本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，特別涉及一種新型的炎癥分子(psgl-1)缺失合并脂代謝異常的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人們飲食和生活習(xí)慣的改變，代謝性疾病的發(fā)生率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。脂代謝異?？蓪?dǎo)致高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。研究表明炎癥分子與脂代謝異常的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，炎癥貫穿整個(gè)疾病發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，但是目前有關(guān)炎癥與脂代謝的研究?jī)H僅局限于細(xì)胞和臨床組織水平，而缺乏用于動(dòng)態(tài)整體研究的炎癥分子合并脂代謝異常的小鼠工具模型。低密度脂蛋白受體基因敲除(ldlr^-/-)小鼠是研究脂代謝異常的經(jīng)典模型，粘附分子敲除的小鼠模型常用來(lái)研究疾病與炎癥有關(guān)的分子機(jī)制。本項(xiàng)目擬利用現(xiàn)有基因工程小鼠平臺(tái)的炎癥分子((psgl-1))缺失小鼠與脂代謝異常ldlr^-/-小鼠進(jìn)行雜交，旨在獲得(psgl-1)缺失背景下的脂代謝異常模型，為系統(tǒng)研究炎癥分子與脂代謝的相互關(guān)系，尋找新的藥物靶標(biāo)和治療方法提供一種新的研究載體，為基因工程小鼠模型的深入開(kāi)發(fā)提供示范。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為新興的最有效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。與普通實(shí)驗(yàn)小鼠相比，基因工程小鼠具有無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)：疾病的發(fā)生是自然形成的，可模擬人類(lèi)疾病的體內(nèi)發(fā)生過(guò)程，研究結(jié)果更加真實(shí)可靠；能夠進(jìn)行動(dòng)態(tài)連續(xù)觀察，克服了臨床研究的局限性。ldlr^-/-基因工程小鼠是一個(gè)經(jīng)典的脂代謝異常小鼠模型，通過(guò)敲除低密度脂蛋白受體基因，導(dǎo)致ldlr功能缺陷，血漿中l(wèi)dl-c水平升高，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化及肝臟脂肪變性等。其疾病形成機(jī)理與臨床十分相似。大量證據(jù)表明動(dòng)脈粥樣硬化等脂代謝疾病本質(zhì)上是一種炎癥性疾病，炎癥分子的表達(dá)與血脂紊亂及主動(dòng)脈病變密切相關(guān)。但是，目前還缺乏良好的模型用來(lái)研究炎癥與脂代謝紊亂的關(guān)系。(psgl-1)是一個(gè)重要的粘附分子，p選擇素/(psgl-1)的相互作用介導(dǎo)中性粒細(xì)胞一血小板、中性粒細(xì)胞一內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞間反應(yīng)，活化血小板、促進(jìn)血栓形成，參與內(nèi)皮損傷、介導(dǎo)炎癥細(xì)胞黏附從而又使脂質(zhì)沉著，同時(shí)(psgl-1)可以轉(zhuǎn)導(dǎo)胞外信號(hào)，促進(jìn)白細(xì)胞活化并使其穩(wěn)定黏附。p選擇素/(psgl-1)相互作用在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosc1erosis，as)的形成及穩(wěn)定中起著重要作用，提示了其對(duì)心血管疾病的重要意義。我們擬利用這兩種小鼠進(jìn)行雜交，獲得(psgl-1)^-/-,ldlr^-/-小鼠模型，為研究者提供有應(yīng)用價(jià)值的、適于研究炎癥與代謝性疾病關(guān)系的工具模型，同時(shí)為基因工程小鼠創(chuàng)新模型的深入開(kāi)發(fā)提供示范，具有良好的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種新型的炎癥分子缺失合并脂代謝紊亂的小鼠模型的構(gòu)建方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述動(dòng)物模型的應(yīng)用。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明構(gòu)建的(psgl-1)^-/-,ldlr^-/-小鼠模型，其(psgl-1)蛋白的表達(dá)量缺失后并不影響小鼠的正常生活。

發(fā)明人通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因工程動(dòng)物ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠在高脂飼飲食12周后，對(duì)比ldlr^-/-小鼠，ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白明顯升高；通過(guò)對(duì)肝臟的he染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)比ldlr^-/-小鼠，ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠肝小葉脂肪變性明顯減輕，肝臟中的總膽固醇和甘油三酯也有明顯的降低；通過(guò)對(duì)主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部的油紅o染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)比ldlr^-/-小鼠，ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部斑塊沉積顯著降低。研究表明：(psgl-1)蛋白的表達(dá)量減少能夠減輕ldlr^-/-小鼠體內(nèi)脂代謝異常狀態(tài)，該模型能夠有效地用來(lái)研究炎癥分子與脂代謝的關(guān)系，可用于代謝性疾病炎癥機(jī)制的研究。

附圖說(shuō)明

圖1是(psgl-1)的結(jié)構(gòu)及結(jié)合示意圖；

圖2是小鼠鑒定圖；

圖3是ldlr^-/-與ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠的血脂測(cè)量；

圖4是ldlr^-/-與ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠的肝臟he染色與肝脂檢測(cè)；

圖5是ldlr^-/-與ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠的主動(dòng)脈油紅染色及斑塊面積的統(tǒng)計(jì)分析；

圖6是ldlr^-/-與ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠的主動(dòng)脈根部的油紅染色及斑塊面積的統(tǒng)計(jì)分析。

具體實(shí)施方式

1實(shí)驗(yàn)原理

p-選擇素糖蛋白配體-1((psgl-1))是20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)一種表達(dá)唾液酸化和巖藻糖化聚糖的黏附分子，屬于i型跨膜蛋白。(psgl-1)在起始黏附過(guò)程中不僅可以從血液中識(shí)別及捕獲白細(xì)胞，也可作為信號(hào)傳遞分子向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)進(jìn)而激活白細(xì)胞(圖1)。目前可知，(psgl-1)在炎癥反應(yīng)中具有調(diào)控作用。本發(fā)明構(gòu)建的模型著重研究了(psgl-1)缺失對(duì)ldlr^-/-小鼠脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的影響。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1基因工程小鼠的雜交擴(kuò)群取ldlr^-/-和(psgl-1)^-/-進(jìn)行雜交得到f1代(psgl-1)^+/-；ldlr^+/-小鼠；f1代小鼠雜交后，可以得到4種不同基因型小鼠，分別是：(psgl-1)^+/-；ldlr^-/-、(psgl-1)^-/-；ldlr^+/-、(psgl-1)^+/+；ldlr^-/-(ldlr^-/-小鼠)和(psgl-1)^-/-；ldlr^-/-，前兩種基因型的小鼠可以用來(lái)繼續(xù)雜交擴(kuò)鼠，后兩種基因型小鼠分別作為對(duì)照鼠和實(shí)驗(yàn)鼠。小鼠在雜交過(guò)程中小鼠生育情況正常。每籠不超過(guò)四只，以雄：雌＝1:3或1:2的比例配種。

2.2血脂測(cè)量采用中生北控血脂測(cè)定試劑盒，測(cè)定小鼠血脂時(shí)對(duì)將各反應(yīng)體積同時(shí)縮小5倍。tc、tg和hdl-c濃度經(jīng)直接測(cè)量得出。測(cè)量方法為：按照要求配制各反應(yīng)工作液，tc與hdl反應(yīng)工作液相同，而tg反應(yīng)工作液與前兩者不相同。測(cè)定hdl時(shí)需提前按照1:1的比例混合血清樣本和沉淀劑，室溫放置30min后，3000rpm離心30min。上清液用于測(cè)量。將tc、tg和hdl的標(biāo)準(zhǔn)品都分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍，32倍。同時(shí)向各孔加入200μl對(duì)應(yīng)工作液。將稀釋后的各標(biāo)準(zhǔn)品加入對(duì)應(yīng)孔，對(duì)應(yīng)加入各血清樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本加入體積分別是2μl(tc)、2μl(tg)和5μl(hdl-c)，同時(shí)留有未加入樣本的工作液作為空白對(duì)照孔。37℃反應(yīng)10min后，在490nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，分別統(tǒng)計(jì)各od值。ldl-c的檢測(cè)與以上三種的檢測(cè)方法皆不同。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各3μl，然后加入試劑盒中的r1反應(yīng)液，混勻，放入37℃烘箱中孵育5min，然后在570nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下檢測(cè)吸光度，得od1值。然后加入試劑盒中的r2反應(yīng)液，混勻，放入37℃烘箱中孵育5min，然后再570nm波長(zhǎng)的酶標(biāo)儀下檢測(cè)吸光度，得od2值。最后算的od終值＝od2-od1，最終根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得最終濃度。

2.3he染色組織石蠟切片脫蠟、蘇木素染色1.5min，返藍(lán)30min，伊紅染色1.5s，37℃過(guò)夜、封片。置顯微鏡下觀察各個(gè)組織結(jié)構(gòu)變化并拍照。

2.4血管斑塊油紅染色實(shí)驗(yàn)小鼠灌注完成后，沿著小鼠脊柱分離出主動(dòng)脈，上至心臟口的動(dòng)脈弓，下至胸腹主動(dòng)脈即腹主動(dòng)脈向兩個(gè)鼠腎分支處。將分離出的動(dòng)脈豎直固定在黑色背景的塑料方塊上，在體式顯微鏡下分離剝離主動(dòng)脈外壁的脂肪組織。需要一邊手持鑷子稍平壓住血管，一邊用另一鑷子沿血管走向撕開(kāi)脂肪條塊，待將血管外壁的脂肪塊分離干凈之后，用細(xì)剪剖開(kāi)血管。動(dòng)脈處由于是彎曲狀結(jié)構(gòu)，一般需要沿弓部對(duì)剪，鋪開(kāi)呈樹(shù)丫狀并平鋪在相對(duì)大小的濾紙上。用4％的多聚甲醛固定大約10min，用pbs輕微漂洗之后帶濾紙一起轉(zhuǎn)入1.5mlep管中待染色。將剖開(kāi)的主動(dòng)脈從濾紙上取下移至裝有60％異丙醇的1.5mlep管中漂洗約30s。再轉(zhuǎn)入裝有60％oil-red-o的1.5mlep管中，之后把ep管置于旋轉(zhuǎn)機(jī)上進(jìn)行旋轉(zhuǎn)避光染色1-1.5h。染色之后再把血管轉(zhuǎn)移到另一管裝有1ml60％異丙醇的ep管內(nèi)，同樣用旋轉(zhuǎn)機(jī)旋轉(zhuǎn)脫色1分鐘(如果背景較深可適當(dāng)延長(zhǎng)脫色時(shí)間)。將脫色后的血管平鋪在載玻片上，然后把整個(gè)玻片放在深色背景的臺(tái)面用普通canon相機(jī)拍照。

2.5主動(dòng)脈根部油紅染色實(shí)驗(yàn)取出小鼠的心臟包埋做冰凍切片(如果當(dāng)時(shí)不能立即切片需放入-80℃冰箱保存)，收集主動(dòng)脈根部的連續(xù)切片。部分切片經(jīng)pbs短暫漂洗，以洗脫冰凍包埋劑。然后用60％的異丙醇漂洗20-30秒后，轉(zhuǎn)入60％的油紅o染色中。避光染色30分鐘后，用60％的異丙醇短暫漂洗40秒，以洗脫背景染色。蘇木素核染3分鐘后，pbs洗兩遍，每次5分鐘。漂洗結(jié)束后，將載玻片置于37℃烘箱烘干。普通膠水封片后用olympus光學(xué)顯微鏡下拍照。將拍攝到的照片置于imageproplus軟件中統(tǒng)計(jì)小鼠的粥樣硬化斑塊面積。每只小鼠連續(xù)8張切片的斑塊面積的平均值即為該小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的面積值。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1基因工程小鼠的雜交擴(kuò)群小鼠鑒定結(jié)果：剪尾，編號(hào)，提取dna，pcr擴(kuò)增后，瓊脂糖電泳，ldlr小鼠可見(jiàn)350bp有一條帶，野生型小鼠在167bp可見(jiàn)一條帶；(psgl-1)小鼠可見(jiàn)500bp有一條帶，野生型小鼠在140bp可見(jiàn)一條帶。由圖2可知1#-7#號(hào)小鼠為ldlr-/-小鼠；8#-11#為(psgl-1)^-/-；ldlr^-/-雙敲鼠。(注mark條帶由上到下分別為100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp)

3.2血脂測(cè)量結(jié)果如圖3所示，ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-小鼠血清中的總膽固醇和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白明顯升高。

3.3he染色小鼠肝臟he染色和肝臟脂質(zhì)的測(cè)量結(jié)果如圖4所示，ldlr^-/-小鼠的肝小葉中肝細(xì)胞水腫并出現(xiàn)了較大的脂肪空泡變性，而ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-雙敲小鼠肝細(xì)胞的水腫程度降低，且ldlr^-/-,(psgl-1)^-/-雙敲小鼠肝臟中的總膽固醇和甘油三酯也有明顯的降低。

3.4血管斑塊油紅染色實(shí)驗(yàn)主動(dòng)脈血管斑塊油紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，(psgl-1)蛋白的缺失可以減少小鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的沉積且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p≤0.01)。

3.5主動(dòng)脈根部油紅染色實(shí)驗(yàn)主動(dòng)脈根部油紅染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，(psgl-1)蛋白的缺失可以減少小鼠主動(dòng)脈根部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的沉積。

4實(shí)驗(yàn)結(jié)論

經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)12周后，對(duì)比ldlr-/-小鼠，新構(gòu)建的ldlr-/-,(psgl-1)-/-小鼠血清中總膽固醇和低密度脂蛋白的含量降低，高密度脂蛋白含量升高；ldlr-/-,(psgl-1)-/-小鼠肝小葉脂肪變性明顯減輕，主動(dòng)脈和主動(dòng)脈根部的粥樣硬化斑塊面積有明顯的降低。說(shuō)明(psgl-1)蛋白的表達(dá)量減少能夠減輕ldlr-/-小鼠體內(nèi)脂代謝異常狀態(tài)，該模型能夠有效地用來(lái)研究炎癥分子與脂代謝的關(guān)系，可用于代謝性疾病炎癥機(jī)制的研究。