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用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的ARMS?qPCR方法和試劑盒與流程

文檔序號:11272107閱讀:851來源:國知局
用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的ARMS?qPCR方法和試劑盒與流程

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地,涉及一種幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr方法和試劑盒。



背景技術(shù):

幽門螺桿菌(helicobacterpylori,hp)是一種微需氧的螺桿菌,hp感染與慢性活動性胃炎、消化性潰瘍和胃癌等疾病密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道,世界范圍內(nèi)有近一半人口被hp感染,中國也屬hp高發(fā)區(qū),平均感染率高達(dá)40%-80%。目前,影響hp感染個體化根除治療療效的因素主要包括兩方面:宿主和抗生素耐藥性。宿主主要包括cyp2c19的基因多態(tài)性會明顯影響質(zhì)子泵抑制劑(protonpumpinhibitors,ppi)代謝水平及抑酸效果,對hp根除療效產(chǎn)生影響;hp抗生素耐藥性主要以三聯(lián)療法中克拉霉素和左氧氟沙星的耐藥為主,其中,與克拉霉素耐藥性相關(guān)的點(diǎn)突變主要包括23srrna基因的a2142g和a2143g位點(diǎn);gyra基因的n87k、d91n/g/y兩個位點(diǎn)氨基酸置換是導(dǎo)致hp耐左氧氟沙星的主要位點(diǎn)。

擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem,arms)是newton等首先建立用來檢測已知突變的方法,該方法的設(shè)計(jì)的突變引物與待檢測位點(diǎn)的3′端突變堿基匹配,用于特異性檢測突變型。為了提高引物特異性,可在引物的3′端的第2個和第3個堿基引入一個或兩個錯配堿基以阻止野生型的延伸。

arms-qpcr技術(shù)基于real-timepcr平臺,結(jié)合arms突變富集和taqman特異性熒光檢測兩種技術(shù)。利用arms引物對突變靶序列進(jìn)行pcr擴(kuò)增,taqman探針對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行特異性位點(diǎn)檢測,在real-timepcr基礎(chǔ)上鑒定特定突變。

因此,需要提供一種有效檢測幽門螺桿菌的arms-qpcr方法,實(shí)現(xiàn)高特異性、高靈敏性的檢測。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr引物組合。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr試劑或試劑盒。

本發(fā)明的第三個目的在于提供一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr方法。

為達(dá)到上述目的,本發(fā)明采用下述技術(shù)方案:

一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr引物組合物,所述arms-qpcr引物組合物包括引物組合a、引物組合b、引物組合c、引物組合d、引物組合e和引物組合f,如下述1)、2)、3)、4)、5)和6)所示:

1)引物組合a由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17組成;

2)引物組合b由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17組成;

3)引物組合c由上游引物-1、a2142g突變型引物、a2143g突變型引物、taqman探針-1組成;

4)引物組合d由87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探針-2組成;

5)引物組合e由91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探針-2組成;

6)引物組合f由上游引物-2、下游引物-2和外控探針組成;

其中,

所述上游引物*2的核苷酸序列如序列表seqidno.1所示;

所述cyp2c19*2g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.2所示;

所述cyp2c19*2a引物的核苷酸序列如序列表seqidno.3所示;

所述taqman探針*2的核苷酸序列如序列表seqidno.4所示;

所述上游引物*3的核苷酸序列如序列表seqidno.5所示;

所述cyp2c19*3g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.6所示;

所述cyp2c19*3a引物的核苷酸序列如序列表seqidno.7所示;

所述taqman探針*3的核苷酸序列如序列表seqidno.8所示;

所述上游引物*17的核苷酸序列如序列表seqidno.9所示;

所述cyp2c19*17c引物的核苷酸序列如序列表seqidno.10所示;

所述cyp2c19*17t引物的核苷酸序列如序列表seqidno.11所示;

所述taqman探針*17的核苷酸序列如序列表seqidno.12所示;

所述上游引物-1的核苷酸序列如序列表seqidno.13所示;

所述taqman探針-1的核苷酸序列如序列表seqidno.14所示;

所述a2142g突變型引物的核苷酸序列如序列表seqidno.15所示;

所述a2143g突變型引物的核苷酸序列如序列表seqidno.16所示;

所述下游引物-1的核苷酸序列如序列表seqidno.17所示;

所述taqman探針-2的核苷酸序列如序列表seqidno.18所示;

所述87k-1引物的核苷酸序列如序列表seqidno.19所示;

所述87k-2引物的核苷酸序列如序列表seqidno.20所示;

所述91n引物的核苷酸序列如序列表seqidno.21所示;

所述91g引物的核苷酸序列如序列表seqidno.22所示;

所述91y引物的核苷酸序列如序列表seqidno.23所示;

所述上游引物-2的核苷酸序列如序列表seqidno.24所示;

所述下游引物-2的核苷酸序列如序列表seqidno.25所示;

和所述外控探針的核苷酸序列如序列表seqidno.26所示。

優(yōu)選的,所述引物組合a中上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17的摩爾比為3∶3∶2∶3∶3∶2∶2∶2∶1;

所述引物組合b中上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17的摩爾比為3∶3∶2∶3∶3∶2∶2∶2∶1;

所述引物組合c中上游引物-1、a2142g突變型引物、a2143g突變型引物、taqman探針-1的摩爾比為6∶2∶3∶3;

所述引物組合d中87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探針-2的摩爾比為3∶1∶1∶1;

所述引物組合e中91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探針-2的摩爾比為3∶1∶1∶1∶1;

所述引物組合f中上游引物-2、下游引物-2和外控探針的摩爾比為3∶3∶2。

在本發(fā)明中所述引物組合a和引物組合b用于幽門螺桿菌中cyp2c19的基因多態(tài)性的檢測,引物組合c和引物組合f用于23srrna基因是否含有23srrna突變位點(diǎn)的檢測、引物組合d、引物組合e和引物組合f用于gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突變的檢測,上述引物組合共同完成幽門螺桿菌個體化基因檢測。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr試劑,包括pcr試劑a、pcr試劑b、pcr試劑c、pcr試劑d、pcr試劑e和pcr試劑f,如下述1)、2)、3)、4)、5)和6)所示:

1)pcr試劑a由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合a、凍干保護(hù)劑和水組成;

2)pcr試劑b由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合b、凍干保護(hù)劑和水組成;

3)pcr試劑c由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合c、凍干保護(hù)劑和水組成;

4)pcr試劑d由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合d、凍干保護(hù)劑和水組成;

5)pcr試劑e由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合e、凍干保護(hù)劑和水組成;

6)pcr試劑f由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合f、凍干保護(hù)劑和水組成。

其中,所述凍干保護(hù)劑,由以下各原料制成:海藻糖、甘露醇、牛血清白蛋白和水。

所述凍干保護(hù)劑的制備方法為:稱取海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋白加入無菌水中,混勻,溶解。

其中,所述凍干保護(hù)劑中海藻糖的質(zhì)量濃度為2%-10%;

所述凍干保護(hù)劑中甘露醇的質(zhì)量濃度為1%-8%;

所述凍干保護(hù)劑中牛血清白蛋白的質(zhì)量濃度為1%-8%。

本發(fā)明提供了arms-qpcr試劑的制備方法,包括以下步驟:

1)將所述arms-qpcr試劑中pcr試劑a、pcr試劑b、pcr試劑c、pcr試劑d、pcr試劑e和pcr試劑f分別按照比例配制并混勻;

2)冷凍干燥,得到arms-qpcr試劑。

其中,所述冷凍干燥采用冷凍真空干燥,包括以下步驟:

1)預(yù)冷凍階段:板層溫度-35℃~-50℃,保持2-4h;

2)升華階段:真空度達(dá)到60pa以下,-35℃~10℃保持3-8h;

3)解析干燥階段:10℃~30℃保持1-6h。

本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr試劑盒,所述試劑盒包含以上arms-qpcr試劑。

本發(fā)明上述arms-qpcr引物組合物,arms-qpcr試劑或arms-qpcr試劑盒在制備用于幽門螺桿菌中cyp2c19的基因多態(tài)性的檢測、23srrna基因是否含有23srrna突變位點(diǎn)的檢測、gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突變的檢測的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的方法,包括以下步驟:

用上述arms-qpcr引物組合物,arms-qpcr試劑或arms-qpcr試劑盒分別對待測樣本進(jìn)行arms-qpcr檢測,得到擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)果判讀:

若a管和b管中fam/rox/cy5三個熒光通道均無擴(kuò)增曲線且無ct值,或ct>37,則該反應(yīng)無效,需重新提取待測樣本進(jìn)行測試;

若a管和b管中fam/rox/cy5三個熒光通道兩個擴(kuò)增管中至少其中一個ct≤37,則按照下表判讀結(jié)果:

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且c管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌23srrna基因含有23srrna突變位點(diǎn);

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且c管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct>7,則待測樣本中幽門螺桿菌23srrna基因不含有23srrna突變位點(diǎn);

若f管擴(kuò)增曲線為陰性或ct>32,說明待測樣本dna提取濃度過低或超出本方法檢測范圍,則需重新提取待測樣本;

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且d管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因含有n87k突變;

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且e管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因含有d91g/y/n突變;

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,d管和e管無s型擴(kuò)增曲線,或d管和e管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct>7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因不含n87k或d91g/y/n突變;

若f管擴(kuò)增曲線為陰性或ct>32,說明待測樣本dna提取濃度過低或超出本方法檢測范圍,則需重新提取待測樣本。

本發(fā)明的有益效果如下:

本發(fā)明基于arms-qpcr平臺,針對人cyp2c19基因和幽門螺桿菌的23srrna基因和gyra基因的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)arms-qpcr引物,提高了擴(kuò)增的特異性;本發(fā)明通過特異性的擴(kuò)增核酸dna,從而可以對微量的模板進(jìn)行富集,提高了檢測的靈敏度,可以檢測hp基因相關(guān)位點(diǎn)0.1-1%的突變和低至1ng的人cyp2c19基因的樣本dna。

本發(fā)明的檢測用試劑為凍干粉,能實(shí)現(xiàn)冷凍干燥,檢測時操作簡單,只需一步水化就能夠?qū)崿F(xiàn)檢測目的,提高了試劑的穩(wěn)定性,并且可以在常溫下運(yùn)輸和/或保存。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1示出幽門螺桿菌陽性樣本2的cyp2c19*2多態(tài)性位點(diǎn)的檢測結(jié)果。

圖2示出幽門螺桿菌陽性樣本2的cyp2c19*3多態(tài)性位點(diǎn)的檢測結(jié)果。

圖3示出幽門螺桿菌陽性樣本2的cyp2c19*17多態(tài)性位點(diǎn)的檢測結(jié)果。

圖4示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本1的23srrna基因的a2142g突變型的結(jié)果圖。

圖5示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本2的23srrna基因的a2143g突變型的結(jié)果圖。

圖6示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本3的23srrna基因的野生型的結(jié)果圖。

圖7示出幽門螺桿菌陽性樣本23srrna基因a2142g突變型的測序結(jié)果。

圖8示出幽門螺桿菌陽性樣本23srrna基因a2143g突變型的測序結(jié)果。

圖9示出幽門螺桿菌陽性樣本23srrna基因野生型的測序結(jié)果。

圖10示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本1的gyra基因的n87k突變型的結(jié)果圖。

圖11示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本2的gyra基因的d91g/y/n突變型的結(jié)果圖。

圖12示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本3的gyra基因的n87k野生型的結(jié)果圖。

圖13示出試劑盒檢測幽門螺桿菌陽性樣本3的gyra基因的d91g/y/n野生型的結(jié)果圖。

圖14示出液體試劑與凍干試劑復(fù)溶后檢測幽門螺桿菌陽性樣本2的23srrna基因的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說明本發(fā)明,下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的,不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的引物和探針

1、根據(jù)人cyp2c19基因三個位點(diǎn)的序列,設(shè)計(jì)并篩選特異性的引物和探針,用于檢測cyp2c19基因多態(tài)性的情況,序列具體如下:

上游引物*2:5’-gatcaggaagcaatcaataaagtcc-3’(seqidno.1)

cyp2c19*2g引物:5’-tcccactatcattgattatttcccg-3’(seqidno.2)

cyp2c19*2a引物:5’-tcccactatcattgattatttcgta-3’(seqidno.3)

taqman探針*2:5’-fam-aatatcactttccataaaagcaaggt-bhq1-3’(seqidno.4)

上游引物*3:5’-tcaaaaatgtacttcagggct-3’(seqidno.5)

cyp2c19*3g引物:5’-caggattgtaagcaccccctag-3’(seqidno.6)

cyp2c19*3a引物:5’-gattgtaagcaccccctga-3’(seqidno.7)

taqman探針*3:5’-rox-tgaaaacatcaggattgtaagcac-bhq2-3’(seqidno.8)

上游引物*17:5’-cctgttttatgaacaggatgaa-3’(seqidno.9)

cyp2c19*17c引物:5’-attatctcttacatcagagatg-3’(seqidno.10)

cyp2c19*17t引物:5’-attatctcttacatcagagata-3’(seqidno.11)

taqman探針*17:5’-cy5-taactaatgtttggaagttgttttgtt-bhq2-3’(seqidno.12)

根據(jù)幽門螺桿菌的23srrna基因的突變位點(diǎn)的基因序列,設(shè)計(jì)并篩選特異性的突變引物和探針,用于檢測幽門螺桿菌23srrna基因是否含有23srrna基因的突變位點(diǎn),序列具體如下:

上游引物-1:5’-ctataacggtcctaaggtagcga-3’(seqidno.13)

taqman探針-1:5’-fam-aattcctcctacccgcggcaagac-bhq1-3’(seqidno.14)

a2142g突變型引物:5’-taaaggtccacggggtcacc-3’(seqidno.15)

a2143g突變型引物:5’-tagtaaaggtccacggggtcgc-3’(seqidno.16)

根據(jù)幽門螺桿菌的gyra基因的突變位點(diǎn)的基因序列,設(shè)計(jì)并篩選特異性的突變引物和探針,用于檢測幽門螺桿菌gyra基因中是否含有n87k或d91g/y/n突變;

序列具體如下:

下游引物-1:5’-atttcttcactcgccttagtcattc-3’(seqidno.17)

taqman探針-2:5’-fam-tgagaatggcgcaagatttttccat-bhq13’(seqidno.18)

87k-1引物:5’-cacccccatggcgataaa-3’(seqidno.19)

87k-2引物:5’-cacccccatggcgatatg-3’(seqidno.20)

91n引物:5’-atggcgataatgcggtttcta-3’(seqidno.21)

91g引物:5’-atggcgataatgcggtttatag-3’(seqidno.22)

91y引物:5’-atggcgataatgcggtttact-3’(seqidno.23)

上游引物-2:5’-atttagcttattccatgagcgtgat-3’(seqidno.24)

下游引物-2:5’-gcgacttttgaagtaaggcctaatt-3’(seqidno.25)

外控探針:5’-fam-gctttaccggacgctagagatggct-bhq13’(seqidno.26)

實(shí)施例2用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的引物組合物

用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的引物組合物,為如下1)、2)、3)、4)、5)和6):

1)引物組合a由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2g引物、cyp2c19*3g引物、cyp2c19*17c引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17組成;

2)引物組合b由上游引物*2、上游引物*3、上游引物*17、cyp2c19*2a引物、cyp2c19*3a引物、cyp2c19*17t引物、taqman探針*2、taqman探針*3、taqman探針*17組成;

3)引物組合c由上游引物-1、a2142g突變型引物、a2143g突變型引物、taqman探針-1組成;

4)引物組合d由87k-1引物、87k-2引物、下游引物-1、taqman探針-2組成;

5)引物組合e由91n引物、91g引物、91y引物、下游引物-1、taqman探針-2組成;

6)引物組合f由上游引物-2、下游引物-2和外控探針組成。

實(shí)施例3用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的pcr試劑及檢測試劑盒的制備

1、用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的pcr試劑

用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的pcr試劑,為如下1)、2)、3)、4)、5)和6):

1)pcr試劑a由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合a、凍干保護(hù)劑和水組成;

2)pcr試劑b由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合b、凍干保護(hù)劑和水組成;

3)pcr試劑c由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合c、凍干保護(hù)劑和水組成;

4)pcr試劑d由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合d、凍干保護(hù)劑和水組成;

5)pcr試劑e由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合e、凍干保護(hù)劑和水組成;

6)pcr試劑f由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液、所述引物組合f、凍干保護(hù)劑和水組成。

2、檢測試劑盒的制備

2.1凍干保護(hù)劑的配制

稱取5g海藻糖、2.5g甘露醇和1.2g牛血清白蛋白加入100ml無菌水中,混勻,溶解。

2.2pcr試劑的配制

pcr試劑a反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、上游引物*20.75μl(終濃度0.3μm)、上游引物*30.75μl(終濃度0.3μm)、上游引物*170.5μl(終濃度0.2μm)、cyp2c19*2g引物0.75μl(終濃度0.3μm)、cyp2c19*3g引物0.75μl(終濃度0.3μm)、cyp2c19*17c引物0.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*20.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*30.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*170.25μl(終濃度0.1μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr試劑b反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、上游引物*20.75μl(終濃度0.3μm)、上游引物*30.75μl(終濃度0.3μm)、上游引物*170.5μl(終濃度0.2μm)、cyp2c19*2a引物0.75μl(終濃度0.3μm)、cyp2c19*3a引物0.75μl(終濃度0.3μm)、cyp2c19*17t引物0.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*20.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*30.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針*170.25μl(終濃度0.1μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr試劑c反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、上游引物-11.5μl(終濃度0.6μm)、a2142g突變型引物0.75μl(終濃度0.3μm)、a2143g突變型引物0.75μl(終濃度0.3μm)、taqman探針-10.5μl(終濃度0.2μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr試劑d反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、下游引物-11.5μl(終濃度0.6μm)、87k-1引物0.5μl(終濃度0.2μm)、87k-2引物0.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針-20.5μl(終濃度0.2μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr試劑e反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、下游引物-11.5μl(終濃度0.6μm)、91n引物0.5μl(終濃度0.2μm)、91g引物0.5μl(終濃度0.2μm)、91y引物0.5μl(終濃度0.2μm)、taqman探針-20.5μl(終濃度0.2μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr試劑f反應(yīng)體系,由pcr擴(kuò)增反應(yīng)液12.5μl、上游引物-21μl(終濃度0.4μm)、下游引物-21μl(終濃度0.4μm)、外控探針0.5μl(終濃度0.2μm),上述凍干保護(hù)劑2μl,用水將體系補(bǔ)至23μl。

pcr反應(yīng)總體積為25μl,含23μl的反應(yīng)體系和2μl的檢測模板。

2.3pcr試劑的冷凍干燥

將配制好的pcr試劑a-pcr試劑f放入凍干機(jī)中,板層溫度-35℃~-50℃下保持2-4h,真空度達(dá)到60pa以下,-35℃~10℃保持3-8h,然后10℃~30℃保持1-6h,最終得到凍干試劑。

2.4試劑盒組成

試劑盒采用8聯(lián)pcr管設(shè)計(jì),每一個8聯(lián)管檢測一個樣品,試劑盒組成成分如下:

1)八聯(lián)pcr反應(yīng)管:a-f號管為pcr凍干試劑a-f,g和h號管為空管;

2)陽性質(zhì)控品:人工合成的質(zhì)粒混合凍干粉。

實(shí)施例4試劑盒檢測方法

1.樣本基因組dna提取

從人胃黏膜組織樣本中提取dna,推薦使用商業(yè)化的提取試劑盒進(jìn)行樣本1-3的提??;

提取的dna需用紫外分光光度計(jì)測定濃度,其dna的od260/od280在1.8-2.0,提取完的dna建議立即進(jìn)行檢測,否則請于-20℃以下保存。

2.pcr檢測

用23μl純化水將pcr凍干試劑a-f復(fù)溶,然后分別加入2μl的提取dna,樣本1-3均分別在a-f號管中進(jìn)行反應(yīng)。

pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃udg酶反應(yīng)2min,95℃預(yù)變性5min,95℃變性15s,60℃退火延伸45s,40個循環(huán),60℃時收集熒光。

3.結(jié)果判讀

1)人cyp2c19基因多態(tài)性的判讀

參照附圖:圖1、圖2、圖3。

若a管和b管中fam/rox/cy5三個熒光通道均無擴(kuò)增曲線且無ct值,或ct>37,則該反應(yīng)無效,需重新提取樣本進(jìn)行測試。

若a管和b管中fam/rox/cy5三個熒光通道兩個擴(kuò)增管中至少其中一個ct≤37,(靶基因通道無擴(kuò)增曲線,ct值按40計(jì)算),則按照下表判讀結(jié)果:

2)hp23srrna基因突變情況的判讀

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且c管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌23srrna基因含有23srrna突變位點(diǎn);參照圖4的δct=3、圖5的δct=0.5。

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且c管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct>7,則待測樣本中幽門螺桿菌23srrna基因不含有23srrna突變位點(diǎn);參照圖6的δct=12。

若f管擴(kuò)增曲線為陰性或ct>32,說明樣本dna提取濃度過低或超出本方法檢測范圍,建議重新提取樣本。

本試劑盒的檢測結(jié)果與對應(yīng)樣本的測序結(jié)果一致,測序結(jié)果見圖7、圖8、圖9。

3)hpgyra基因突變情況的判讀

參照附圖:圖10、圖11、圖12、圖13。

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且d管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因含有n87k突變;

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,且e管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct≤7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因含有d91g/y/n突變;

若f管有擴(kuò)增s型曲線且ct≤32,d管和e管無s型擴(kuò)增曲線,或d管和e管有s型擴(kuò)增曲線且其與f管的擴(kuò)增曲線δct>7,則待測樣本中幽門螺桿菌gyra基因不含n87k或d91g/y/n突變;

若f管擴(kuò)增曲線為陰性或ct>32,說明樣本dna提取濃度過低或超出本方法檢測范圍,建議重新提取樣本。

實(shí)施例5試劑盒的臨床應(yīng)用

本實(shí)施例中收集臨床病理診斷為幽門螺桿菌陽性的50例患者的胃黏膜組織塊,并從中提取基因組dna。用個體化基因檢測試劑盒檢測樣本,具體步驟如下:

1.樣本基因組dna提取

胃黏膜組織樣本的提取使用商業(yè)化的提取試劑盒,按說明書進(jìn)行提取待檢測樣本基因組dna,將抽提好的dna樣本,用紫外分光光度計(jì)測定濃度和dna質(zhì)量,dna的濃度要求大于10ng/μl,dna的質(zhì)量od260/od280在1.8-2.0之間。

2.熒光pcr檢測

按實(shí)施例4的2方法和3判讀中方法進(jìn)行檢測。

3.結(jié)果統(tǒng)計(jì)

胃黏膜樣本中,均可對人cyp2c19基因?qū)?yīng)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確分型,其結(jié)果與測序結(jié)果的符合率高達(dá)99%以上。

幽門螺桿菌陽性樣本中,6例檢測出含有23srrna基因a2142g或a2143g突變,其中突變型或野生型與測序結(jié)果一致。上述野生型樣本和突變型樣本與藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照,結(jié)果突變型樣本克拉霉素耐藥,野生型樣本克拉霉素敏感。

幽門螺桿菌陽性樣本中,5例檢測出含有g(shù)yra基因第87位或第91位氨基酸突變,其中突變型或野生型與測序結(jié)果一致。上述野生型樣本和突變型樣本與藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果對照,結(jié)果突變型樣本左氧氟沙星耐藥,野生型樣本左氧氟沙星敏感。

另外,本發(fā)明比較了凍干試劑和液體試劑對對幽門螺桿菌陽性樣本的檢測效果,結(jié)果證明,凍干試劑復(fù)溶后對幽門螺桿菌陽性樣本的檢測效果與液體試劑的檢測效果相當(dāng),見附圖14。

顯然,本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例,而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定,對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說,在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動,這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉,凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。

sequencelisting

<110>孫曉彥

<120>用于幽門螺桿菌個體化基因檢測的arms-qpcr方法和試劑盒

<130>jlc17i0386e

<160>26

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>人工合成上游引物*2

<400>1

gatcaggaagcaatcaataaagtcc25

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*2g引物

<400>2

tcccactatcattgattatttcccg25

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*2a引物

<400>3

tcccactatcattgattatttcgta25

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>人工合成taqman探針*2

<400>4

aatatcactttccataaaagcaaggt26

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工合成上游引物*3

<400>5

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<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*3g引物

<400>6

caggattgtaagcaccccctag22

<210>7

<211>19

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*3a引物

<400>7

gattgtaagcaccccctga19

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>人工合成taqman探針*3

<400>8

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<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工合成上游引物*17

<400>9

cctgttttatgaacaggatgaa22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*17c引物

<400>10

attatctcttacatcagagatg22

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工合成cyp2c19*17t引物

<400>11

attatctcttacatcagagata22

<210>12

<211>27

<212>dna

<213>人工合成taqman探針*17

<400>12

taactaatgtttggaagttgttttgtt27

<210>13

<211>23

<212>dna

<213>人工合成上游引物-1

<400>13

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<210>14

<211>24

<212>dna

<213>人工合成taqman探針-1

<400>14

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<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工合成a2142g突變型引物

<400>15

taaaggtccacggggtcacc20

<210>16

<211>22

<212>dna

<213>人工合成a2143g突變型引物

<400>16

tagtaaaggtccacggggtcgc22

<210>17

<211>25

<212>dna

<213>人工合成下游引物-1

<400>17

atttcttcactcgccttagtcattc25

<210>18

<211>25

<212>dna

<213>人工合成taqman探針-2

<400>18

tgagaatggcgcaagatttttccat25

<210>19

<211>18

<212>dna

<213>87k-1引物

<400>19

cacccccatggcgataaa18

<210>20

<211>18

<212>dna

<213>人工合成87k-2引物

<400>20

cacccccatggcgatatg18

<210>21

<211>21

<212>dna

<213>人工合成91n引物

<400>21

atggcgataatgcggtttcta21

<210>22

<211>22

<212>dna

<213>人工合成91g引物

<400>22

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<210>23

<211>21

<212>dna

<213>人工合成91y引物

<400>23

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<210>24

<211>25

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<213>人工合成上游引物-2

<400>24

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<210>25

<211>25

<212>dna

<213>人工合成下游引物-2

<400>25

gcgacttttgaagtaaggcctaatt25

<210>26

<211>25

<212>dna

<213>人工合成外控探針

<400>26

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