本發(fā)明涉及生物測序領(lǐng)域，尤其涉及測序元件及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，病原檢測，疾病診斷中大量dna測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，對測序通量的要求日漸提高。作為新冠核酸檢測及后續(xù)支持疫苗研發(fā)的測序技術(shù)，此時對測序通量有了更高的要求。為了同時更快得到更多樣本病毒的核酸序列，跟蹤變異過程，輔助疫苗開發(fā)，我們將大量樣本混合在一起進(jìn)行文庫構(gòu)建和測序，這就需要對每個樣本都加上可識別的標(biāo)簽序列(barcode)，便于后續(xù)測序數(shù)據(jù)的分析。

2、轉(zhuǎn)座酶是由轉(zhuǎn)座子編碼，識別轉(zhuǎn)座子兩端的特異序列，通過結(jié)合到轉(zhuǎn)座子末端，以剪貼重新整合等機制，執(zhí)行轉(zhuǎn)座功能的一類酶。在測序技術(shù)飛速發(fā)展的時代，轉(zhuǎn)座酶的應(yīng)用，使用于下一代測序(next?generation?sequencing，ngs)的文庫制備技術(shù)有了更大的進(jìn)步。轉(zhuǎn)座酶利用自身剪切連接的功能在雙鏈dna上插入特定接頭序列，實現(xiàn)了將文庫構(gòu)建過程中的打斷，末端修復(fù)，加“a”，加接頭四步并為一步的重大突破，大大減少了文庫構(gòu)建的時間，簡化了實驗操作流程，降低了建庫成本，同時也降低了待測樣本建庫起始量的要求。目前用于文庫構(gòu)建的轉(zhuǎn)座酶有mu轉(zhuǎn)座酶、mos1轉(zhuǎn)座酶、哈氏弧菌(vibrio?harvey)轉(zhuǎn)座酶，tn5轉(zhuǎn)座酶等，其中應(yīng)用最為廣泛的是tn5轉(zhuǎn)座酶。2011年1月，illumina收購了epicentre生物技術(shù)公司，將其擁有的ez-tn5專利產(chǎn)品整合推出了nextera系列商業(yè)建庫試劑盒。tn5轉(zhuǎn)座子由一個中心區(qū)域和兩個側(cè)翼組成，每個側(cè)翼包括19bp的outside?end(oe)和inside?end(ie)末端序列，其中oe是轉(zhuǎn)座酶的識別結(jié)合位點。盡管tn5插入具有隨機性，穩(wěn)定性，插入位點容易確認(rèn)的特點，但是分析測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)tn5插入位置的前9bp仍有偏好性，對tn5轉(zhuǎn)座酶的部分氨基酸位點進(jìn)行改造，降低了插入偏好性，但仍未完全消除。本技術(shù)方案以tn5轉(zhuǎn)座酶為例提供了一種篩選轉(zhuǎn)座酶的識別結(jié)合位點的方法，以期改善插入位置偏好性的問題。該技術(shù)方案也可以用于其他序列篩選，如混合文庫構(gòu)建或混合測序中樣品標(biāo)簽序列的篩選。

3、連接酶是分子生物學(xué)實驗中廣泛應(yīng)用的一種工具酶。1967年，dna連接酶在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，該酶利用atp或nad水解產(chǎn)生的能量催化dna鏈的5；-磷酸與另一dna鏈的3；-羥基生成磷酸二酯鍵，將dna鏈中的切口連接。目前應(yīng)用最多的是t4?dna連接酶，具有連接粘性末端和平末端的作用，在各種許多類型的文庫構(gòu)建中，是不可缺少的一種酶。

4、以往的技術(shù)均是通過構(gòu)建質(zhì)粒，細(xì)菌轉(zhuǎn)染，dna提取等一系列的復(fù)雜的方法研究tn5轉(zhuǎn)座酶識別序列的功能。

5、對于樣品標(biāo)簽序列的篩選，是通過計算機設(shè)定各種規(guī)則參數(shù)，如堿基平衡的原則等，輸出可能可以作為標(biāo)簽使用的序列，人工合成序列，然后進(jìn)行一輪又一輪的文庫構(gòu)建實驗，通過均一的文庫產(chǎn)量，均一的插入片段等文庫質(zhì)控指標(biāo)后，對文庫測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，確定可以準(zhǔn)確區(qū)分每個樣本，并且每個樣本下的數(shù)據(jù)量均一，最后才列入標(biāo)簽序列使用。這種篩選方法往往進(jìn)行一輪文庫構(gòu)建和測序是不夠的，通常需要幾輪的篩選確認(rèn)，對時間人力成本的消耗較大。

6、在現(xiàn)有技術(shù)中，篩選轉(zhuǎn)座酶識別序列需要經(jīng)過復(fù)雜的實驗流程，耗時長，成本高，還不一定能得到較好的結(jié)果，難以準(zhǔn)確確定轉(zhuǎn)座酶的識別序列，無法快速用于文庫構(gòu)建等技術(shù)方案中。篩選標(biāo)簽序列的方法需要進(jìn)行較長的實驗流程，層層分析篩選，操作復(fù)雜，耗時長，成本高，通量也低，在當(dāng)下這個高通量測序的時代，無法一次性篩選大量的標(biāo)簽序列，難以迅速應(yīng)用到文庫構(gòu)建測序中。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了測序元件及其應(yīng)用。本發(fā)明提出的序列篩選方案，可以全面評估轉(zhuǎn)座酶識別序列的偏好性的問題，為選擇更合適的轉(zhuǎn)座酶識別序列提供幫助。通過一次性篩選出大量準(zhǔn)確，并且可以迅速用于文庫構(gòu)建和測序的標(biāo)簽序列，大大提高了序列篩選的通量，簡化了操作流程，節(jié)省了時間，降低了篩選成本。

2、為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了測序元件，包括如下任意項：

4、(i)、轉(zhuǎn)座復(fù)合體和引物組；所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體包括轉(zhuǎn)座酶和轉(zhuǎn)座子；和/或

5、(ii)、連接酶、引物組和核酸接頭分子；

6、所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體包括轉(zhuǎn)座復(fù)合體1、轉(zhuǎn)座復(fù)合體2或轉(zhuǎn)座復(fù)合體3中的一種或多種；

7、所述轉(zhuǎn)座子包括轉(zhuǎn)座子1、轉(zhuǎn)座子2、轉(zhuǎn)座子3或轉(zhuǎn)座子4中的一種或多種；

8、所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體1包括所述轉(zhuǎn)座酶和所述轉(zhuǎn)座子1；

9、所述轉(zhuǎn)座子1包括轉(zhuǎn)座子1-f和轉(zhuǎn)座子1-r；

10、所述轉(zhuǎn)座子1-f包括引物結(jié)合片段、標(biāo)簽片段、連接片段和所述轉(zhuǎn)座子1-r的結(jié)合片段；

11、所述引物結(jié)合片段與所述引物組的上游引物序列相同；

12、所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體2包括所述轉(zhuǎn)座酶和所述轉(zhuǎn)座子2；

13、所述轉(zhuǎn)座子2由載體連接片段、延伸引物片段反應(yīng)制得；

14、所述載體連接片段包括待篩選的轉(zhuǎn)座酶識別片段、所述延伸引物片段的互補片段和含有a的片段；

15、所述延伸引物片段與所述引物組的下游引物序列相同；

16、所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體3包括所述轉(zhuǎn)座酶、所述轉(zhuǎn)座子3和所述轉(zhuǎn)座子4；

17、所述轉(zhuǎn)座子3由轉(zhuǎn)座子3-f和轉(zhuǎn)座子1-r反應(yīng)制得；

18、所述轉(zhuǎn)座子4由轉(zhuǎn)座子4-f和轉(zhuǎn)座子1-r反應(yīng)制得；

19、所述轉(zhuǎn)座子3-f包括引物結(jié)合片段、待篩選的標(biāo)簽片段、連接片段和所述轉(zhuǎn)座子1-r的結(jié)合片段；所述引物結(jié)合片段與所述引物組的上游引物序列相同；

20、所述轉(zhuǎn)座子4-f包括延伸引物片段和所述轉(zhuǎn)座子1-r的結(jié)合片段；

21、所述核酸接頭分子包括接頭-top和接頭-bottom；

22、所述接頭-top包括引物結(jié)合片段、待篩選的標(biāo)簽片段和連接片段；所述引物結(jié)合片段與所述引物組的上游引物序列相同；

23、所述接頭-bottom包括所述連接片段的互補片段和所述延伸引物片段的互補片段。

24、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述測序元件中，所述引物結(jié)合片段具有：

25、(7)、如seq?id?no:1所示的核苷酸序列；或

26、(8)、如(7)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(7)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

27、(9)、與(7)或(8)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

28、所述連接片段具有：

29、(10)、如seq?id?no:2所示的核苷酸序列；或

30、(11)、如(10)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(10)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

31、(12)、與(10)或(11)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

32、所述標(biāo)簽片段具有：

33、(13)、如seq?id?no:3所示的核苷酸序列；或

34、(14)、如(13)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(13)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

35、(15)、與(13)或(14)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

36、所述轉(zhuǎn)座子1-r具有：

37、(16)、如seq?id?no:4所示的核苷酸序列；或

38、(17)、如(16)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(16)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

39、(18)、與(16)或(17)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

40、所述載體連接片段具有：

41、(19)、如seq?id?no:5所示的核苷酸序列；或

42、(20)、如(19)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(19)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

43、(21)、與(19)或(20)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

44、所述延伸引物片段具有：

45、(22)、如seq?id?no:6所示的核苷酸序列；或

46、(23)、如(22)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(22)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

47、(24)、與(22)或(23)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列；和/或

48、所述含有a的片段具有：

49、(25)、如seq?id?no:7所示的核苷酸序列；或

50、(26)、如(25)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(25)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

51、(27)、與(25)或(26)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列。

52、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:1的序列為：cgatccttggtgatccgtcagtgc。

53、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:2的序列為：ttgtcttcct。

54、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:3的序列為：cggattgccg。

55、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:4的序列為：pho-ctgtctcttatacacatct。

56、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:5的序列為：p-nnnnnnnnn?nnnnnnnnnntctgctgagtcgagaacgtctcduducgaaaaaa-bioti?n。

57、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:6的序列為：gagacgttct?cgactcagcaga。

58、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:7的序列為：duducgaaaa?aa。

59、本發(fā)明還提供了上述測序元件在文庫構(gòu)建和/或測序中的應(yīng)用。

60、本發(fā)明還提供了上述測序元件在篩選標(biāo)簽片段和/或轉(zhuǎn)座酶識別片段中的應(yīng)用。

61、本發(fā)明還提供了上述測序元件中的所述轉(zhuǎn)座子的制備方法，包括以下步驟：

62、s1：取所述轉(zhuǎn)座子1-f和所述轉(zhuǎn)座子1-r混合，擴增后，獲得所述轉(zhuǎn)座子1；和/或

63、s2：取所述載體連接片段和所述延伸引物片段混合，擴增后，獲得所述轉(zhuǎn)座子2；和/或

64、s3：取所述轉(zhuǎn)座子3-f和所述轉(zhuǎn)座子1-r混合，擴增后，獲得所述轉(zhuǎn)座子3；和/或

65、s4：取所述轉(zhuǎn)座子4-f和所述轉(zhuǎn)座子1-r混合，擴增后，獲得所述轉(zhuǎn)座子4；

66、s1～s4不分先后順序。

67、本發(fā)明還提供了上述測序元件中的所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體的制備方法，包括以下步驟：

68、s1：取所述轉(zhuǎn)座酶包埋進(jìn)所述轉(zhuǎn)座子1中，獲得所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體1；和/或

69、s2：取所述轉(zhuǎn)座酶2包埋進(jìn)所述轉(zhuǎn)座子2中，獲得所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體2；和/或

70、s3：取所述轉(zhuǎn)座酶、所述轉(zhuǎn)座子3和所述轉(zhuǎn)座子4混合，獲得所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體3；

71、s1～s3不分先后順序。

72、本發(fā)明還提供了基因組片段化的方法，取預(yù)處理的樣品酶切打斷后，獲得片段化的基因組；

73、所述預(yù)處理包括轉(zhuǎn)座反應(yīng)、酶切反應(yīng)和/或超聲反應(yīng)中的一種或多種；

74、當(dāng)所述預(yù)處理為轉(zhuǎn)座反應(yīng)時，所述轉(zhuǎn)座反應(yīng)采用上述測序元件中的所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體1和/或轉(zhuǎn)座復(fù)合體3；

75、上述方法中，所述酶切打斷采用酶切打斷緩沖液；

76、所述酶切打斷采用上述測序元件中所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體2。所述酶切打斷緩沖液包括：50mm?hepes-koh、50％dmf(v/v)和25mm?mgcl2。

77、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述方法中，當(dāng)所述預(yù)處理為酶切反應(yīng)和/或超聲反應(yīng)時，所述酶切打斷后還包括：末端修復(fù)、加a、加接頭的步驟；

78、所述加接頭采用上述測序元件中的所述核酸接頭分子。

79、本發(fā)明還提供了基因組的富集方法，取上述方法獲得的所述片段化的基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)后，獲得富集的基因組。

80、本發(fā)明還提供了目的核酸的篩選方法，基于上述測序元件，測序，獲得目的核酸。

81、本發(fā)明提供了標(biāo)簽片段的篩選方法，取待測樣品片段化后、聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、純化，測序，獲得標(biāo)簽片段；

82、所述片段化包括轉(zhuǎn)座反應(yīng)、酶切反應(yīng)和/或超聲反應(yīng)中的一種或多種；

83、當(dāng)所述片段化為轉(zhuǎn)座反應(yīng)時，所述轉(zhuǎn)座反應(yīng)采用上述測序元件的所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體3。

84、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述篩選方法，當(dāng)所述片段化為酶切反應(yīng)和/或超聲反應(yīng)時，所述片段化后，所述聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)前還包括：末端修復(fù)、加a、加接頭的步驟；所述加接頭采用上述測序元件中的所述核酸接頭分子。

85、本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)座酶識別片段的篩選方法，取第一片段化的待測樣品，第二片段化，聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、純化、成環(huán)后，獲得所述轉(zhuǎn)座酶識別片段；

86、所述第一片段化采用上述測序元件中的所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體1；

87、所述第二片段化采用上述測序元件中的所述轉(zhuǎn)座復(fù)合體2。

88、本發(fā)明提供了標(biāo)簽識別片段，具有：

89、(1)、如seq?id?no:8所示的核苷酸序列；或

90、(2)、如(1)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(1)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

91、(3)、與(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列。

92、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:8的序列為：cggattgccg。

93、本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)座酶識別片段，其具有：

94、(4)、如seq?id?no:9～seq?id?no:11所示的核苷酸序列；或

95、(5)、如(4)所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

96、(6)、與(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有40％同一性的核苷酸序列。

97、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:9的序列為：ctggctcttat?acataggt。

98、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:10的序列為：ctggctctta?tacagagtt。

99、在本發(fā)明的一些實施方案中，seq?id?no:11的序列為：ctggctctta?tacaaatgt。

100、本發(fā)明還提供了上述標(biāo)簽識別片段和/或上述轉(zhuǎn)座酶識別片段在文庫構(gòu)建和/或測序中的應(yīng)用。

101、本發(fā)明還提供了上述標(biāo)簽識別片段和/或上述轉(zhuǎn)座酶識別片段在篩選標(biāo)簽片段和/或轉(zhuǎn)座酶識別片段中的應(yīng)用。

102、本發(fā)明還提供了上述標(biāo)簽識別片段和/或上述轉(zhuǎn)座酶識別片段在檢測核酸結(jié)合蛋白的偏好性中的應(yīng)用。

103、在本發(fā)明的一些實施方案中，上述應(yīng)用中，所述核酸結(jié)合蛋白包括：連接酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶或解旋酶中的一種或多種。