本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)清潔能源技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性的方法。

背景技術(shù)：

化石能源的逐年開采和利用，使全球范圍內(nèi)化石能源存儲量日益降低，且石油價格的不斷增長，造成能源形勢異常嚴峻，環(huán)境問題愈演愈烈。隨著人口的飛速增長，社會經(jīng)濟的迅猛發(fā)展，世界能源需求量日益提高。在能源枯竭和環(huán)境惡化的雙重壓力下，世界各國俱在積極發(fā)展可再生和綠色能源來替代傳統(tǒng)的化石能源。生物能源是可替代化石燃料的重要清潔能源。丁醇是一種極具潛力的新型生物燃料，與當(dāng)前流行的生物燃料添加劑乙醇相比，具有熱值高于乙醇、低吸濕性、低蒸汽壓、不易溶于水、更容易與汽油和柴油燃料相混合等優(yōu)點。雖然生物丁醇有良好的工業(yè)前景，但在丁醇發(fā)酵過程中由于丁醇的低產(chǎn)量，低合成速率使其生產(chǎn)力受到嚴重限制，導(dǎo)致工業(yè)化進程緩慢。

為了使丁醇發(fā)酵在工業(yè)生產(chǎn)上更具有競爭力，必須提高丁醇的生產(chǎn)能力，這也是目前國內(nèi)外發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇的研究熱點和難點。丁醇發(fā)酵是一個復(fù)雜的生物反應(yīng)過程，在發(fā)酵過程中受細胞濃度、產(chǎn)物抑制等因素的影響。為了解決丁醇發(fā)酵所面臨的上述問題，國內(nèi)外研究者通過研究新的發(fā)酵工藝來提高丙酮-丁醇發(fā)酵的生產(chǎn)能力，如使用細胞回流和固定化細胞技術(shù)來提高細胞濃度和反應(yīng)器的效率，以及通過萃取發(fā)酵來減弱產(chǎn)物抑制。近年來，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，采用分子生物學(xué)手段、基因改造技術(shù)以及代謝工程來增加丙酮丁醇梭菌發(fā)酵丁醇的產(chǎn)量得到了廣泛關(guān)注。雖然基因改造是最有前途的操作技術(shù)，但由于丁醇發(fā)酵途徑的復(fù)雜性，并且發(fā)酵過程中基因控制復(fù)雜，且不易操作，導(dǎo)致基因工程領(lǐng)域進展緩慢。目前為止，尚沒有基因工程菌能適合工業(yè)化生產(chǎn)。

丁醇發(fā)酵代謝過程已闡明分為產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期兩個階段。在發(fā)酵初期，隨著發(fā)酵的進行，產(chǎn)生大量丁酸和乙酸，發(fā)酵液ph值迅速下降，稱為產(chǎn)酸期。當(dāng)酸性物質(zhì)積累到一定濃度，ph降到一定值時發(fā)酵液的還原傾向增強，乙酸、丁酸等被還原成丙酮、丁醇等新的產(chǎn)物，從而使ph升高，進入產(chǎn)溶劑期。丁醇，丙酮等溶劑的產(chǎn)生是碳代謝由產(chǎn)酸途徑向產(chǎn)溶劑途徑的轉(zhuǎn)變，而丁酸作為合成丁醇的必需和有效的前體物質(zhì)，通過向培養(yǎng)基中添加丁酸或許可作為菌體由產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因子，快速激活產(chǎn)丁醇的代謝途徑，促進丁醇合成。另外，在發(fā)酵產(chǎn)酸期由于大量有機酸積累，在這個過程中，如果不進行ph值的調(diào)節(jié)，那么極有可能會導(dǎo)致酸崩潰現(xiàn)象，從而使發(fā)酵受抑制而使產(chǎn)率降低。

因此，研究簡單、有效的誘導(dǎo)因子丁酸的添加方式及ph的調(diào)控策略對促進丁醇合成，提高丁醇轉(zhuǎn)化效率具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)不足，而提出的一種提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性的方法，關(guān)鍵在于誘導(dǎo)因子丁酸的添加方式及穩(wěn)定ph的調(diào)控策略，為了解決上述問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的一種提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性的方法，它是按照以下步驟進行的：

一、將產(chǎn)丁醇細菌接種到已滅菌的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；

二、待步驟一中細菌生長達到對數(shù)期后，將丁酸溶液添加到步驟一發(fā)酵體系中，使發(fā)酵體系中的丁酸溶液濃度達到0.6～1.5g/l；

三、在添加完丁酸溶液后，將緩沖劑間歇添加到步驟二中所建立的發(fā)酵體系中，恒溫條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，得到以丁醇為主的發(fā)酵液，即完成所述的提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性；所述的緩沖劑添加總量為0.03～0.04mol/l，間歇添加的條件為每間隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振蕩均勻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)丁酸是合成丁醇的前體物質(zhì)，添加少量丁酸有助于激發(fā)丁醇的合成的代謝途徑，促進丁醇的快速合成，縮短發(fā)酵周期。

(2)本發(fā)明丁酸添加時間選擇在菌體生長的對數(shù)期，可以避免其對菌體的生長造成消極的影響，還可以避免酸崩潰發(fā)生。

(3)本發(fā)明在加入丁酸后立即添加緩沖劑能夠在后期丁醇發(fā)酵過程中中和有機酸，提升培養(yǎng)基的緩沖能力，維持一個比較穩(wěn)定的ph，減輕環(huán)境對于產(chǎn)丁醇細菌的脅迫，有效的避免了酸崩潰現(xiàn)象發(fā)生。

(4)本發(fā)明中的緩沖劑是以間歇添加的手段加入的，能夠更加精準的持續(xù)緩沖ph。避免一次性大量添加導(dǎo)致ph快速升高，從而延緩發(fā)酵體系由產(chǎn)酸期向產(chǎn)溶劑期的的轉(zhuǎn)變

(5)本發(fā)明使發(fā)酵底物更多的進入丁醇合成的代謝途徑，減少了發(fā)酵體系副產(chǎn)物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了發(fā)酵液中丁醇所占的比例。

通過與對照試驗進行比較分析，丁醇最終產(chǎn)量與對照相比提高了139.4％，丁醇最大合成速率與對照組相比提高了168.3％。

因此，本發(fā)明根據(jù)代謝支路耦聯(lián)的特性，提出通過添加丁醇代謝過程前體物質(zhì)丁酸來激發(fā)丁醇的快速合成，并開發(fā)了通過間歇流加緩沖劑的調(diào)控策略控制發(fā)酵體系ph，使丁醇發(fā)酵能夠高效、穩(wěn)定運行。該發(fā)明具有性能穩(wěn)定、運行效果好、工藝操作簡便等優(yōu)勢，便于推廣應(yīng)用。

附圖說明

圖1為具有代表性的后述的實例的微生物發(fā)酵制丁醇產(chǎn)量圖；其中，a為添加丁酸+碳酸鈣的丁醇產(chǎn)量曲線，b為對照曲線；

圖2為具有代表性的后述的實例的微生物發(fā)酵制丁醇合成速率圖；其中，a為添加丁酸+碳酸鈣的丁醇產(chǎn)量曲線，b為對照曲線。

具體實施方式

具體實施方式一：本實施方式的一種提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性的方法，它是按照以下步驟進行的：

一、將產(chǎn)丁醇細菌接種到已滅菌的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，在恒溫條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；

二、待步驟一中細菌生長達到對數(shù)期后，將丁酸溶液添加到步驟一發(fā)酵體系中，使發(fā)酵體系中的丁酸溶液濃度達到0.6～1.5g/l；

三、在添加完丁酸溶液后，將緩沖劑間歇添加到步驟二中所建立的發(fā)酵體系中，恒溫條件下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，得到以丁醇為主的發(fā)酵液，即完成所述的提高厭氧細菌產(chǎn)丁醇活性；所述的緩沖劑添加總量為0.03～0.04mol/l，間歇添加的條件為每間隔24h添加一次，共添加2次，每次添加后振蕩均勻。

具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基含有濃度為40～60g/l的碳源、1～3g/l酵母提取物、0.1～0.3g/l硫酸鎂、0.01～0.02g/l硫酸錳、0.01～0.02g/l硫酸亞鐵、0.01～0.02g/l氯化鈉、0.001～0.002g/l維生素b1、0.3～0.7g/l半胱氨酸、0.001～0.002g/l對氨基苯甲酸、0.0001g/l生物素和0.1～0.2g/l刃天青。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基含有濃度為40～60g/l的碳源、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸鎂、0.01g/l硫酸錳、0.01g/l硫酸亞鐵、0.01g/l氯化鈉、0.001g/l維生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l對氨基苯甲酸、0.0001g/l生物素和0.1g/l刃天青。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源可為葡萄糖、淀粉或木質(zhì)纖維素物質(zhì)水解糖化液。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中所述的產(chǎn)丁醇細菌為嚴格厭氧菌。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述的嚴格厭氧菌包括丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌、糖丁酸梭菌、丁酸梭菌以及通過基因工程改造的微生物。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中接種的發(fā)酵產(chǎn)丁醇細菌的接種比例為發(fā)酵體積的1～2％。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一不同的是：所述的緩沖劑為碳酸鈣、碳酸鈉、磷酸鹽中的一種或兩種以上按任意比混合。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式九：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中恒溫條件為：溫度為34～37℃，轉(zhuǎn)速為150～180r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，共培養(yǎng)60～100小時。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式十：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中恒溫條件為：發(fā)酵體系中的丁酸溶液濃度達到1.0～1.5g/l。其它與具體實施方式一相同。

具體實施方式十一：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中恒溫條件為：發(fā)酵體系中的丁酸溶液濃度達到1.2～1.5g/l。其它與具體實施方式一相同。

本發(fā)明內(nèi)容不僅限于上述各實施方式的內(nèi)容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。

通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：

實施例1：

本實施方式一種提高厭氧細菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇活性的方法按以下步驟實現(xiàn)：

(1)將丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824(購買于中國普通微生物菌種保藏中心)的種子液按體積比為2％接種到已滅菌的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃恒溫條件、170r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。

其中厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基含有濃度為60g/l的葡萄糖、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸鎂、0.01g/l硫酸錳、0.01g/l硫酸亞鐵、0.01g/l氯化鈉、0.001g/l維生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l對氨基苯甲酸、0.0000g/l生物素和0.1g/l刃天青。充氮氣除氧后，121℃滅菌20分鐘。

(2)在步驟(1)中丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824接菌后12h時，將丁酸溶液添加到步驟(1)中所建立的發(fā)酵體系中，添加丁酸溶液后，整個發(fā)酵體系的丁酸濃度為1g/l，加入丁酸后迅速振蕩均勻。

(3)完成步驟(2)后立即將碳酸鈣懸濁液添加到步驟(1)所建立的發(fā)酵體系中。將發(fā)酵液振蕩均勻。添加碳酸鈣懸濁液后，整個發(fā)酵體系中的碳酸鈣濃度為2g/l，加入碳酸鈣后應(yīng)迅速振蕩均勻。

(4)在第一次添加碳酸鈣后24h之后，發(fā)現(xiàn)厭氧瓶內(nèi)無沉淀，碳酸鈣已消耗殆盡，再次添加碳酸鈣，添加濃度為2g/l，即累積添加碳酸鈣濃度為4g/l。

(5)在恒定37℃，轉(zhuǎn)速為170r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，在添加丁酸后繼續(xù)培養(yǎng)60小時可以得到富含丁醇的發(fā)酵液。

實施例2：

本實施方式一種提高厭氧細菌發(fā)酵產(chǎn)丁醇活性的方法按以下步驟實現(xiàn)：

(1)將丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824(購買于中國普通微生物菌種保藏中心)的種子液按體積比為2％接種到已滅菌的液體厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃恒溫條件、170r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。

其中厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基含有濃度為50g/l的纖維素酶解糖化液、2g/l酵母提取物、0.2g/l硫酸鎂、0.01g/l硫酸錳、0.01g/l硫酸亞鐵、0.01g/l氯化鈉、0.001g/l維生素b1、0.5g/l半胱氨酸、0.001g/l對氨基苯甲酸、0.0000g/l生物素和0.1g/l刃天青。充氮氣除氧后，121℃滅菌20分鐘。

(2)在步驟(1)中丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)atcc824接菌后12h時，將丁酸溶液添加到步驟(1)中所建立的發(fā)酵體系中，添加丁酸溶液后，整個發(fā)酵體系的丁酸濃度為1.25g/l，加入丁酸后迅速振蕩均勻。

(3)完成步驟(2)后立即將碳酸鈣懸濁液添加到步驟(1)所建立的發(fā)酵體系中。將發(fā)酵液振蕩均勻。添加碳酸鈣懸濁液后，整個發(fā)酵體系中的碳酸鈣濃度為2g/l，加入碳酸鈣后應(yīng)迅速振蕩均勻。

(4)在第一次添加碳酸鈣后24h之后，發(fā)現(xiàn)厭氧瓶內(nèi)無沉淀，碳酸鈣已消耗殆盡，再次添加碳酸鈣，添加濃度為2g/l，即累積添加碳酸鈣濃度為4g/l。

(5)在恒定37℃，轉(zhuǎn)速為170r/min的條件下振蕩培養(yǎng)，在添加丁酸后繼續(xù)培養(yǎng)60小時可以得到富含丁醇的發(fā)酵液。

實驗結(jié)果：

本實施例的丁酸添加時間選擇在菌體生長的對數(shù)期，可以避免其對菌體的生長造成消極的影響，還可以避免酸崩潰發(fā)生。額外添加碳酸鈣能夠在丁醇發(fā)酵過程中和有機酸，提升培養(yǎng)基的緩沖能力，獲得一個較高的ph值，并使之維持在一個特定范圍內(nèi)。碳酸鈣與丁酸同時添加能迅速有效的改善ph，減輕環(huán)境對于產(chǎn)丁醇細菌的脅迫。碳酸鈣以分批補料的方式添加能控制發(fā)酵成本，精準持續(xù)的穩(wěn)定發(fā)酵體系的ph。外添丁酸及碳酸鈣后，丙酮丁醇梭菌梭菌依舊長勢良好。

丁酸是合成丁醇的前體物質(zhì)，本實施例添加少量丁酸有助于激發(fā)丁醇的合成的代謝途徑，當(dāng)葡萄糖和丁酸共同作為底物時，能夠有效的提升葡萄糖的利用率，并且使葡萄糖濃度迅速下降。額外添加丁酸能夠刺激有益于丁醇合成的氨基酸的積累，進一步提升丁醇產(chǎn)量。外添丁酸后丁醇合成量和丁醇合成速率趨勢有明顯的正向波動，發(fā)酵周期明顯縮短。本實驗丁醇最終產(chǎn)量與對照相比提高了139.4％，丁醇最大合成速率與對照組相比提高了168.3％。

由此可知，本實施例使發(fā)酵底物更多的進入丁醇合成的代謝途徑，減少了發(fā)酵體系副產(chǎn)物如乙酸、丁酸的生成，大大提高了丁醇產(chǎn)量，強化了發(fā)酵液中丁醇所占的比例。