本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種提高釀酒酵母蔗糖發(fā)性能的方法及其應用。

背景技術(shù)：

進入21世紀以來，隨著化石能源的日益枯竭和生態(tài)環(huán)境的加劇惡化，近幾年來出現(xiàn)的有關(guān)能源危機和生態(tài)危機的論述已被世界各國所關(guān)注。針對目前的這些問題，世界各國都相繼提出發(fā)展實施可再生能源戰(zhàn)略，而生物質(zhì)能源作為一種可持續(xù)再生的能源是化石燃料的理想替代品。

微生物能夠利用自然界中的多種生物質(zhì)原料如纖維質(zhì)、淀粉質(zhì)和糖質(zhì)，將其作為碳源通過發(fā)酵生產(chǎn)生物質(zhì)能源。纖維質(zhì)原料是世界上產(chǎn)量最大且最具使用潛力的微生物碳源，是可持續(xù)的為人類提供物質(zhì)和能源需求的可再生生物質(zhì)資源(guptaa,vermajp.2015，sustainablebio-ethanolproductionfromagro-residues:areview.renewableandsustainableenergyreviews,41:550-567)。淀粉質(zhì)原料作為微生物的碳源，也是工業(yè)上應用最多的一類生物質(zhì)，通常用來生產(chǎn)稀有生物化學產(chǎn)品(ngtk,buscherm,mcdonaldcc,etal.1983，productionoffeedstockchemicals.science,219(4585):733-740)。在工業(yè)生產(chǎn)上，用木薯淀粉作為微生物碳源，通過生物發(fā)酵可用生產(chǎn)乙醇、氨基酸、小分子有機酸以及單糖等產(chǎn)品(田宜水,孫麗英,孟海波,等.2011，中國木薯燃料乙醇原料供需現(xiàn)狀和預測.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究,2(03):340-343)。糖質(zhì)原料作為微生物的碳源被最多最廣泛的使用，在世界范圍內(nèi)，超過60％燃料乙醇都是用糖質(zhì)原料生產(chǎn)的(wilkieac,riedeselkj,owensjm.2000,stillagecharacterizationandanaerobictreatmentofethanolstillagefromconventionalandcellulosicfeedstocks.biomassandbioenergy,19(2):63-102)。與蔗糖生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化相比較，淀粉生物質(zhì)必須首先被水解成可用于微生物發(fā)酵的糖；纖維素生物質(zhì)同樣需要復雜的處理轉(zhuǎn)化成可用于發(fā)酵的糖，才能做進一步的生化轉(zhuǎn)化；而蔗糖生物質(zhì)作為微生物的一種廉價碳源，可直接用于發(fā)酵生產(chǎn)。

我國是人口大國家，近幾年來隨著經(jīng)濟的高速發(fā)展，對能源的需求量正在逐年增大。如果單獨的依賴化石能源，不僅難以滿足能源的需求，而且還會帶來更多生態(tài)環(huán)境問題，難以實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展目標。因此，我國大力發(fā)展可再生生物能源，并且將其應用在不同的行業(yè)中就顯得十分迫切。廣西作為中國主要的甘蔗種植區(qū)和蔗糖產(chǎn)區(qū)(李明，田洪春，黃智剛等.我國甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀研究.中國糖料，2017,39(1):67-70)，發(fā)展非糧生物乙醇有著巨大的資源優(yōu)勢(譚宏偉，周柳強，謝如林等.蔗糖生產(chǎn)中的有機廢棄物資源化利用研究.大眾科技，2016，18(5):110-112)。

釀酒酵母(s.cerevisiae)是一種重要的工業(yè)微生物，作為生物發(fā)酵資源有著獨特的性能。目前在工業(yè)上乙醇的生產(chǎn)，有很多重要的的因素被考慮，如菌株的糖耐受性(朱寶生,劉功良,白衛(wèi)，等.2016,耐高糖酵母篩選及其高糖脅迫機制的研究進展.35(6):11-14)和乙醇受性(張強，郭元，韓德明.2014,釀酒酵母乙醇耐受性的研究進展.33(1):187-192)。耐高糖和高乙醇濃度是制約發(fā)展微生物工業(yè)化規(guī)模的重要因素，關(guān)于如何提高釀酒酵母耐受高濃度蔗糖發(fā)酵的研究是當前乙醇發(fā)酵工藝中的研究熱點之一，也是解決釀酒酵母高效利用蔗糖生產(chǎn)生物乙醇的重要途徑之一。

釀酒酵母對蔗糖的利用可以通過胞內(nèi)和胞外兩種代謝途徑實現(xiàn)(bassoto,koksd,dariom,etal.engineeringtopologyandkineticsofsucrosemetabolisminsaccharomycescerevisiae,forimprovedethanolyield.metabolicengineering,2011,13(6):694-703)。然而，由于釀酒酵母自身的蔗糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對蔗糖的轉(zhuǎn)運能力有限，主要依靠一些具有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白功能的基因(如mal11，mal21，mal31，mph2，mph3)完成蔗糖的跨膜轉(zhuǎn)運(marqueswl,mansr,marellaer,etal.eliminationofsucrosetransportandhydrolysisinsaccharomycescerevisiae:aplatformstrainforengineeringsucrosemetabolism.femsyeastresearch,2017,17(1))。basso等人的研究表明，蔗糖的胞內(nèi)代謝效率比胞外代謝更高效，更有利于生物乙醇的生產(chǎn)(bassoto,koksd,dariom,etal.engineeringtopologyandkineticsofsucrosemetabolisminsaccharomycescerevisiae,forimprovedethanolyield.metabolicengineering,2011,13(6):694-703)。

以釀酒酵母和乙醇為關(guān)鍵詞查找國家知識產(chǎn)權(quán)局專利檢索數(shù)據(jù)庫，共出現(xiàn)17項發(fā)明專利。其中有7項是關(guān)于釀酒酵母菌株在乙醇生產(chǎn)相關(guān)的應用，其余10項是表述釀酒酵母在其他領(lǐng)域上的應用。而與釀酒酵母乙醇生產(chǎn)相關(guān)的7項發(fā)明專利中涉及到釀酒酵母的乙醇和糖耐受性相關(guān)的研究有3項，其余4項是關(guān)于改變釀酒酵母乙醇產(chǎn)量的研究。然而，蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白在參與蔗糖代謝方面的研究沒有，關(guān)于蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1在釀酒酵母中提高蔗糖發(fā)酵性能的研究也沒有被報道。利用本發(fā)明獲得了一種提高酵母蔗糖高效利用的方法，將極大的促進蔗糖生物質(zhì)在生物燃料和高附加值化學品生產(chǎn)工業(yè)中的應用，同時還為釀酒酵母高密度發(fā)酵工藝的改進提供了一個有利的技術(shù)平臺。

公開于該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對本發(fā)明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用基因工程的方法，在釀酒酵母中成功的實現(xiàn)了蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白sut1的異源表達，再利用發(fā)酵工程的方法，以蔗糖為唯一碳源的條件下直接發(fā)酵蔗糖生產(chǎn)生物乙醇。利用該方法不僅提高了釀酒酵母對蔗糖的高效利用和乙醇的發(fā)酵效率，而且還提高了蔗糖的發(fā)酵濃度。

本發(fā)明的方法中用于異源表達的目的基因是來自馬鈴薯基因組的蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1，該基因sut1序列的genebank登錄號為nm_001318624.1。通過在釀酒酵母中表達蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白sut1，提高酵母的蔗糖轉(zhuǎn)運效率，使酵母更高效的利用蔗糖，從而提高酵母的蔗糖發(fā)酵性能。

本發(fā)明的實施中涉及一個含有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1的高拷貝表達載體，及用于實現(xiàn)本發(fā)明的宿主菌株如：釀酒酵母模式菌株或工業(yè)菌株。

本發(fā)明提供的提高釀酒酵母蔗糖發(fā)性能的方法在釀酒酵母中實現(xiàn)高效發(fā)酵蔗糖產(chǎn)乙醇中的應用，包含如下步驟：

(1)平板培養(yǎng)：將釀酒酵母sc1-st菌株劃線在ypd固體平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間2-3天；

(2)種子液培養(yǎng)：將步驟1)中平板培養(yǎng)基上的釀酒酵母sc1-st菌株接種到種子培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間16-20小時；

(3)發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟2)中培養(yǎng)的釀酒酵母sc1-st菌株的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)液中，調(diào)整初始細胞od600值為0.5，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間48-72小時。

本發(fā)明提供的上述方法，在釀酒酵母中實現(xiàn)高效發(fā)酵蔗糖產(chǎn)乙醇中的應用，包含用于發(fā)酵的底物為蔗糖、糖蜜和甘蔗汁中的至少一種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明構(gòu)建了一個異源表達蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1的重組釀酒酵母菌株sc1-st，菌株sc1-st以蔗糖為唯一碳源的培養(yǎng)基中能夠快速發(fā)酵蔗糖生產(chǎn)生物乙醇。

(2)與野生菌株發(fā)酵蔗糖相比較，本發(fā)明構(gòu)建的sc1-st菌株發(fā)酵蔗糖的方法極顯著的提高了釀酒酵母蔗糖發(fā)酵性能，包括生物質(zhì)產(chǎn)量、乙醇產(chǎn)率和蔗糖消耗率都有了極顯著的增加。由此證實利用蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白提高釀酒酵母蔗糖發(fā)酵性能的方法，在工業(yè)應用中將具備高效發(fā)酵蔗糖生產(chǎn)生物乙醇和稀有生化產(chǎn)品的潛力。

附圖說明

圖1為質(zhì)粒prs426k、目的基因sut1的pcr擴增產(chǎn)物和重組質(zhì)粒prs6k-sut1的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2為重組酵母菌株sc1-st中驗證目的基因sut1的pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖3為在蔗糖濃度為10％的培養(yǎng)基中，重組目的菌株sc1-st與對照菌株sc1蔗糖發(fā)酵性能的結(jié)果比對圖；

圖4為在蔗糖濃度為20％的培養(yǎng)基中，重組目的菌株sc1-st與對照菌株sc1蔗糖發(fā)酵性能的結(jié)果比對圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的較佳實施例進行詳細闡述，以使本發(fā)明的優(yōu)點和特征能更易于被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，從而對本發(fā)明的保護范圍做出更為清楚明確的界定。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料和試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1：含蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1的表達載體prs6k-sut1的構(gòu)建

利用pcr技術(shù)獲得目的基因sut1，大小1551bp(pcr上游引物：5＇-aaaacaggatcccccaaaaatggagaatggtacaaaaag-3＇，下游引物：5＇-gaattcctgcagcccttatttaatggaaagccccatg-3＇，小寫部分是與載體同源序列，劃線部分是kozak序列。pcr反應程序為：98℃預變性3min，98℃10s，53℃15s，72℃2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min)，再利用限制性內(nèi)切酶smalⅰ酶切線性化表達載體prs426k，大小6636bp。

最后利用taraka公司的hdcloningkit將兩個dna片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109感受態(tài)細胞，在含100mg/ml氨芐青霉素的la抗性平板上篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子，再將得到陽性轉(zhuǎn)化子送華大基因公司測序，最后將測序結(jié)果完全正確的重組表達質(zhì)粒命名為prs6k-sut1。

實施例2：異源表達sut1基因重組酵母菌株sc1-st的構(gòu)建

釀酒酵母s.cerevisiaeinvsc1作為出發(fā)菌株，將含有蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達質(zhì)粒prs6k-sut1和空載質(zhì)粒prs426k，通過醋酸鋰高效轉(zhuǎn)化法(gietzandschiestl,2007,quickandeasyyeasttransformationusingtheliac/sscarrierdna/pegmethod,nat.protoc.,2(1):35-37)分別導入s.cerevisiaeinvsc1中，在篩選平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子。

篩選平板培養(yǎng)基為尿嘧啶(ura)營養(yǎng)缺陷型：ynb酵母基礎氮源6.7g/l，葡萄糖20g/l，組氨酸30mg/l，亮氨酸60mg/l，色氨酸30mg/l，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間3-5天。從選擇平板上挑選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)過菌落pcr驗證獲得陽性重組菌株(pcr反應程序為：98℃預變性10min，98℃10s，53℃15s，72℃2min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min)，pcr電泳結(jié)果如圖2所示。

將通過以上方法構(gòu)建的重組s.cerevisiae菌株命名為sc1-st，空載對照菌株命名為sc1。

實施例3：菌株sc1-st在蔗糖為唯一碳源的條件下蔗糖發(fā)酵性能檢測

(1)將釀酒酵母菌株sc1-st劃線于ypd固體平板上(ypd固體培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，瓊脂粉15g/l)，放置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，挑選單菌落接種于種子培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(種子培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l)，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化培養(yǎng)2次。

(2)將上述活化過的菌株sc1-st接種于100ml蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中(發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，蔗糖10％和20％)，初始細胞od600值為0.5，放置于30℃、100rpm的條件下培養(yǎng)，定時取樣檢測。每個實驗做3個平行，求取平均值，獨立重復3次。

分別利用高效液相色譜(戴安3000)和氣相色譜(安捷倫7820)分析檢測發(fā)酵液中蔗糖殘余量和乙醇含量。

氣象色譜條件：儀器：安捷倫7820；檢測器：fid檢測器，溫度325℃；色譜柱型號：zebronzb-wax；前進樣口溫度：250℃；柱溫：100℃；分流比：15︰1；檢測器氣流量：氫氣流量40ml/min，空氣流量450ml/min；載氣為氮氣，0.5％的乙腈作為內(nèi)標物。

高效液相色譜條件：儀器：戴安3000色譜儀；色譜柱：氨基柱；流動相：乙腈：水(75：25)；流速：1.0ml/min；檢測器：rid(折光檢測器)。

由圖3可知，重組目的菌株sc1-st可以利用蔗糖作為發(fā)酵碳源，在蔗糖濃度為10％的培養(yǎng)基中，重組目的菌株sc1-st可以在36小時內(nèi)耗盡所有蔗糖，在36小時發(fā)酵結(jié)束時，乙醇含量達到43.7g/l；而對照菌株在48小時發(fā)酵結(jié)束時，乙醇含量為43.0g/l。

可見，重組目的菌株的發(fā)酵時間比對照菌株提前了12小時，糖的消耗速率也高于對照菌株。重組目的菌株sc1-st發(fā)酵的生物量和乙醇產(chǎn)率，較對照菌株分別提高了76％和35％。

由圖4可以看出，在蔗糖濃度為20％的培養(yǎng)基中，與對照菌株相比較，重組目的菌株的蔗糖發(fā)酵性能得到明顯的提高。在發(fā)酵工程中目的菌株的生長速率、糖消耗速率和乙醇產(chǎn)率均顯著的高于對照菌株。發(fā)酵結(jié)束時，目的菌株的乙醇含量為90.1g/l，蔗糖完全耗盡，而對照菌株的乙醇含量為84g/l，殘?zhí)呛繛?5.2g/l。重組目的菌株sc1-st發(fā)酵的生物量和乙醇產(chǎn)率，較對照菌株分別提高了54％和60％。通過與10％的蔗糖發(fā)酵結(jié)果相比較，實施本發(fā)明的方法，可以顯著提高酵母在高糖濃度下蔗糖的發(fā)酵性能。用初始總糖量為20％的糖蜜為發(fā)酵培養(yǎng)基進行上述實驗，也同樣得到了相同的結(jié)果。

綜上所述，通過在釀酒酵母中異源表達蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白基因sut1的方法，不僅顯著的提高了釀酒酵母的蔗糖發(fā)酵性能，同時也提高釀酒酵母對蔗糖的耐受性。

前述對本發(fā)明的具體示例性實施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導，可以進行很多改變和變化。對示例性實施例進行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實際應用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實施方案以及各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。