本發(fā)明涉及含吡唑啉結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物，其幾何異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或前藥，它們的制備方法以及含有所述化合物的藥物組合物。

背景技術(shù)：

腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對其生長的正常調(diào)控導(dǎo)致異常增生與分化而形成的新生物。新生物一旦形成，不因病因消除而停止生長，他的生長不受正常機(jī)體生理調(diào)節(jié)，而是破壞正常組織與器官，這一點(diǎn)在惡性腫瘤尤其明顯。與良性腫瘤相比，惡性腫瘤生長速度快，呈浸潤性生長，易發(fā)生出血、壞死、潰瘍等，并常有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，造成人體消瘦、無力、貧血、食欲不振、發(fā)熱以及嚴(yán)重的臟器功能受損等，最終造成患者死亡。由于pi3k通路，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用，因此以pi3k/akt信號通路中關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的小分子抑制劑已成為當(dāng)前抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，近年來，隨著pi3k通路抑制劑的深入研究，越來越多的相關(guān)抑制劑被報道，其中一批脂肪環(huán)并嘧啶類化合物被證實(shí)具有很好的pi3k/mtor抑制活性以及良好的體內(nèi)、藥代動力學(xué)活性。文獻(xiàn)報道的gdc-0941(如下結(jié)構(gòu)式所示)屬于噻吩并嘧啶類化合物，是由genentech公司開發(fā)的口服pi3k抑制劑，目前已完成i期臨床試驗(yàn)。gdc-0941對p110α和δ的ic50值均達(dá)到3nm，為p110β、γ的10倍和25倍，具有良好的選擇性。臨床前研究表明，gdc-0941對多種人腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出顯著的抑制增殖作用，其ic50值達(dá)0.009ug/ml。課題組前期工作中以gdc-0941為先導(dǎo)化合物，進(jìn)一步改造得到的化合物a也表現(xiàn)出了良好的抗腫瘤活(如下結(jié)構(gòu)式所示)，文獻(xiàn)(synthesis,characterizationandpharmacologicalstudyof4,5-dihydropyrazolinescarryingpyrimidinemoiety[j].europeanjournalofmedicinalchemistry,55(2012)467-474.)和(novel3,5-diarylpyrazolinesashumanbioorganic&medicinalchemistryletters14(2004)2715–2717)報道了一系列新穎的吡唑啉衍生物，其中化合物b，c，d顯示出非常優(yōu)良的抗腫瘤活性。gdc-0941、化合物a、b，c，d的結(jié)構(gòu)式如下：

本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一系列噻吩并嘧啶類化合物，此系列化合物保留了噻吩并嘧啶的主體結(jié)構(gòu)的同時引入了吡唑啉活性基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成了多種噻吩并嘧啶類化合物。本發(fā)明著重考察的是不同取代的噻吩并嘧啶類化合物的抗腫瘤活性，以期篩選出活性與選擇性更佳的抗腫瘤藥物。經(jīng)體外對多種pi3k/mtor抑制劑高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行抗腫瘤活性篩選，結(jié)果表明具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性和選擇性，許多化合物還進(jìn)行了pi3kα和mtor激酶的體內(nèi)活性測試。實(shí)驗(yàn)表明某些化合物具有高效的抗腫瘤活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供如通式ⅰ所示的噻吩并嘧啶類化合物，其幾何異構(gòu)體及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或前藥，通式i如下：

其中

x＝s，y＝ch或x＝ch，y＝s；

r1選自h、

r2選自h或-ch3；

ar1、ar2分別為苯基、萘基、吡啶基、噻吩基，所述苯基、萘基、吡啶基、噻吩基任選1～4個相同或不同的r3取代；

r3為1～4個相同或不同的選自氫、鹵素、羥基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、疊氮基、硝基、氰基、巰基、c1～c4)烷基、c3～c6環(huán)烷基、c1～c4烯基、c1～c4炔基、c1～c4烷氧基、c1～c4烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、c1～c4烷氧基甲基、c1～c4烷基?；騝1～c3亞烷基二氧基的取代基。

選自：

本發(fā)明優(yōu)選涉及如上述通式ⅰ的化合物、其幾何異構(gòu)體、及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物、溶劑化物或前藥，

其中，

x＝s，y＝ch或x＝ch，y＝s；

r1選自h、

r2選自h；

ar1、ar2分別為苯基、萘基、吡啶基、噻吩基，所述苯基、萘基、吡啶基、噻吩基任選1～4個相同或不同的r3取代；

r3選自氫、鹵素、羥基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基、疊氮基、硝基、氰基、巰基、(c1～c4)烷基、(c3～c6)環(huán)烷基、(c1～c4)烯基、(c1～c4)炔基、(c1～c4)烷氧基、(c1～c4)烷硫基、烯丙基、(2-甲基)烯丙基、(c1～c4)烷氧基甲基、(c1～c4)烷基?；?c1～c3)亞烷基二氧基的取代基。

選自：

所述通式i的噻吩并嘧啶類化合物為選自下列化合物中的一種，但這些化合物并不意味著對本發(fā)明的任何限制：

(1)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(2)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(3)4-(2-(3,5-雙(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(4)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

(5)4-(2-(3-(4-溴苯基)-5-(3,4-二氯苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

(6)4-(2-(3,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(7)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

(8)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

(9)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

(10)4-(2-(3-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(11)4-(2-(5-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

(12)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(13)2-巰基-3-((6-(1-(4-嗎啉代-6-(1,1,1-三氟-2-羥基丙-2-基)噻吩并[2,3-d])-3-(5-(丙-2-炔-1-基)吡啶-2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-5-基)吡啶-3-基)硫基)琥珀酸

(14)6-(1-(4-((s)-3-甲基嗎啉代)-6-嗎啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)-3--2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-5-基)煙腈

(15)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(16)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(17)4-(2-(3,5-雙(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(18)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

(19)4-(2-(3-(4-溴苯基)-5-(3,4-二氯苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

(20)4-(2-(3,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(21)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

(22)4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

(23)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嗎啉

(24)4-(2-(3-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(25)4-(2-(5-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嗎啉

(26)4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

(27)1,1,1-三氟甲基-2-(2-(3-(5-甲基吡啶-2-基)-5-(5-甲硫基吡啶-2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)-4-嗎啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)噻喃-2-醇

(28)6-(1-(4,6-二嗎啉基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)-3-(5-(((甲硫基)甲基)硫基)吡啶-2-基)(5-氯-2,3-二氫-1h-吡唑-5-基)煙腈

下面的合成路線描述了本發(fā)明通式i含吡結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶化合物的制備，所有的原料都是通過合成路線中描述的方式、通過有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法制備的或者可商購。本發(fā)明的全部最終衍生物都是通過合成路線中描述的方法或通過與其類似的方法制備的，這些方法是有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。合成路線中應(yīng)用的全部可變因數(shù)如下文的定義或如權(quán)利要求中的定義。

路線1目標(biāo)化合物的合成路線

本發(fā)明通過路線1首先合成中間體a1，再與含不同取代基查爾酮側(cè)鏈反應(yīng)，得到目標(biāo)化合物。

按照本發(fā)明所屬領(lǐng)域的一些通常方法，本發(fā)明中上述通式i的含吡唑啉結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物可以與酸生成藥學(xué)上可接受的鹽?？伤幱眉映甥}包括無機(jī)酸和有機(jī)酸加成鹽，與下列酸加成的鹽是特別優(yōu)選的：鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、丙酸、乳酸、三氟乙酸、馬來酸、檸檬酸、富馬酸、草酸、酒石酸、苯甲酸等。

此外，本發(fā)明還包括本發(fā)明衍生物的前藥。本發(fā)明衍生物的前藥是上述通式i的衍生物，它們自身可能具有較弱的活性甚至沒有活性，但是在給藥后，在生理?xiàng)l件下(例如通過代謝、溶劑分解或另外的方式)被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的生物活性形式。

本發(fā)明可以含有上述通式i的含吡唑啉結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物，及其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑化物作為活性成份，與藥學(xué)上可接受的載體或賦型劑混合制備成組合物，并制備成臨床上可接受的劑型，上述藥學(xué)上可接受的賦型劑是指任何可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。本發(fā)明的衍生物可以與其他活性成份組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。

本發(fā)明上述通式i的含吡唑啉結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物用于患者的臨床劑量可以根據(jù)：活性成分在體內(nèi)的治療功效和生物利用度、它們的代謝和排泄速率和患者的年齡、性別、疾病期來進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，不過成人的每日劑量一般應(yīng)當(dāng)為20～600mg，優(yōu)選為60～400mg。因此，當(dāng)本發(fā)明的藥物組合物被制成單位劑型時，考慮到上述有效劑量，每單位制劑應(yīng)當(dāng)含有20～600mg上式通式ⅰ的含吡唑啉結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物，優(yōu)選為60～400mg。按照醫(yī)生或藥師的指導(dǎo)，這些制劑可以以一定間隔分若干次給藥(優(yōu)選為一至五次)。

本發(fā)明的藥用組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥物領(lǐng)域中一些常用的賦形劑。如上所述的若干種劑型可以采用注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑等劑型藥物。

用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥物領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑、防腐劑、加溶劑和基質(zhì)等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。

本發(fā)明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗增生性藥物單獨(dú)使用，或者可以與現(xiàn)已上市的抗增生性藥物聯(lián)合使用，用于治療和/或預(yù)防增生性疾病，如牛皮癬、良性前列腺肥大、動脈粥樣硬化和再狹窄。

本發(fā)明化合物體外具有抑制腫瘤細(xì)胞生長活性，因此，它可以用作制備治療和/或預(yù)防癌癥的藥物，如肺癌、肝癌、前列腺癌等。

通過體外抑制肺癌細(xì)胞a549、人前列腺癌細(xì)胞pc-3和肝癌細(xì)胞hepg2活性試驗(yàn)，本發(fā)明化合物對肺癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞以及肝癌細(xì)胞具有顯著抑制作用，特別用于制備治療和/或預(yù)防前列腺癌、肺癌和肝癌的藥物。

本發(fā)明的活性化合物或其可藥用鹽及其溶劑化物可作為唯一的抗腫瘤藥物單獨(dú)使用，或者可以與現(xiàn)已上市的抗腫瘤藥物(如鉑類藥物順鉑、喜樹堿類藥物伊立替康、長春花堿類藥物諾維本、脫氧胞昔類藥物吉西他濱、足葉乙甙、紫杉醇等)聯(lián)合使用。聯(lián)合治療通過將各個治療組分同時、順序或隔開給藥來實(shí)現(xiàn)。

具體實(shí)施方式：

為了更地解釋本發(fā)明以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但它們不對本發(fā)明構(gòu)成限定。

實(shí)施例旨在闡述而不是限制本發(fā)明的范圍。衍生物的核磁共振氫譜用brukerarx-400測定，質(zhì)譜用agilent1100lc/msd測定；所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

通式i的噻吩并嘧啶化合物：

本發(fā)明實(shí)施例1-28的結(jié)構(gòu)式如下表1所示

表1實(shí)施例1～28的結(jié)構(gòu)式

步驟a4-(2-肼噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉(a1)的制備

向裝有2.5g4-(2-氯噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉的燒瓶中加入100ml(80％)水合肼，升溫至80℃，反應(yīng)5h,析出固體，抽濾，得淡黃色產(chǎn)物4-(2-肼噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉(a1)

步驟b4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

將查爾酮(0.001mol)、4-(2-肼噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉(0.001mol)溶于13ml乙醇中，逐滴滴加1ml10％naoh溶液，，加畢反應(yīng)15min，tlc檢測反應(yīng)完全后停止反應(yīng)。

向反應(yīng)液中加適量的水并用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph為6-7，析出固體，攪拌10min，抽濾，濾餅干燥。

實(shí)施例1

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

先按照步驟a合成中間體a1，最后中間體a1通過步驟e與查爾酮反應(yīng)，得到4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉。

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.11(d,j＝5.5hz,1h),7.84(dd,j＝8.5,5.6hz,2h),7.57(dd,j＝9.7,5.0hz,2h),7.30(dd,j＝11.3,6.8hz,3h),7.22(d,j＝8.3hz,1h),5.73(dd,j＝12.0,6.0hz,1h),3.89(dd,j＝17.8,12.2hz,1h),3.78–3.50(m,9h).

按照實(shí)施例1的方法，先按照步驟a合成中間體a1，最后中間體a1通過步驟e與含不同取代基的查爾酮，分別制得實(shí)施例2～14化合物。

實(shí)施例2

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.07(d,j＝5.4hz,1h),7.77(d,j＝7.1hz,2h),7.55(d,j＝8.4hz,2h),7.47–7.40(m,3h),7.23(dd,j＝17.5,6.9hz,2h),5.72(dd,j＝12.1,5.7hz,1h),3.87(dd,j＝18.0,12.3hz,1h),3.63(ddd,j＝46.4,29.5,10.3hz,8h),3.18(dd,j＝18.1,5.8hz,1h).

實(shí)施例3

4-(2-(3,5-雙(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.40(d,j＝5.6hz,1h),8.09–8.03(m,2h),7.56(d,j＝5.5hz,1h),7.40(dd,j＝16.4,7.6hz,4h),7.18(t,j＝8.8hz,2h),5.80(dd,j＝11.5,5.8hz,1h),4.16–3.43(m,10h).

實(shí)施例4

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.40(d,j＝5.5hz,1h),7.87(d,j＝8.1hz,2h),7.71(s,1h),7.61(d,j＝8.4hz,1h),7.55(d,j＝5.5hz,1h),7.33(dd,j＝15.3,8.2hz,3h),5.78(dd,j＝11.6,5.9hz,1h),4.06(dd,j＝18.2,12.0hz,1h),3.81(s,3h),3.65(s,2h),3.54(s,1h),3.44(dd,j＝18.5,6.1hz,3h),2.38(s,3h).

實(shí)施例5

4-(2-(3-(4-溴苯基)-5-(3,4-二氯苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.06(d,j＝5.5hz,1h),7.71(d,j＝8.6hz,2h),7.64(d,j＝8.2hz,2h),7.54(d,j＝8.0hz,2h),7.24(d,j＝5.4hz,1h),7.20(d,j＝8.2hz,1h),5.73(s,1h),3.86(s,1h),3.62(d,j＝12.3hz,4h),3.53(s,4h),3.17(d,j＝17.9hz,1h).

實(shí)施例6

4-(2-(3,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.04(d,j＝5.5hz,1h),7.77(d,j＝7.6hz,2h),7.48–7.37(m,3h),7.30–7.17(m,6h),5.71(dd,j＝12.0,5.3hz,1h),3.87(dd,j＝17.4,12.2hz,1h),3.63(dt,j＝19.1,10.7hz,6h),3.49(d,j＝13.7hz,2h),3.45–3.40(m,1h).

實(shí)施例7

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.09(d,j＝5.4hz,1h),7.87–7.80(m,2h),7.48(d,j＝8.2hz,2h),7.28(dd,j＝18.4,7.2hz,3h),7.20(d,j＝8.2hz,2h),5.71(dd,j＝12.1,5.6hz,1h),3.88(dd,j＝17.6,12.1hz,1h),3.74–3.49(m,9h).

實(shí)施例8

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.39(s,1h),7.92(d,j＝8.4hz,2h),7.72–7.51(m,3h),7.32(s,1h),7.10(d,j＝8.5hz,2h),5.76(s,1h),4.06(s,2h),3.83(s,8h),3.64(s,3h).

實(shí)施例9

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.04(d,j＝5.5hz,1h),7.79–7.58(m,2h),7.60–7.35(m,2h),7.35–7.07(m,5h),5.68(dd,j＝12.1,5.5hz,1h),4.63–3.41(m,10h),2.33(s,3h).

實(shí)施例10

4-(2-(3-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.17(d,j＝4.9hz,1h),7.79(d,j＝8.1hz,2h),7.35(d,j＝4.7hz,1h),7.29(d,j＝7.3hz,2h),7.24(d,j＝7.7hz,3h),7.03(d,j＝8.3hz,2h),5.69(d,j＝6.4hz,1h),3.98–3.87(m,2h),3.80(s,3h),3.68(s,4h),3.57(s,4h).

實(shí)施例11

4-(2-(5-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嗎啉

¹hnmr(400mhz,dmso)δ7.91–7.86(m,2h),7.50(t,j＝5.0hz,1h),7.39–7.24(m,4h),7.16(t,j＝8.8hz,1h),7.06(d,j＝8.6hz,2h),5.72(dd,j＝11.0,5.3hz,1h),4.07–3.96(m,1h),3.82(s,3h),3.74(s,4h),3.65–3.56(m,3h),3.48(s,2h).

實(shí)施例12

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.77(d,j＝7.3hz,2h),7.51–7.37(m,6h),7.21(dd,j＝17.0,6.8hz,3h),5.71(dd,j＝12.0,5.3hz,1h),3.86(dd,j＝17.5,12.3hz,1h),3.73–3.57(m,7h),3.53(t,j＝9.8hz,2h).

實(shí)施例13

2-巰基-3-((6-(1-(4-嗎啉代-6-(1,1,1-三氟-2-羥基丙-2-基)噻吩并[2,3-d])-3-(5-(丙-2-炔-1-基)吡啶-2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-5-基)吡啶-3-基)硫基)琥珀酸

esi-ms[m+h]+m/z:645.8

實(shí)施例14

6-(1-(4-((s)-3-甲基嗎啉代)-6-嗎啉代噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)-3--2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-5-基)煙腈

esi-ms[m+h]+m/z:664.88

步驟c4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

將查爾酮(0.001mol)、4-(2-肼噻吩并[2,3-d]嘧啶-4-基)嗎啉(0.001mol)溶于13ml乙醇中，逐滴滴加1ml10％naoh溶液，，加畢反應(yīng)15min，tlc檢測反應(yīng)完全后停止反應(yīng)。

向反應(yīng)液中加適量的水并用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph為6-7，析出固體，攪拌10min，抽濾，濾餅干燥。

實(shí)施例15

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

先按照步驟b成中間體a2，最后中間體a2通過步驟e與查爾酮化合物反應(yīng)，得到4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:528.43

按照實(shí)施例1的方法，先按照步驟b合成中間體a2，最后中間體a2通過步驟e與含不同取代基的查爾酮反應(yīng)，分別制得實(shí)施例15～28化合物。

實(shí)施例16

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:510.44

實(shí)施例17

4-(2-(3,5-雙(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:477.53

實(shí)施例18

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:524.46

實(shí)施例19

4-(2-(3-(4-溴苯基)-5-(3,4-二氯苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:589.33

實(shí)施例20

4-(2-(3,5-二苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:441.55

實(shí)施例21

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(4-氟苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:538.44

實(shí)施例22

4-(2-(5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:540.46

實(shí)施例23

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-(對甲苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:534.48

實(shí)施例24

4-(2-(3-(4-甲氧基苯基)-5-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:471.58

實(shí)施例25

4-(2-(5-(4-氟苯基)-3-(4-甲氧基苯基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:489.57

實(shí)施例26

4-(2-(5-(4-溴苯基)-3-苯基-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基)嗎啉

esi-ms[m+h]+m/z:520.45

實(shí)施例27

1,1,1-三氟甲基-2-(2-(3-(5-甲基吡啶-2-基)-5-(5-甲硫基吡啶-2-基)-4,5-二氫-1h-吡唑-1-基)-4-嗎啉噻吩并[3,2-d]嘧啶-6-基)噻喃-2-醇

esi-ms[m+h]+m/z:616.7

實(shí)施例28

6-(1-(4,6-二嗎啉基噻吩并[2,3-d]嘧啶-2-基)-3-(5-(((甲硫基)甲基)硫基)吡啶-2-基)(5-氯-2,3-二氫-1h-吡唑-5-基)煙腈

esi-ms[m+h]+m/z:645.8

體外細(xì)胞毒活性

對按照本發(fā)明上式i的含吡唑結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物衍生物進(jìn)行了體外抑制肺癌細(xì)胞a549、前列腺癌pc-3、肝癌細(xì)胞hepg2活性篩選，對照品gdc-0941按照文獻(xiàn)(j.med.chem.,2008,51(18),pp5522–5532)所述方法制備得到。

1)細(xì)胞復(fù)蘇并傳代2～3次穩(wěn)定后，用胰蛋白酶溶液(0.25％)使其從培養(yǎng)瓶底部消化下來。將細(xì)胞消化液倒入離心管中后，之后加入培養(yǎng)液以終止消化。將離心管在800r/min下離心10min，棄去上清液后加入5ml培養(yǎng)液，吹打混勻細(xì)胞，吸取10μl細(xì)胞混懸液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁴個/孔。96孔板中除a1孔為空白孔不加細(xì)胞外，其余皆加入100μl細(xì)胞混懸液。將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

2)用50μl二甲基亞砜溶解受試樣品，然后加入適量培養(yǎng)液，使樣品溶解成2mg/ml藥液，然后在24孔板中將樣品稀釋為20、4、0.8、0.16、0.032μg/ml。

每個濃度加入3孔，其中周圍兩行兩列細(xì)胞長勢受環(huán)境影響較大，只和為空白細(xì)胞孔使用。將96孔板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。

3)將96孔板中帶藥培養(yǎng)液棄去，用磷酸緩沖溶液(pbs)將細(xì)胞沖洗兩遍，在每孔中加入mtt(四氮唑)(0.5mg/ml)100μl放入培養(yǎng)箱中4h后，棄去mtt溶液，加入二甲基亞砜100μl。在磁力振蕩器上振蕩使存活細(xì)胞與mtt反應(yīng)產(chǎn)物充分溶解，放入酶標(biāo)儀中測定結(jié)果。通過bliss法可求出藥物ic50值。

化合物的肝癌細(xì)胞hepg2、肺癌細(xì)胞a549、前列腺癌pc-3活性結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。表1中ic50>＝80％，以“+++”表示，80％>ic50>＝60％，以“++”表示，60％>ic50>＝40％，以“+”表示，ic50<＝40％，以“-”表示，“na”表示無活性，“nd”表示未測試。

表2目標(biāo)化合物體外抗腫瘤活性

從上述試驗(yàn)結(jié)果可以清楚地看出，本發(fā)明所要保護(hù)的通式i的吡結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物，具有良好的體外抗腫瘤活性。

本發(fā)明中通式i含吡結(jié)構(gòu)的噻吩并嘧啶類化合物可單獨(dú)施用，但通常是和藥用載體混合物給予，所述藥用載體的選擇要根據(jù)所需用藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐，下面分別用該類化合物的各種藥物劑型，例如片劑、膠囊劑、注射劑、氣霧劑、栓劑、膜劑、滴丸劑、外用搽劑和軟膏劑的制備方法，說明其在制藥領(lǐng)域中的新應(yīng)用。

應(yīng)用例1：片劑

以實(shí)施例2化合物6g，按照藥劑學(xué)一般壓片法加輔料12g混勻后，壓制成100片，每片重180mg。

應(yīng)用例2：膠囊劑

以實(shí)施例8化合物15g，按照藥劑學(xué)膠囊劑的要求將輔料20g混勻后，裝入空心膠囊，每個膠囊重150mg。

應(yīng)用例3：注射劑

以實(shí)施例9化合物10g，按照藥劑學(xué)常規(guī)方法，進(jìn)行活性炭吸附，經(jīng)0.65μm微孔濾膜過濾后，填入氮?dú)夤拗瞥伤樦苿?，每只裝2ml，共灌裝100瓶。

應(yīng)用例4：氣霧劑

以實(shí)施例12化合物10g，用適量丙二醇溶解后，加入蒸餾水及其他輻料后，制成100ml的澄清溶液即得。

應(yīng)用例5：栓劑

以實(shí)施例15化合物5g，將之研細(xì)加入甘油適量，研勻后加入已熔化的甘油明膠，研磨均勻，傾入已涂潤滑劑的模型中，制得栓劑25顆

應(yīng)用例6：膜劑

以實(shí)施例17化合物5g，將聚乙烯醇、藥用甘油、水等攪拌膨脹后加熱溶解，80目篩網(wǎng)過濾，再將實(shí)施例12化合物加入到濾液中攪拌溶解，涂膜機(jī)制膜50片。

應(yīng)用例7：滴丸劑

以實(shí)施例18化合物15g，與明膠等基質(zhì)50g加熱熔化混勻后，滴入低溫液體石蠟中，共制得滴丸1000丸。

應(yīng)用例8：外用搽劑

以實(shí)施例20化合物25g，按照常規(guī)藥劑學(xué)方法與乳化劑等輔料10g混合研磨，再加蒸餾水至500ml制得。

應(yīng)用例9：軟膏劑

以實(shí)施例24化合物5g，研細(xì)后與凡士林等油性基質(zhì)250g研勻制得。

盡管已經(jīng)通過特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但修改和等價變化對于精通此領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯見的，且它們都包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。