曲線時，表示待測樣品中不存在此六類辣椒相關(guān)病毒。

82、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下有益效果：

83、1.?本發(fā)明基于lamp手段并結(jié)合微流控技術(shù)，單次加樣最多可實現(xiàn)同步檢測辣椒的六種相關(guān)病毒；

84、2.?本發(fā)明的微流控芯片具有操作簡便、分液均勻、生物相容性好、環(huán)境友好等優(yōu)勢，其被進(jìn)一步設(shè)計成具有多個區(qū)域后，可同時檢測多個樣本，還能具有單區(qū)域加樣同時檢測多靶標(biāo)的功能；

85、3.?本發(fā)明的檢測試劑盒能夠快速、高效地實現(xiàn)擴增，使得整個等溫擴增反應(yīng)能夠在45分鐘內(nèi)完成，能夠直接通過檢測熒光信號以及熒光信號出峰時間來判斷檢測結(jié)果，結(jié)果判定簡便。每個檢測靶標(biāo)對應(yīng)的4條內(nèi)、外引物對相應(yīng)病毒檢測靶序列的6個特異區(qū)域的識別及2條環(huán)引物對擴增效率的提升保證了芯片等溫擴增的高度特異性，特異性強，其最低檢測限為1000拷貝/ml，靈敏度高；

86、4.?本發(fā)明的檢測試劑盒還進(jìn)一步使用了耐受高溫（70℃）的tte?uvrd解旋酶和耐受極高溫（95℃）的超熱穩(wěn)定單鏈結(jié)合蛋白（et?ssb），較常規(guī)lamp技術(shù)具有更高特異性和靈敏度。

87、本發(fā)明的微流控芯片或檢測試劑盒在用于辣椒病毒檢測時，可以在等溫條件下快速、簡便、同步、高效、高特異性、高靈敏度地檢測到辣椒相關(guān)病毒以及確定其病毒感染種類，為辣椒相關(guān)病毒的檢測及感染類型的確定提供了新的技術(shù)平臺，為茄科農(nóng)產(chǎn)品的田間疫情監(jiān)測和口岸檢疫等提供了快速、高精準(zhǔn)度的檢測手段。本發(fā)明的微流控芯片或檢測試劑盒還可用于基層農(nóng)產(chǎn)品檢測單位和各進(jìn)出口檢疫檢驗預(yù)防控制中心篩查和檢測辣椒相關(guān)病毒，并為后續(xù)脫毒處理或其他處理方式的選擇提供指導(dǎo)，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益，適于大范圍推廣應(yīng)用。