本發(fā)明涉及一種新的肽合成方法，該方法能夠在肽的合成中以高純度和高效率合成肽。

背景技術(shù)：

1、在肽合成中，fmoc法因其可靠性和溫和的脫保護條件(fmoc脫保護條件)而被廣泛應用。近年來，積極進行了對于含有豐富的n-烷基氨基酸(諸如n-甲基氨基酸)的肽在藥物中的應用的研究，并且已知這些分子種類具有酸不穩(wěn)定性(非專利文獻1和專利文獻1)。因此，在這些文獻中，采用能夠在堿性條件下脫保護的fmoc法，而不是需要酸性條件的boc法來進行n末端的脫保護。

2、肽合成中二酮哌嗪(dkp)的形成是一個很早以前就被認識到的問題。如果二肽n末端的保護基團通過酯鍵負載在固相上，從而暴露出游離氨基基團，則可能形成二酮哌嗪。已經(jīng)報道了一些方法來改善使用fmoc法的肽合成中二酮哌嗪形成的問題。

3、具體地，已知如下方法：作為容易發(fā)生哌嗪二酮形成的位置處的保護基團，使用在中性條件下進行脫保護反應的alloc基團代替堿來抑制哌嗪二酮的生成(非專利文獻2)。

4、另外，已知用于避免在可能進行二酮哌嗪形成的位置處由游離氨基基團形成n-末端的情況的方法，預先合成含有這種序列的二肽，并用于延長肽鏈(非專利文獻3)。

5、另外，已知有如下方法：使用更強的堿dbu或tbaf來代替fmoc的脫保護中通常使用的哌啶，從而使脫保護所需的時間極短，從而抑制二酮哌嗪的生成(非專利文獻4)。

6、所有這些方法都是針對通過酯鍵負載在固相上的二肽中形成二酮哌嗪的對策。

7、引文列表

8、專利文獻

9、專利文獻1：國際公開號wo?2018/225851?a1

10、非專利文獻

11、非專利文獻1：j.peptide?res.,2005,65,153-166。

12、非專利文獻2：org.lett.,2012,14,612-615。

13、非專利文獻3：bachem出版的固相肽合成(https://www.bachem.com/fileadmin/user_upload/pdf/catalogs_brochures/solid_phase_peptide_synthesis.pdf)

14、非專利文獻4：org.lett.,2008,10,3857-3860。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、技術(shù)問題

2、已知在通過酯鍵負載在固相上的二肽中，如上所述，酯鍵被裂解形成二酮哌嗪，而當肽序列包括n-取代的氨基酸時，比酯鍵更強的酰胺鍵可能被裂解形成二酮哌嗪，導致肽序列中含有n-取代的氨基酸的二肽缺失。已知由于這種缺失可能發(fā)生在肽序列中存在n-取代的氨基酸的任何位置，因此可能缺失的二肽不限于負載在固相上的二肽。

3、此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當肽序列包括n-取代的氨基酸時，不僅存在二酮哌嗪形成的問題，而且還存在無法進行期望的延長反應，以及在n末端形成具有6元環(huán)脒骨架(6元環(huán)脒骨架化合物)的雜質(zhì)而不是目標產(chǎn)物的問題。迄今尚未報道解決這些問題的方法。

4、上述常規(guī)技術(shù)不僅可以用于抑制以負載在固相上的二肽的酯鍵進行的二酮哌嗪消除，還可以用于抑制以酰胺鍵進行的二酮哌嗪消除以及6元環(huán)脒骨架化合物的形成。然而，其應用范圍受到限制，并且這些技術(shù)不能提供足夠的解決方案。

5、例如，非專利文獻2中描述的方法需要在可用性方面比fmoc氨基酸通用性差的alloc氨基酸。

6、在非專利文獻3中所述的使用二肽的肽鏈延長方法中，可進行在c末端側(cè)的二肽的氨基酸的外消旋化。因此，除非c末端側(cè)的二肽片段的氨基酸是非手性的(例如在甘氨酸的情況下)或者不可能進行外消旋化(例如在脯氨酸的情況下)，否則本文中描述的方法很難應用。

7、另外，非專利文獻4中記載的方法的特征在于，fmoc脫保護步驟所需的時間非常短，并且該方法需要在一分鐘以下(例如10到20秒)的fmoc脫保護步驟和固體洗滌操作。如此極短的時間操作不可能應用于工業(yè)化等的擴大合成。

8、此外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不僅存在二酮哌嗪形成和/或6元環(huán)脒骨架化合物形成的問題，而且還存在形成二聚脲化合物雜質(zhì)的問題。迄今為止，尚未報道解決二聚脲化合物的形成問題的方法。

9、如上所述，從未提出過抑制二酮哌嗪的實施方法。本發(fā)明是鑒于上述情況而完成的，并且在一個方面，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠抑制二酮哌嗪的形成的肽合成方法，其中，(i)含有fmoc骨架的保護基團用作n末端的保護基團，(ii)序列的應用不受外消旋化的限制，并且(iii)可以用于工業(yè)化等的擴大合成。在另一方面，本發(fā)明的目的是提供能夠抑制6元環(huán)脒骨架化合物的形成的肽合成方法。此外，在另一方面，本發(fā)明的目的是提供能夠抑制二聚脲化合物的形成的肽合成方法。

10、問題的解決方案

11、本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在肽的生產(chǎn)中，將具有含有fmoc骨架的保護基團的肽在特定溶劑中用在乙腈中作為共軛酸具有23或更大的pka的堿來處理，并且隨后通過使用縮合劑生成的諸如酰基氯、活性酯的延長的活性物質(zhì)與肽反應，可以抑制二酮哌嗪和6元環(huán)脒骨架化合物和/或二聚脲化合物的形成，直至延長去除保護基團后的肽鏈。這樣，就完成了本發(fā)明。

12、即，本發(fā)明包括以下內(nèi)容。

13、[0-1]一種用于生產(chǎn)肽的方法，該方法包括以下步驟：

14、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團的第一肽；

15、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理第一肽；以及

16、(3)在步驟(2)后，在溶劑中，在存在或不存在縮合劑的情況下，將第一肽與羧酸或羧酸類似物縮合，以得到第三肽。

17、[0-2]一種用于減少肽生產(chǎn)中形成的二酮哌嗪雜質(zhì)和/或6元環(huán)脒骨架化合物雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

18、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團的第一肽；和

19、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理第一肽。

20、[0-3]一種用于減少肽生產(chǎn)中形成的選自由二酮哌嗪雜質(zhì)、6元環(huán)脒骨架化合物雜質(zhì)和二聚脲化合物雜質(zhì)組成的組中的至少一種雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

21、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團的第一肽；和

22、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理第一肽。

23、[0-4]根據(jù)[0-2]或[0-3]所述的方法，該方法進一步包括步驟(3)：在步驟(2)后，在溶劑中，在存在或不存在縮合劑的情況下，將第一肽與羧酸或羧酸類似物縮合，以得到第三肽。

24、[0-5]根據(jù)[0-1]至[0-4]中任一項所述的方法，該方法通過固相法進行。

25、[0-6]根據(jù)[0-1]至[0-4]中任一項所述的方法，其中第一肽是具有含有fmoc骨架的保護基團并負載于固相上的第一肽。

26、[0-7]根據(jù)[0-1]至[0-4]中任一項所述的方法，該方法通過液相法進行。

27、[1]一種用于通過固相法生產(chǎn)肽的方法，該方法包括以下步驟：

28、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團且負載于固相上的第一肽；

29、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理第一肽；以及

30、(3)在步驟(2)后，在溶劑中，在存在或不存在縮合劑的情況下，將第一肽與羧酸或羧酸類似物縮合，以得到第三肽。

31、[2]一種用于減少通過固相法的肽生產(chǎn)中形成的二酮哌嗪雜質(zhì)和/或6元環(huán)脒骨架化合物雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

32、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團且負載于固相上的第一肽；以及

33、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理所述第一肽。

34、[2-1]一種用于減少肽生產(chǎn)中形成的選自由二酮哌嗪雜質(zhì)、6元環(huán)脒骨架化合物雜質(zhì)和二聚脲化合物雜質(zhì)組成的組中的至少一種雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

35、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團且負載于固相上的第一肽；以及

36、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理所述第一肽。

37、[3]根據(jù)[2]所述的方法，該方法進一步包括步驟(3)：在步驟(2)后，在溶劑中，在存在或不存在縮合劑的情況下，將第一肽與羧酸或羧酸類似物縮合，以得到第三肽。

38、[4]根據(jù)[0-1]至[3]中任一項所述的方法，其中步驟(2)是除去第一肽中含有fmoc骨架的保護基團的步驟，和/或?qū)⒌谝浑闹械暮衒moc骨架的保護基團轉(zhuǎn)化為氨基甲酸鹽的形式的步驟。

39、[5]根據(jù)[0-1]至[3]中任一項所述的方法，其中除去第一肽中含有fmoc骨架的保護基團的步驟實質(zhì)上僅在步驟(2)中進行。

40、[6]根據(jù)[0-1]至[5]中任一項所述的方法，該方法不包括在步驟(2)前用哌啶作為單一堿處理第一肽的步驟。

41、[7]根據(jù)[0-1]至[5]中任一項所述的方法，該方法不包括在步驟(2)前將第一肽用在乙腈中作為共軛酸具有小于23的pka的單一堿來處理的步驟。

42、[8]根據(jù)[0-1]至[7]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑為固相樹脂溶脹能力為1.5ml/g或更高、2.0ml/g或更高、2.5ml/g或更高、3.0ml/g或更高、3.5ml/g或更高、或者4.0ml/g或更高的溶劑。

43、[9]根據(jù)[0-1]至[8]中任一項所述的方法，其中由步驟(2)獲得的第一肽的至少一部分為氨基甲酸鹽的形式。

44、[10]根據(jù)[9]所述的方法，其中氨基甲酸鹽是在乙腈中作為共軛酸的具有23或更大的pka的堿的鹽。

45、[11]根據(jù)[9]或[10]所述的方法，其中氨基甲酸鹽是與選自由脒、胍和磷腈組成的組中的至少一種堿的鹽。

46、[12]根據(jù)[9]至[11]中任一項所述的方法，其中氨基甲酸鹽是dbu鹽、tmg鹽、hp1(dma)鹽、mtbd鹽、p1-tbu鹽或p2-et鹽。

47、[13]根據(jù)[9]至[12]中任一項所述的方法，其中在步驟(2)中，氨基甲酸鹽與脫羧過程中另外形成的胺形式的摩爾比(氨基甲酸鹽/胺形式)是0.6或更大、0.8或更大、1.0或更大、2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、4.6或更大、5.0或更大、6.0或更大、8.0或更大或者10.0或更大。

48、[13-1]根據(jù)[9]至[12]中任一項所述的方法，其中在步驟(2)中，氨基甲酸鹽與脫羧過程中另外形成的胺形式的摩爾比(氨基甲酸鹽/胺形式)是0.6或更大、0.8或更大、1.0或更大、2.0或更大、3.0或更大、4.0或更大、4.6或更大、5.0或更大、6.0或更大、8.0或更大或者10.0或更大，其由1h-nmr中的質(zhì)子積分比確定。

49、[14]根據(jù)[0-1]至[13]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑含有50v/v％或更多的亞砜溶劑。

50、[15]根據(jù)[0-1]至[14]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑含有70v/v％或更多的亞砜溶劑。

51、[16]根據(jù)[0-1]至[15]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑含有90v/v％或更多的亞砜溶劑。

52、[17]根據(jù)[0-1]至[16]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑進一步含有選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑、磷酸酯溶劑、酰胺溶劑、脲溶劑和砜溶劑組成的組中的一者或多者。

53、[18]根據(jù)[0-1]至[16]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑進一步含有選自由酰胺溶劑、脲溶劑和砜溶劑組成的組中的一者或多者。

54、[19]根據(jù)[0-1]至[13]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑由亞砜溶劑組成。

55、[20]根據(jù)[0-1]至[19]中任一項所述的方法，其中亞砜溶劑是選自由dmso、二乙基亞砜、甲基乙基亞砜和甲基苯基亞砜組成的組中的一者或多者。

56、[21]根據(jù)[0-1]至[19]中任一項所述的方法，其中亞砜溶劑是dmso。

57、[22]根據(jù)[0-1]至[21]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的堿是選自由脒、胍和磷腈組成的組中的至少一者。

58、[23]根據(jù)[0-1]至[22]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的堿是選自由dbu、mtbd、tmg、p1tbu、p2et和hp1(dma)組成的組中的至少一者。

59、[24]根據(jù)[0-1]至[23]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的堿是dbu、mtbd、tmg、p1tbu、p2et或hp1(dma)。

60、[25]根據(jù)[0-1]至[23]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的堿是(i)dbu與哌啶的組合或(ii)dbu與mtbd、hp1(dma)、p1tbu或p2et的組合。

61、[25-1]根據(jù)[0-1]至[25]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中，溶劑是dmso，并且堿是dbu。

62、[25-2]根據(jù)[0-1]至[25]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中，溶劑是dmso，并且堿是tmg。

63、[25-3]根據(jù)[0-1]至[25]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中，溶劑是dmso，并且堿是dbu和哌啶的組合。

64、[26]根據(jù)[0-1]至[25]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的堿以1至8v/v％的濃度包含在溶劑中。

65、[27]根據(jù)[0-1]至[26]中任一項所述的方法，其中步驟(2)進一步包括使溶劑與co2接觸的步驟。

66、[28]根據(jù)[1]至[27]中任一項所述的方法，其中步驟(2)進一步包括將溶劑用co2鼓泡的步驟。

67、[29]根據(jù)[0-1]至[26]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑是預先與co2接觸的溶劑。

68、[30]根據(jù)[0-1]至[26]中任一項所述的方法，其中步驟(2)中的溶劑是預先用co2鼓泡的溶劑。

69、[31]根據(jù)[0-1]至[30]中任一項所述的方法，其中重復步驟(2)兩次或更多次。

70、[32]根據(jù)[31]所述的方法，其中當步驟(2)重復兩次或更多次時，在步驟(2)的重復中使用相同的溶劑。

71、[33]根據(jù)[31]所述的方法，其中當步驟(2)重復兩次或更多次時，在步驟(2)的重復中使用不同的溶劑。

72、[34]根據(jù)[31]至[33]中任一項所述的方法，其中當步驟(2)重復兩次或更多次時，在步驟(2)的重復中使用相同的堿。

73、[35]根據(jù)[31]至[33]中任一項所述的方法，其中當步驟(2)重復兩次或更多次時，在步驟(2)的重復中使用不同的堿。

74、[36]根據(jù)[31]至[35]中任一項所述的方法，當步驟(2)重復兩次或更多次時，該方法進一步包括在步驟(2)的重復之間排出溶液的步驟。

75、[37]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[36]中任一項所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物是具有保護基團的氨基酸、具有保護基團的第二肽、c1-c8烷基羧酸或c6-c10芳基羧酸；或者具有保護基團的氨基酸、具有保護基團的第二肽、c1-c8烷基羧酸或c6-c10芳基羧酸的活性酯；或者具有保護基團的氨基酸、具有保護基團的第二肽、c1-c8烷基羧酸或c6-c10芳基羧酸的酰鹵；其中c1-c8烷基羧酸和c6-c10芳基羧酸任選地被一個或多個獨立地選自由烯基、炔基、烷氧基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、芳基烷基、雜芳基烷基、鹵素、硝基、二烷基氨基、氰基、烷氧基羰基和二烷基氨基羰基組成的組的取代基取代。

76、[38]根據(jù)[37]所述的方法，其中保護基團是氨基甲酸酯型保護基團、磺?；捅Ｗo基團或?；捅Ｗo基團。

77、[39]根據(jù)[38]所述的方法，其中氨基甲酸酯型保護基團是含有fmoc骨架的保護基團、alloc、teoc、boc或cbz，磺酰型保護基是ns，并且?；捅Ｗo基團為tfa。

78、[40]根據(jù)[37]所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物為c1-c8烷基羧酸或c6-c10芳基羧酸、或其活性酯或酰鹵，并且c1-c8烷基羧酸c6-c10芳基羧酸任選地被一個或多個獨立地選自由烯基、炔基、烷氧基、環(huán)烷基和鹵素組成的組的取代基取代。

79、[41]根據(jù)[37]所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物是任選被一個或多個獨立地選自由烯基、炔基、烷氧基、環(huán)烷基和鹵素組成的組的取代基取代的c1-c8烷基羧酸或其活性酯或酰鹵。

80、[42]根據(jù)[37]所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物是c1-c8烷基羧酸或其活性酯或酰鹵。

81、[43]根據(jù)[0-1]至[42]中任一項所述的方法，其中第一肽含有2至30、2至20、2至15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2個氨基酸殘基。

82、[44]根據(jù)[0-1]至[43]中任一項所述的方法，其中第一肽為二肽。

83、[45]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[44]中任一項所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物是具有保護基團的氨基酸或第二肽；或者具有保護基團的氨基酸或第二肽的活性酯；或者具有保護基團的氨基酸或第二肽的酰鹵；其中，第一肽和/或具有保護基團的第二肽含有一個或多個n-取代的氨基酸，和/或具有保護基團的氨基酸是n-取代的氨基酸。

84、[46]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[45]中任一項所述的方法，其中羧酸或羧酸類似物是具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸或第二肽；或者具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸或第二肽的活性酯；或者具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸或第二肽的酰鹵；其中，第一肽和/或具有含有fmoc骨架的保護基團的第二肽含有一個或多個n-取代的氨基酸和/或具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸是n-取代的氨基酸。

85、[47]根據(jù)[0-1]至[46]中任一項所述的方法，其中第一肽的n末端起第二個殘基處的氨基酸是n-取代的氨基酸。

86、[48]根據(jù)[46]或[47]所述的方法，其中n-取代的氨基酸是n-烷基氨基酸。

87、[49]根據(jù)[46]或[47]所述的方法，其中n-取代的氨基酸是n-c1-c6烷基氨基酸。

88、[50]根據(jù)[46]或[47]所述的方法，其中n-取代的氨基酸是n-甲基氨基酸。

89、[51]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[50]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的縮合劑是鹽的形式，并且其抗衡陰離子是pf6-或bf4-，或者縮合劑是碳二亞胺縮合劑。

90、[52]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[50]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的縮合劑是鹽的形式，并且其抗衡陰離子為pf6-或bf4-。

91、[53]根據(jù)[52]所述的方法，其中步驟(3)中的縮合劑含有選自由pyoxim、pyaop、pybop、comu、hatu、hbtu、hctu、tdbtu、hotu、tatu、tbtu、tctu和totu組成的組的至少一者。

92、[54]根據(jù)[52]或[53]所述的方法，其中步驟(3)中的縮合劑是pyoxim、pyaop、pybop、comu、hatu、hbtu、hctu、tdbtu、hotu、tatu、tbtu、tctu或totu。

93、[55]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[54]中任一項所述的方法，其中步驟(3)在存在堿的情況下進行。

94、[56]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[55]中任一項所述的方法，其中步驟(3)在存在水作為共軛酸中pka為5至12的堿的情況下進行的。

95、[57]根據(jù)[55]或[56]所述的方法，其中步驟(3)中的堿是dipea。

96、[58]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[51]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的縮合劑是碳二亞胺縮合劑。

97、[59]根據(jù)[58]所述的方法，其中碳二亞胺縮合劑是選自由以下組成的組中的至少一者：二異丙基碳二亞胺(dic)、二仲丁基碳二亞胺(dsbc)、1-叔丁基-3-乙基碳二亞胺(tbec)、二叔丁基碳二亞胺(dtbc)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(edc)。

98、[60]根據(jù)[58]或[59]所述的方法，其中碳二亞胺縮合劑是二異丙基碳二亞胺(dic)或二仲丁基碳二亞胺(dsbc)。

99、[61]根據(jù)[1]、[51]和[58]至[60]中任一項所述的方法，其中步驟(3)在添加劑存在下進行。

100、[62]根據(jù)[61]所述的方法，其中添加劑是選自由hoat、hobt、hoobt、oxyma和oxyma-b組成的組中的至少一者。

101、[63]根據(jù)[62]所述的方法，其中添加劑是hoat或oxyma。

102、[64]根據(jù)[0-1]至[63]中任一項所述的方法，其中含有fmoc骨架的保護基團由下式(1)表示：

103、[chem.1]

104、

105、其中

106、r1至r8獨立地選自由以下組成的組：氫、c1-c8烷基、c1-c8氟烷基、鹵素、磺基和三甲基甲硅烷基；并且

107、r9至r10各自為氫或甲基。

108、[65]根據(jù)[64]所述的方法，其中含有fmoc骨架的保護基團為fmoc(2,7tb)基團、fmoc(1me)基團、fmoc(2f)基團、fmoc(2,7br)、mio-fmoc基團、dio-fmoc基團、tdf-fmoc基團、fmoc(2tms)基團、fmoc(2so3h)基團、sm-fmoc基團或rm-fmoc基團。

109、[66]根據(jù)[65]所述的方法，其中含有fmoc骨架的保護基團是fmoc基團。

110、[67]根據(jù)[0-1]、[0-3]至[0-6]和[3]至[66]所述的方法，該方法進一步包括在步驟(2)和步驟(3)之間處理步驟(2)中的混合物的步驟(處理步驟)。

111、[67-1]根據(jù)[67]所述的方法，其中處理步驟是使酸或鹽與混合物接觸的步驟。

112、[67-2]根據(jù)[67]所述的方法，其中處理步驟是向混合物中添加含有酸或鹽的亞砜溶劑溶液的步驟。

113、[67-3]根據(jù)[67]所述的方法，其中處理步驟是向混合物中添加含有酸或鹽的dmso溶液的步驟。

114、[68]根據(jù)[67]所述的方法，其中處理步驟是洗滌固相合成樹脂的步驟。

115、[68-1]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括用含有亞砜溶劑的溶劑洗滌的步驟。

116、[68-2]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括用含有dmso的溶劑洗滌的步驟。

117、[68-3]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括用dmso洗滌的步驟。

118、[68-4]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括用含有堿的亞砜溶劑溶液洗滌的步驟。

119、[68-5]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括用含有堿的dmso溶液洗滌的步驟。

120、[68-6]根據(jù)[68-4]或[68-5]所述的方法，該方法包括用含有為選自由dipea、三乙胺、2,6-二甲基吡啶和2,4,6-三甲基吡啶組成的組中的至少一者的堿的dmso溶液洗滌的步驟。

121、[68-7]根據(jù)[68-1]至[68-6]中任一項所述的方法，其中洗滌步驟進行兩次、三次、四次、五次或六次。

122、[68-8]根據(jù)[68]至[68-7]中任一項所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌中用含有酸或鹽的亞砜溶劑溶液進行洗滌的步驟。

123、[68-8-1]根據(jù)[68-8]所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有酸的亞砜溶劑溶液進行洗滌的步驟。

124、[68-8-2]根據(jù)[68-8]所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有酸的dmso溶液進行洗滌的步驟。

125、[68-8-3]根據(jù)[68-8]所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有鹽的亞砜溶劑溶液進行洗滌的步驟。

126、[68-8-4]根據(jù)[68-8]所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有鹽的dmso溶液進行洗滌的步驟。

127、[68-9]根據(jù)[68]至[68-7]中任一項所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有酸和鹽的亞砜溶劑溶液進行洗滌的步驟。

128、[68-10]根據(jù)[68]至[68-7]中任一項所述的方法，該方法包括在洗滌步驟中的一次或多次洗滌操作中用含有酸和鹽的dmso溶液進行洗滌的步驟。

129、[68-11]根據(jù)[68-8]至[68-11]中任一項所述的方法，其中洗滌步驟中的洗滌操作的次數(shù)為1。

130、[69]根據(jù)[67-1]至[68-3]和[68-8]至[68-11]中任一項所述的方法，其中酸是選自由hoat、oxyma、4-硝基苯酚、hoobt和鹽酸組成的組中的至少一者。

131、[69-1]根據(jù)[67-1]至[68-3]和[68-8]至[68-11]中任一項所述的方法，其中酸是選自由hoat、oxyma、4-硝基苯酚和hoobt組成的組中的至少一者。

132、[69-2]根據(jù)[67-1]至[68-3]和[68-8]至[68-11]中任一項所述的方法，其中鹽是選自由hoat、oxyma、4-硝基苯酚、hoobt和鹽酸組成的組中的酸和選自由dipea、三乙胺、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-三甲基吡啶和吡啶組成的組中的堿形成的鹽。

133、[69-3]根據(jù)[67-1]至[68-3]和[68-8]至[68-11]中任一項所述的方法，其中鹽是吡啶鹽酸鹽。

134、[69-4]根據(jù)[68-9]或[68-10]所述的方法，其中堿是選自由dipea、三乙胺、2,6-二甲基吡啶、2,4,6-二甲基吡啶和吡啶組成的組中的至少一者。

135、[70]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括以下步驟：

136、i)使用預先與co2接觸的溶劑洗滌固相合成樹脂；和/或

137、ii)使用預先未與co2接觸的溶劑洗滌固相合成樹脂。

138、[71]根據(jù)[68]所述的方法，其中洗滌步驟包括以下步驟：

139、i)使用預先用co2鼓泡的溶劑洗滌固相合成樹脂；和/或

140、ii)使用未預先用co2鼓泡的溶劑洗滌固相合成樹脂。

141、[72]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[71]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑與步驟(2)中的溶劑相同。

142、[73]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[72]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑是其中縮合劑是可溶的溶劑。

143、[74]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[73]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑含有選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑和磷酸酯溶劑組成的組中的至少一者。

144、[75]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[73]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑含有50v/v％或更多的選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑和磷酸酯溶劑組成的組中的至少一者。

145、[76]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[73]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑含有70v/v％或更多的選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑和磷酸酯溶劑組成的組中的至少一者。

146、[77]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[73]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑含有90v/v％或更多的選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑和磷酸酯溶劑組成的組中的至少一者。

147、[78]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[73]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑由選自由芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑和磷酸酯溶劑組成的組中的至少一者組成。

148、[79]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[78]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中的溶劑是芳香烴溶劑、鹵素溶劑、醚溶劑、酰胺溶劑、亞砜溶劑、砜溶劑、脲溶劑、酯溶劑、酮溶劑、碳酸酯溶劑或磷酸酯溶劑。

149、[80]根據(jù)[74]至[79]中任一項所述的方法，其中芳香烴溶劑是選自由苯、甲苯、二甲苯、氯苯、1,2-二氯苯、溴苯、苯甲醚、乙苯、硝基苯和異丙基苯組成的組中的一者或多者,

150、該鹵素溶劑是選自由二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷和四氯化碳組成的組中的一者或多者，

151、該醚溶劑是選自由乙醚、四氫呋喃、2-甲基四氫呋喃、環(huán)戊基甲基醚、4-甲基四氫吡喃、1,3-二氧戊環(huán)、1,4-二噁烷、1,2-二甲氧基乙烷、二異丙醚、叔丁基甲基醚、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚和四甘醇二甲醚組成的組中的一者或多者，

152、該酰胺溶劑是選自由dmf、nmp、dma、nep、nbp和甲酰胺組成的組中的一者或多者，

153、該亞砜溶劑是選自由dmso和甲基苯基亞砜組成的組中的一者或多者，

154、該砜溶劑是選自由二苯砜、二甲砜、環(huán)丁砜、3-甲基環(huán)丁砜、乙基甲基砜和乙基異丙基砜組成的組中的一者或多者，

155、該脲溶劑是選自由dmi和dmpu組成的組中的一者或多者，

156、該酯溶劑是選自由乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、乙酸異丙酯、乙酸異丁酯、乙酸戊酯和γ-戊內(nèi)酯組成的組中的一者或多者，

157、該酮溶劑是選自由丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮、環(huán)己酮、二乙基酮和環(huán)戊酮組成的組中的一者或多者，

158、該碳酸酯溶劑是選自由碳酸二甲酯、碳酸二乙酯和碳酸二丁酯組成的組中的一者或多者，并且

159、該磷酸酯溶劑是選自由磷酸三甲酯、磷酸三乙酯和磷酸三丁酯組成的組中的一者或多者。

160、[81]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[80]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中使用的羧酸是具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸或第二肽，并且氨基酸或第二肽中的含有fmoc骨架的保護基團與步驟(1)中使用的第一肽中的含有fmoc骨架的保護基團相同或不同。

161、[82]根據(jù)[0-1]、[0-4]至[0-6]和[3]至[81]中任一項所述的方法，其中步驟(3)中使用的羧酸類似物是具有保護基團的氨基酸、具有保護基團的第二肽、c1-c8烷基羧酸或c6-c10芳基羧酸的酰鹵，并且具有含有fmoc骨架的保護基團的氨基酸的羧基基團、具有含有fmoc骨架的保護基團的第二肽的c末端的羧基基團、c1-c8烷基羧酸的羧基基團或c6-c10芳基羧酸的羧基基團轉(zhuǎn)化為酰鹵基團。

162、盡管[1]至[82]的方法是通過固相法生產(chǎn)肽的方法，但這些方法也可以應用于通過液相法生產(chǎn)肽的方法。即，本發(fā)明的另一方面提供以下的[83]至[84-1]。[83]至[84-1]所述的方法可以是[3]至[82]所述的方法，該方法包括除通過固相法的生產(chǎn)方法中固有的特征之外的特征。

163、[83]一種用于通過液相法生產(chǎn)肽的方法，該方法包括以下步驟：

164、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團的第一肽；

165、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿處理第一肽；以及

166、(3)在步驟(2)后，在溶劑中，在存在或不存在縮合劑的情況下，將所述第一肽與羧酸或羧酸類似物縮合，以得到第三肽。

167、[84]一種用于減少通過液相法的肽生產(chǎn)中形成的二酮哌嗪雜質(zhì)和/或6元環(huán)脒骨架化合物雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

168、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團且負載于固相上的第一肽；和

169、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理所述第一肽。

170、[84-1]一種用于減少在通過液相法的肽生產(chǎn)中形成的選自由二酮哌嗪雜質(zhì)、6元環(huán)狀脒骨架化合物雜質(zhì)和二聚脲化合物雜質(zhì)組成的組中的至少一種雜質(zhì)的量的方法，該方法包括以下步驟：

171、(1)提供具有含有fmoc骨架的保護基團且負載于固相上的第一肽；以及

172、(2)在步驟(1)后，在含有亞砜溶劑的溶劑中，用至少包括在乙腈中其共軛酸具有23或更大的pka的堿的一種或多種堿來處理所述第一肽。

173、該方法能夠高效地獲得所需的肽。

174、發(fā)明效果

175、在肽合成中，本發(fā)明確保即使存在其中在常規(guī)條件下由于形成二酮哌嗪和/或形成6元環(huán)脒骨架化合物而不能充分進行所需的延長反應的氨基酸序列，也可以顯著減少此類雜質(zhì)的形成，從而可以有效地延長肽鏈以獲得具有所需氨基酸序列的肽。由于本發(fā)明的方法不需要使用通用性較低的諸如alloc的特殊保護基團，并且在反應操作方面沒有限制，從而實現(xiàn)了極短的反應時間，因此該方法是具有通用性強、可放大的切實可行的合成方法。