本技術(shù)涉及活化蛋白c(apc)的抗體、抗體片段和其他結(jié)合物以及相關(guān)制劑、核酸、制備方法和使用方法。

背景技術(shù)：

1、蛋白c(pc)是一種酶原，在肝中作為單鏈的461個(gè)氨基酸前體(seq?id?no:633)合成并分泌到血液中。在分泌之前，通過(guò)去除賴氨酸-精氨酸二肽(seq?id?no:633中的氨基酸198-199)和42個(gè)氨基酸的前原前導(dǎo)序列(seq?id?no:633中的氨基酸1-42)，將單鏈前體轉(zhuǎn)化為異二聚體。異二聚體形式(417個(gè)氨基酸)由通過(guò)二硫橋連接的輕鏈(155個(gè)氨基酸，21kda)和重鏈(262個(gè)氨基酸，41kda)組成。輕鏈包含一個(gè)γ-羧基谷氨酸(gla)結(jié)構(gòu)域(45個(gè)氨基酸)、兩個(gè)egf樣結(jié)構(gòu)域(46個(gè)氨基酸)和接頭序列，而重鏈包含高極性活化肽(seq?idno:633中的氨基酸200-211)和具有典型絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體的催化結(jié)構(gòu)域。pc酶原在凝血酶切割位點(diǎn)處的切割導(dǎo)致去除活化肽并且將pc活化為活化pc(apc；seq?id?no:634；405個(gè)氨基酸)。

2、人pc經(jīng)歷大量的翻譯后修飾，包括糖基化、維生素k依賴性γ-羧化和γ-羥基化。它包含四個(gè)潛在的n連接糖基化位點(diǎn)：一個(gè)位于輕鏈(asn97)，三個(gè)位于重鏈(asn248、asn313和asn329)。其gla結(jié)構(gòu)域包含九個(gè)gla殘基，負(fù)責(zé)pc與帶負(fù)電荷的磷脂膜的鈣依賴性結(jié)合。gla結(jié)構(gòu)域還可以與內(nèi)皮蛋白c受體(epcr)結(jié)合，在pc活化期間在內(nèi)皮膜上對(duì)齊凝血酶和血栓調(diào)節(jié)蛋白。

3、pc活化發(fā)生在內(nèi)皮細(xì)胞表面上，分兩步過(guò)程。它需要pc(經(jīng)由gla結(jié)構(gòu)域)與內(nèi)皮細(xì)胞上的epcr結(jié)合，隨后通過(guò)凝血酶/血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物在重鏈arg12處對(duì)pc進(jìn)行蛋白水解切割。這種單一切割釋放12個(gè)氨基酸的活化肽，將酶原pc轉(zhuǎn)化為活性絲氨酸蛋白酶apc。

4、在生理?xiàng)l件下，apc在人血液中以非常低的濃度(1-2ng/ml或40pm)循環(huán)，半衰期為20-30分鐘，而pc以高得多的濃度(3-5μg/ml或65nm)循環(huán)，半衰期為6-8小時(shí)。

5、pc途徑在調(diào)節(jié)凝血中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，并且通過(guò)在凝血反應(yīng)增強(qiáng)時(shí)放大抗凝血反應(yīng)，用作針對(duì)血栓形成的天然防御機(jī)制。受傷后，生成凝血酶以啟動(dòng)凝血。凝血酶還通過(guò)與血管表面內(nèi)壁的血栓調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合來(lái)觸發(fā)抗凝血反應(yīng)，從而促進(jìn)pc活化。因此，apc生成與凝血酶濃度和pc水平相關(guān)。apc通過(guò)經(jīng)由蛋白水解切割使兩種凝血輔因子(即，因子va和因子viiia)失活而發(fā)揮抗凝血?jiǎng)┑淖饔?，從而抑制凝血酶生成。apc還通過(guò)與纖溶酶原活化劑抑制劑形成復(fù)合物，直接有助于纖維蛋白溶解反應(yīng)的增強(qiáng)。

6、在醫(yī)療狀況和與醫(yī)療程序相關(guān)的情況下，出血都是一個(gè)主要問(wèn)題。例如，出血導(dǎo)致外科手術(shù)、器官移植、顱內(nèi)出血、主動(dòng)脈瘤、產(chǎn)后出血、創(chuàng)傷和某些抗凝血?jiǎng)┻^(guò)量用藥后的并發(fā)癥。事實(shí)上，1-44歲的人死亡的主要原因是與創(chuàng)傷相關(guān)的急性出血。目前治療致命的不可壓迫性出血的選擇很少。出血性疾病(bleeding?disorder)可以通過(guò)抑制apc促進(jìn)凝血酶生成和凝血來(lái)治療。因此，本發(fā)明的第一目的是提供一種安全且有效的出血治療。

7、除其抗凝血功能之外，apc還通過(guò)其抗細(xì)胞凋亡、抗炎和內(nèi)皮屏障穩(wěn)定活性來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞保護(hù)作用，所有這些功能都有助于與apc相關(guān)的再生結(jié)果(例如，刺激神經(jīng)發(fā)生、血管生成和傷口治愈)。

8、缺血是一種致命的病癥，這是由于器官或組織供血不足。供血不足導(dǎo)致組織缺氧，并且可潛在地導(dǎo)致心臟病發(fā)作或中風(fēng)。在代謝高度活躍的組織(諸如心臟和腦)中，缺血可能在短短3-4分鐘內(nèi)引起不可逆的損傷。apc的細(xì)胞保護(hù)作用包括減少細(xì)胞凋亡和抑制缺血后炎癥介質(zhì)的表達(dá)。因此，本發(fā)明的第二目的是提供一種安全且有效的缺血治療。

9、對(duì)人疾病和動(dòng)物模型的研究表明，細(xì)胞外組蛋白參與多種器官的炎癥過(guò)程的發(fā)生或發(fā)展(moiana等人,clin?biochemistry?94(2021年)12-19在15)。因此，組蛋白正在被研究作為其中炎癥和血栓形成發(fā)揮關(guān)鍵病理生理作用的疾病的潛在治療靶標(biāo)。apc通過(guò)組蛋白蛋白水解降低細(xì)胞外組蛋白的細(xì)胞毒性。apc的這種功能依賴于帶負(fù)電荷的外位點(diǎn)，包括glu330和glu333。

10、已知細(xì)胞外組蛋白是膿毒病死亡的主要介質(zhì)。膿毒病是一種致命的病癥，當(dāng)身體對(duì)感染的反應(yīng)導(dǎo)致其自身組織和器官損傷時(shí)就會(huì)發(fā)生該病癥。在美國(guó)，膿毒病是發(fā)病率和死亡率的主要原因，每年導(dǎo)致近270,000人死亡。apc的細(xì)胞保護(hù)作用包括抑制與膿毒病死亡相關(guān)的組蛋白毒性。因此，本發(fā)明的第三目的是提供一種安全且有效的膿毒病治療。

11、組蛋白構(gòu)成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(net)的一部分，細(xì)胞外纖維網(wǎng)絡(luò)，主要由中性粒細(xì)胞的dna組成。net已被證明參與癌癥的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展。癌癥是全世界的主要死亡原因，在2020年導(dǎo)致近10百萬(wàn)人死亡或六分之一的死亡。net通過(guò)數(shù)種機(jī)制影響癌癥，包括炎癥微環(huán)境的建立以及與其他促腫瘤機(jī)制(諸如炎性小體和自噬)的相互作用(shao等人,frontiers?in?oncology第11卷第714357期(2021年)第1頁(yè))。證據(jù)表明，net在多種癌癥類型中發(fā)揮作用，包括乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、血液癌、神經(jīng)癌和皮膚癌(同上，第6頁(yè))。因此，影響pc途徑的干預(yù)可以潛在地影響癌癥，并且本發(fā)明的第四目的是提供一種安全且有效的癌癥治療。

12、基于apc的治療劑已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)年。apc的基因工程已經(jīng)產(chǎn)生了選擇性降低其抗凝血或細(xì)胞保護(hù)活性的apc變體。(griffin等人,blood?125:2898,2015年)。例如，一種這種變體3k3a-apc(lys191-193ala)具有小于10％的野生型apc的抗凝血活性，同時(shí)保留其完整的細(xì)胞保護(hù)活性，并且已進(jìn)入缺血性中風(fēng)的臨床試驗(yàn)。然而，先前將研究觀察結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榛赼pc的藥物的嘗試都已經(jīng)失敗，包括最初嘗試使用apc治療膿毒病。雖然在2001年，令人鼓舞的臨床試驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致基于重組apc蛋白的藥物(drotrecogin?alfa(活化)、重組人活化蛋白c(rhapc)，商品名xigristm)獲得批準(zhǔn)(nengl?j?med?344:699,2001年)，但是最初的積極結(jié)果并未在后續(xù)的隨機(jī)臨床試驗(yàn)中得到重復(fù)，該藥物已從市場(chǎng)上撤回。

13、使用外源性蛋白質(zhì)(諸如apc和apc變體)作為治療劑的一個(gè)潛在問(wèn)題是受體的免疫系統(tǒng)生成針對(duì)它們的抗藥物抗體(ada)的可能性。ada的產(chǎn)生可能產(chǎn)生嚴(yán)重后果，諸如藥物功效喪失和中和或其他不良事件(j?pharm?sci110(7):2575-2584,2021)。因此，本發(fā)明的第五目的是提供一種具有較低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的基于apc的治療劑。

14、apc的抗體已被探索作為選擇性增強(qiáng)或抑制apc不同功能的手段(參見(jiàn)，例如，zhao等人，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)20150307625，2015年10月29日公開(kāi)和egner等人，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2018326053，2018年11月15日公開(kāi))。例如，magisetty等人報(bào)道了選擇性抑制apc的抗凝血活性同時(shí)保留其細(xì)胞保護(hù)活性的鼠抗體顯著降低血友病性關(guān)節(jié)病小鼠模型的關(guān)節(jié)出血的嚴(yán)重程度，而抑制apc的抗凝血和細(xì)胞保護(hù)活性的抗體則不會(huì)(blood(2022年)blood.2021013119)。在zhao等人中，apc的兩種不同抗體被評(píng)估為基于apc的血友病治療(nat?commun?11(1):2992,2020年)。一種抗體被稱為i類，靶向apc的活性位點(diǎn)，而另一種抗體被稱為ii類，靶向apc的外位點(diǎn)。當(dāng)向猴子施用這些抗體時(shí)，凝血酶生成增加并且促進(jìn)血漿凝固。然而，盡管ii類抗體耐受性良好，但是i類抗體導(dǎo)致動(dòng)物死亡。然而，ii類抗體仍然部分抑制apc的活性位點(diǎn)，這表明它可能部分抑制apc的細(xì)胞保護(hù)作用。因此，本發(fā)明的第六目的是提供一種維持或增強(qiáng)apc的細(xì)胞保護(hù)作用的抗apc抗體。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在第一方面，本發(fā)明提供了分離的抗體，其與活化蛋白c(apc)特異性結(jié)合并且與非活化蛋白c(pc)最低程度地結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，這些抗體的重鏈可變區(qū)(vh)包含具有選自由seq?id?no:9和seq?id?no:118組成的組的氨基酸序列的cdr3。在一些實(shí)施方案中，這些抗體包含選自由seq?id?no:61-80和seq?id?no:473-496組成的組的vh。在一些實(shí)施方案中，這些抗體的輕鏈可變區(qū)(vl)包含具有選自由seq?id?no:23和seq?id?no:138-140組成的組的氨基酸序列的cdr3。在一些實(shí)施方案中，這些抗體包含選自由seq?id?no:24-35和seq?id?no:141-151組成的組的vl。在一些實(shí)施方案中，這些抗體包含本文所述的vh和vl兩者。在一些實(shí)施方案中，這些抗體包含的重鏈和輕鏈均來(lái)自本文所述的單個(gè)抗體。

2、在第二方面，本發(fā)明提供了編碼本文所公開(kāi)的抗體的核酸。

3、在第三方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開(kāi)的核酸的載體。

4、在第四方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開(kāi)的核酸或載體的宿主細(xì)胞。

5、在第五方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生本文所公開(kāi)的抗體的方法。所述方法包括：(a)在導(dǎo)致抗體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)本文所公開(kāi)的宿主細(xì)胞；以及(b)從宿主細(xì)胞中分離抗體。

6、在第六方面，本發(fā)明提供了包含本文所公開(kāi)的抗體以及藥學(xué)上可接受的載劑的藥物組合物。

7、在第七方面，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防受試者的病癥的方法。所述方法包括向受試者施用治療有效量的本文所公開(kāi)的抗體、本文所公開(kāi)的與外源性apc蛋白或其變體特異性結(jié)合的抗體、或本文所公開(kāi)的藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，病癥是可以通過(guò)增強(qiáng)或抑制apc的抗凝血功能治療或預(yù)防的病癥。在其他實(shí)施方案中，病癥是可以通過(guò)增強(qiáng)或抑制apc的細(xì)胞保護(hù)功能治療或預(yù)防的病癥。

8、在第八方面，本發(fā)明提供了本文所公開(kāi)的抗體作為藥物的用途。