本發(fā)明屬于生物酶催化領(lǐng)域，具體涉及一種烯酮還原酶及用其制備布瓦西坦中間體的方法，以及具有如式4所示結(jié)構(gòu)的化合物、制備其的方法及其用途。

背景技術(shù)：

1、布瓦西坦(brivaracetam)是比利時(shí)ucb公司開(kāi)發(fā)的一種新型抗癲癇藥，對(duì)突觸小泡蛋白2a(sv2a)具有很高的親和力，用于治療成人和16歲以上青少年癲癇患者的部分發(fā)作、伴有或不伴有繼發(fā)性全身發(fā)作的輔助治療。(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮是其重要的中間體。

2、

3、(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮

4、(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮有多種制備方法，如wo2016191435以(r)-環(huán)氧氯丙烷為原料，經(jīng)三步反應(yīng)制得(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮，(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮再進(jìn)一步制得布瓦西坦。

5、

6、cn106588741a以(r)-3-甲氧基羰基己酸為原料，經(jīng)環(huán)化制得(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮，(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮再經(jīng)開(kāi)環(huán)，取代，環(huán)化可制得布瓦西坦。

7、

8、但以上都是化學(xué)方法，且都采用手性原料，成本較高。另外,因?yàn)槊复呋膶?zhuān)一性和高催化效率，酶催化制備(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮也得到了青睞。

9、烯酮還原酶為nad(p)h依賴的氧化還原酶，可以催化活化的碳碳雙鍵不對(duì)稱還原，從而對(duì)映選擇性地合成目標(biāo)產(chǎn)物。目前利用烯酮還原酶合成(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法多以4-正丙基-2(5h)-呋喃酮為底物，如：

10、cn111154735b提供了利用來(lái)源于假絲酵母(candida?castelii)的烯酮還原酶催化化學(xué)合成的4-正丙基-2(5h)-呋喃酮發(fā)生還原反應(yīng)制備(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法，30℃反應(yīng)24h，目標(biāo)產(chǎn)物ee值為99.4％。但是該方法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)。

11、cn113444702b公開(kāi)了一種來(lái)源于巴氏酵母(saccharomyces?pastorianus)的烯酮還原酶oye1(ncbi登錄號(hào)：q02899)的突變體oye296a，可催化4-丙基-2(5h)-呋喃酮的不對(duì)稱還原，底物轉(zhuǎn)化率大于99％，產(chǎn)物的ee值大于99％。但是該方法反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，且4-丙基-2(5h)-呋喃酮不易采購(gòu)，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

12、綜上，需要尋找一種效率更高、成本更低、更適合工業(yè)化生產(chǎn)的方法來(lái)催化制備(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中烯酮還原酶制備(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮中效率低、成本高或不適合工業(yè)化生產(chǎn)的缺陷，本發(fā)明提供了一種烯酮還原酶及用其制備布瓦西坦中間體的方法。本發(fā)明中不同來(lái)源的烯酮還原酶的單突變體或組合突變體與野生型相比，在生產(chǎn)布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮時(shí)，均體現(xiàn)出良好的對(duì)映選擇性和較高的轉(zhuǎn)化率，為工業(yè)化生產(chǎn)(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮提供了良好的策略。

2、為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明第一方面提供了一種烯酮還原酶，所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示的氨基酸序列至少存在氨基酸殘基w117或其同源位點(diǎn)的差異，或相對(duì)于與seq?id?no:1、seq?id?no:3或seq?id?no:5所示的氨基酸序列相比具有至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列至少存在氨基酸殘基w117或其同源位點(diǎn)的差異；其中117位置參照seq?id?no:1中的氨基酸殘基編號(hào)。本文中，同一性指進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)時(shí)獲得的序列一致的程度。同一性計(jì)算方法為：先確定作為比較基準(zhǔn)的氨基酸序列，然后將另一條氨基酸序列與作為比較基準(zhǔn)的氨基酸序列進(jìn)行序列一致性對(duì)比，同一性＝兩段氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)之后完全相同的氨基酸數(shù)目÷作為比較基準(zhǔn)的氨基酸序列中的氨基酸的總數(shù)目×100％。同源位點(diǎn)則是指氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)相對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。

3、在一些實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶選自以下：

4、(1)所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:1或seq?id?no:3所示的氨基酸序列存在選自氨基酸殘基w117a、w117s、w117p、w117g、w117v、w117c、w117r、w117e、w117k、w117l、w117i或w117t的差異；優(yōu)選地，其存在氨基酸殘基w117a的差異；

5、更優(yōu)選地，所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:1或seq?id?no:3所示的氨基酸序列還存在氨基酸殘基l37a、t38s/l、y83w和p296f的差異中的一種或多種，其中，37位置、38位置、83位置和296位置參照seq?id?no:1或seq?id?no:3中的氨基酸殘基編號(hào)；或，

6、(2)所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:5所示的氨基酸序列存在選自氨基酸殘基w103a、w103s、w103p、w103g、w103v、w103c、w103r、w103e、w103k、w103l、w103i或w103t的差異；優(yōu)選地，其存在氨基酸殘基w103a的差異；seq?id?n?o:5所示的氨基酸序列的w103與seqid?no:1或seq?id?no:3所示的氨基酸序列的w117為同源位點(diǎn)。本文中，同一位點(diǎn)的氨基酸殘基差異使用的“/”代表該位點(diǎn)有多種氨基酸殘基的選擇。

7、更優(yōu)選地，所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:5所示的氨基酸序列還存在氨基酸殘基l27a、t28s、y69w和e275f的差異中的一種或多種。本文中，seq?id?no:5所示的氨基酸序列的l27、t28、y69和e275分別與seq?id?no:1或seq?id?no:3所示的氨基酸序列的l37、t38、y83和p296為同源位點(diǎn)。

8、在一些較佳的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:1所示的氨基酸序列還存在氨基酸殘基p35c/e/a/l、m40a/f/l、i76l/v、l119i、r244a、s246t和i352l的差異中的一種或多種。

9、在一些具體的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:1所示的氨基酸序列存在選自以下組的氨基酸殘基的差異：

10、(1)w117n、w117s、w117q、w117p、w117g、w117d、w117v、w117c、w117e、w117y、w117k、w117l、w117i、w117t、w117m、w117h、w117f、w117r、p35c/l37a/t38s/y83w/w117v/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117s/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117p/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117t/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117g/p296f；

11、(2)w117a、y83w/w117a、w117a/p296f、p35c/w117a、p35l/w117a、t38s/w117a、t38l/w117a、t38s/y83w/w117a、y83w/w117a/p296f、t38s/y83w/w117a/p296f、p35a/t38s/y83w/w117a/p296f、l37a/t38s/y83w/w117a/p296f、t38s/y83w/w117a/r244a/p296f、l37a/t38s/y83w/w117a/p296f/i352l、p35e/l37a/t38s/y83w/w117a/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117a/p296f、p35c/l37a/t38s/m40a/y83w/w117a/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117a/s246t/p296f、p35c/l37a/t38s/m40a/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/m40l/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/m40f/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/i76l/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/i76v/y83w/w117a/l119i/p296f、p35c/l37a/t38s/y83w/w117a/l119i/s246t/p296f、p35c/l37a/t38s/m40a/w117a/p296f或p35c/l37a/t38s/m40a/w117a/l119i/p296f；或，

12、所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:3所示的氨基酸序列存在以下氨基酸殘基的差異：

13、w117a、y83w/w117a、t38s/y83w/w117a、t38s/y83w/w117a/p296f或l37a/t38s/y83w/w117a/p296f；或，

14、所述烯酮還原酶相對(duì)于seq?id?no:5所示的氨基酸序列存在以下的氨基酸殘基的差異：

15、w103a、y69w/w103a、t28s/y69w/w103a、t28s/y69w/w103a/e275f或l27a/t28s/y69w/w103a/e275f。本文中，每個(gè)酶不同位點(diǎn)的氨基酸殘基差異之間使用的“/”代表所述不同位點(diǎn)的氨基酸殘基差異同時(shí)存在于同一個(gè)酶上。

16、本發(fā)明第二方面提供了一種分離的核酸，其編碼本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶。

17、本發(fā)明第三方面提供了一種重組表達(dá)載體，其包含本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸。

18、在一些實(shí)施方案中，所述重組表達(dá)載體包含pet28a質(zhì)粒骨架。

19、本發(fā)明第四方面提供了一種基因工程菌，其包含本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸或本發(fā)明第三方面所述的重組表達(dá)載體。

20、本發(fā)明第五方面提供了一種生產(chǎn)烯酮還原酶的方法，將本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌接種于適于其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到所述烯酮還原酶。

21、本發(fā)明第六方面提供了一種生產(chǎn)中間產(chǎn)物1的方法，所述方法包括：將烯酮還原酶或生產(chǎn)所述烯酮還原酶的基因工程菌與底物混合，反應(yīng)后得到所述中間產(chǎn)物1。

22、所述底物為如式1所示的化合物：

23、

24、其中，r為芐基或c1-c4的烷基；

25、所述中間產(chǎn)物1為如式2所示的化合物：

26、

27、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

28、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶為本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶；和/或，所述基因工程菌為本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌。

29、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在緩沖液中進(jìn)行所述混合；和/或，在所述混合前、所述混合時(shí)或所述混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)。

30、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為pbs緩沖液；和/或，

31、所述輔酶為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)中的任意一種或兩種；和/或，

32、所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，或者，包括異丙醇脫氫酶和異丙醇。

33、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶為來(lái)源于枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)168的葡萄糖脫氫酶；和/或，所述異丙醇脫氫酶為來(lái)源于短乳桿菌(lactobacillus?brevis)kb290的異丙醇脫氫酶。

34、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:15所示；和/或，所述異丙醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

35、本發(fā)明第七方面提供了一種生產(chǎn)中間產(chǎn)物2的方法。所述方法包括：將酮還原酶與中間產(chǎn)物1混合，反應(yīng)后得到所述中間產(chǎn)物2。

36、所述中間產(chǎn)物1為如式2所示的化合物：

37、

38、其中，r為芐基或c1-c4的烷基；

39、所述中間產(chǎn)物2為如式3所示的化合物：

40、

41、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

42、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶選自來(lái)源于馬(equus?caballus)的、約克氏菌(yokenella?sp.)wzy002、蛇根木(rauvolfia?serpentina)和地芽孢桿菌(geobacillus?sp.)a8的酮還原酶。

43、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶的氨基酸序列選自seq?id?no:7、seqid?no:9、seq?id?no:11和seq?id?no:13。

44、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在緩沖液中進(jìn)行所述混合；和/或，在所述混合前、所述混合時(shí)或所述混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)。

45、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為pbs緩沖液；和/或，

46、所述輔酶為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)中的任意一種或兩種；和/或，

47、所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，或者，包括異丙醇脫氫酶和異丙醇。

48、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶為來(lái)源于枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)168的葡萄糖脫氫酶；和/或，所述異丙醇脫氫酶為來(lái)源于短乳桿菌(lactobacillus?brevis)kb290的異丙醇脫氫酶。

49、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:15所示；和/或，所述異丙醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

50、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述中間產(chǎn)物1為本發(fā)明第六方面所述的方法制得的中間產(chǎn)物1。

51、本發(fā)明第八方面提供了一種生產(chǎn)布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法，所述方法包括將烯酮還原酶或生產(chǎn)所述烯酮還原酶的基因工程菌與底物混合，反應(yīng)后得到中間產(chǎn)物1；利用所述中間產(chǎn)物1制得(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮；

52、所述底物為如式1所示的化合物：

53、

54、其中，r為芐基或c1-c4的烷基；

55、所述中間產(chǎn)物1為如式2所示的化合物：

56、

57、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

58、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶為如本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶；和/或，所述基因工程菌為本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌。

59、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述利用所述中間產(chǎn)物1制得(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法包括：將酮還原酶與所述中間產(chǎn)物1混合，反應(yīng)后得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮。

60、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述利用所述中間產(chǎn)物1制得(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法包括：將所述酮還原酶與所述中間產(chǎn)物1混合，反應(yīng)后得到中間產(chǎn)物2；所述中間產(chǎn)物2經(jīng)過(guò)關(guān)環(huán)反應(yīng)得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮。

61、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶選自來(lái)源于馬(equus?caballus)、約克氏菌(yokenella?sp.)wzy002、蛇根木(rauvolfia?serpentina)和地芽孢桿菌(geobacillus?sp.)a8的酮還原酶。

62、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，更優(yōu)選地，所述酮還原酶的氨基酸序列選自seq?idno:7、seq?id?no:9、seq?id?no:11和seq?id?no:13。

63、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶或所述基因工程菌與所述底物在緩沖液中進(jìn)行混合；和/或，在所述烯酮還原酶或所述基因工程菌與所述底物混合前、混合時(shí)或混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)；和/或，在所述酮還原酶與所述中間產(chǎn)物1混合前、混合時(shí)或混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)。

64、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為pbs緩沖液；和/或，

65、所述輔酶為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)中的一種或兩種；和/或，

66、所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，或者，包括異丙醇脫氫酶和異丙醇。

67、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶為來(lái)源于枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)168的葡萄糖脫氫酶；和/或，所述異丙醇脫氫酶為來(lái)源于短乳桿菌(lactobacillus?brevis)kb290的異丙醇脫氫酶。

68、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:15所示；和/或，所述異丙醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

69、本發(fā)明第九方面提供了一種生產(chǎn)布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法，所述方法包括：將酮還原酶與中間產(chǎn)物1混合，反應(yīng)后得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮；

70、所述中間產(chǎn)物1為如式2所示的化合物：

71、

72、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

73、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括：將所述酮還原酶與所述中間產(chǎn)物1混合，反應(yīng)后得到中間產(chǎn)物2；所述中間產(chǎn)物2經(jīng)過(guò)關(guān)環(huán)反應(yīng)得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮。

74、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶選自來(lái)源于馬(equus?caballus)、約克氏菌(yokenella?sp.)wzy002、蛇根木(rauvolfia?serpentina)和地芽孢桿菌(geobacillus?sp.)a8的酮還原酶。

75、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶的氨基酸序列選自seq?id?no:7、seqid?no:9、seq?id?no:11和seq?id?no:13。

76、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括將烯酮還原酶或生產(chǎn)所述烯酮還原酶的基因工程菌與底物混合，反應(yīng)后得到所述中間產(chǎn)物1；

77、所述底物為如式1所示的化合物：

78、

79、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

80、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶為本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶；和/或，所述基因工程菌為本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌。

81、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶或所述基因工程菌與所述底物在緩沖液中進(jìn)行混合；和/或，在所述烯酮還原酶或所述基因工程菌與所述底物混合前、混合時(shí)或混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)；和/或，在所述酮還原酶與所述中間產(chǎn)物1混合前、混合時(shí)或混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)。

82、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為pbs緩沖液；和/或，

83、所述輔酶選自煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)中的任意一種或兩種；和/或，

84、所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，或者，包括異丙醇脫氫酶和異丙醇。

85、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶為來(lái)源于枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)168的葡萄糖脫氫酶；和/或，所述異丙醇脫氫酶為來(lái)源于短乳桿菌(lactobacillus?brevis)kb290的異丙醇脫氫酶。

86、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:15所示；和/或，所述異丙醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

87、本發(fā)明第十方面提供了一種生產(chǎn)布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮的方法，將烯酮還原酶或生產(chǎn)所述烯酮還原酶的基因工程菌中的任意一種或兩種、酮還原酶和底物混合，反應(yīng)后得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮；

88、所述底物為如式1所示的化合物：

89、

90、其中，r為芐基或c1-c4的烷基。

91、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括：將所述烯酮還原酶或生產(chǎn)所述烯酮還原酶的基因工程菌中的任意一種或兩種、所述酮還原酶和所述底物混合，反應(yīng)后得到中間產(chǎn)物2；所述中間產(chǎn)物2經(jīng)過(guò)關(guān)環(huán)反應(yīng)得到所述(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮。

92、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述烯酮還原酶為本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶；和/或，所述基因工程菌為本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌。

93、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶選自來(lái)源于馬(equus?caballus)、約克氏菌(yokenella?sp.)wzy002、蛇根木(rauvolfia?serpentina)和地芽孢桿菌(geobacillus?sp.)a8的酮還原酶。

94、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述酮還原酶的氨基酸序列選自seq?id?no:7、seqid?no:9、seq?id?no:11和seq?id?no:13。

95、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，在緩沖液中進(jìn)行所述混合；和/或，在所述混合前、所述混合時(shí)或所述混合后加入輔酶和輔酶循環(huán)系統(tǒng)。

96、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述緩沖液為pbs緩沖液；和/或，

97、所述輔酶選自煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadp+)中的任意一種或兩種；和/或，

98、所述輔酶循環(huán)系統(tǒng)包括葡萄糖脫氫酶和葡萄糖，或者，包括異丙醇脫氫酶和異丙醇。

99、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶為來(lái)源于枯草芽胞桿菌(bacillus?subtilis)168的葡萄糖脫氫酶；和/或，所述異丙醇脫氫酶為來(lái)源于短乳桿菌(lactobacillus?brevis)kb290的異丙醇脫氫酶。

100、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:15所示；和/或，所述異丙醇脫氫酶的氨基酸序列如seq?id?no:17所示。

101、本發(fā)明第十一方面提供了一種化合物，所述化合物具有如式4所示的結(jié)構(gòu)：

102、

103、其中，r為乙基為或芐基。

104、本發(fā)明第十二方面提供了一種制備本發(fā)明第十一方面所述的化合物的方法，所述方法包括如下步驟：將芐溴或溴乙烷中的任意一種與5-羥基-4-正丙基-2(5h)-呋喃酮混合，反應(yīng)后得到所述化合物。

105、在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)在二甲基甲酰胺(dmf)和碳酸鉀的混合反應(yīng)體系中進(jìn)行。

106、在一些更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述反應(yīng)條件滿足以下條件的一種或多種：

107、溫度為25～35℃，例如30℃；

108、和/或，時(shí)間為1.5～6h，例如2h。

109、本發(fā)明第十三方面提供了本發(fā)明第十一方面所述的化合物在生產(chǎn)(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮中的應(yīng)用。

110、本發(fā)明第十四方面提供了本發(fā)明第四方面所述的基因工程菌在生產(chǎn)烯酮還原酶或(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮中的應(yīng)用，或本發(fā)明第一方面所述的烯酮還原酶在生產(chǎn)(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮中的應(yīng)用。

111、在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

112、本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

113、本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：

114、不同來(lái)源的烯酮還原酶的單突變體或組合突變體與野生型相比，在生產(chǎn)布瓦西坦中間體(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮時(shí)，均體現(xiàn)出良好的對(duì)映選擇性和較高的轉(zhuǎn)化率，為工業(yè)化生產(chǎn)(r)-4-丙基-二氫呋喃-2-酮提供了良好的策略。