本發(fā)明涉及兒童i型糖尿病診斷、預(yù)測預(yù)后領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及以檢測reps1異常為手段的兒童i型糖尿病診斷、預(yù)測預(yù)后方法。

背景技術(shù)：

i型糖尿病(t1dm)為在遺傳基礎(chǔ)上由環(huán)境因素激發(fā)的、自身免疫介導的以胰腺β細胞受損為特征的自身免疫性疾病，是一種由于胰島素缺乏或作用不足引起的能量代謝疾病。通常在兒童、少年、青年時期被診斷，發(fā)病風險最高的年齡段是10-14歲，青少年以后，發(fā)病率下降。兒童i型糖尿病以往多指小于15歲發(fā)生的糖尿病，由于who(世界衛(wèi)生組織)已經(jīng)兒童定義為0-18歲，因此兒童糖尿病應(yīng)指小于18歲發(fā)生的糖尿病。兒童1型糖尿病的臨床表現(xiàn)為多尿、多飲、多食及消瘦。兒童1型糖尿病比成人糖尿病重，起病較急，不易早期發(fā)現(xiàn)，胰島β細胞的功能可出現(xiàn)明顯下降甚至發(fā)展為衰竭，早期并發(fā)癥即可出現(xiàn)，如糖尿病酮癥甚至酸中毒，如處理不及時或不當，可能危及生命。i型糖尿病確切發(fā)病機制尚未完全闡明，目前認為是遺傳、免疫和環(huán)境因素共同作用所致。

高通量測序技術(shù)(high-throughputsequencing)是指能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性變革，隨著2005年羅氏的454測序儀及2006年solexa測序儀出現(xiàn)后飛速發(fā)展，2009年左右高通量測序技術(shù)在國內(nèi)興起。高通量測序類型分為多種，基因芯片、基因深度測序(genomere-sequencing)、轉(zhuǎn)錄組深度測序(transcriptomere-sequencing又稱rna-seq)等。

細胞的功能是從基因的表達開始的，轉(zhuǎn)錄組是指某一時間細胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄而來的rna總稱。通過高通量測序技術(shù)可獲得基因表達的rna水平有關(guān)信息，可以揭示基因表達與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。

高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，為兒童i型糖尿病發(fā)病機理的研究提供了更加全面和快速的分析手段，也為兒童i型糖尿病的進一步治療方案提供嶄新思路。深入研究兒童i型糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控機制，有助于了解兒童i型糖尿病的遺傳分子機制，為尋找新的藥物提供理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種通過檢測reps1基因或蛋白表達差異來診斷兒童i型糖尿病的方法。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種通過檢測reps1基因或蛋白表達差異來預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了檢測reps1基因或reps1蛋白的產(chǎn)品在制備兒童i型糖尿病診斷工具中的用途。

本發(fā)明還提供了檢測reps1基因或reps1蛋白的產(chǎn)品在制備預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后工具中的用途。

進一步，所述檢測reps1基因或reps1蛋白的產(chǎn)品包括檢測reps1基因或reps1蛋白的表達水平的產(chǎn)品。所述產(chǎn)品包括能夠結(jié)合reps1基因的核酸或者能夠結(jié)合reps1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的表達水平；所述物質(zhì)能夠檢測reps1蛋白的表達水平。

本發(fā)明的檢測reps1基因的產(chǎn)品可基于使用核酸分子的已知方法來發(fā)揮其功能：如pcr、如southern雜交、northern雜交、點雜交、熒光原位雜交(fish)、dna微陣列、aso法、高通量測序平臺等。使用該產(chǎn)品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。

包含在上述產(chǎn)品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有期望核酸的基因，然后使用設(shè)計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。

進一步，所述pcr方法為已知方法，例如，arms(amplificationrefractorymutationsystem，擴增不應(yīng)突變系統(tǒng))法、rt-pcr(逆轉(zhuǎn)錄酶-pcr)法、嵌套pcr法等等。擴增的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(spr法)、pcr-rflp法、原位rt-pcr法、pcr-sso(序列特異性寡核苷酸)法、pcr-ssp法、ampflp(可擴增片段長度多態(tài)性)法、mvr-pcr法、和pcr-sscp(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)法來檢測。

上面所述的核酸包括擴增reps1基因的引物，產(chǎn)品中包括的引物可以通過通過化學合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來適當?shù)卦O(shè)計，并通過化學合成來制備。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述核酸為qpcr實驗中使用的擴增引物，所述引物的序列如seqidno.1(正向序列)和seqidno.2(反向序列)所示。

上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法參考已知信息來恰當設(shè)計，并通過化學合成來制備，或者可以通過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設(shè)計用于擴增期望核酸序列的引物擴增它來制備。

本發(fā)明的檢測reps1蛋白的產(chǎn)品可基于使用抗體的已知方法來發(fā)揮其功能：例如，可以包括elisa、放射免疫測定法、免疫組織化學法、western印跡等。

本發(fā)明的檢測reps1蛋白的產(chǎn)品包括特異性結(jié)合reps1蛋白的抗體或其片段。可以使用任何結(jié)構(gòu)、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結(jié)合靶蛋白質(zhì)即可。本發(fā)明的檢測產(chǎn)品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保留抗體對抗原的結(jié)合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以包括f(ab′)2、fab′、fab、單鏈fv(scfv)、二硫化物鍵合的fv(dsfv)或其聚合物、二聚化v區(qū)(雙抗體)、或含有cdr的肽。本發(fā)明的檢測reps1蛋白的產(chǎn)品可以包括編碼抗體或編碼抗體片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。

抗體可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶蛋白質(zhì)的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免疫動物后，從經(jīng)過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交瘤培養(yǎng)物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的reps1蛋白或其部分對獲得的抗體實施抗原特異性純化來獲得針對reps1蛋白的單克隆抗體?？梢匀缦轮苽涠嗫寺】贵w：用與上文相同的抗原免疫動物，從經(jīng)過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使用上述抗原對血清實施抗原特異性純化?？梢酝ㄟ^用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的抗體的序列信息來獲得抗體片段。

標記物與抗體或其片段的結(jié)合可以通過本領(lǐng)域普遍知道的方法來實施。例如，可以如下熒光標記蛋白質(zhì)或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質(zhì)或肽，添加用dmso、緩沖劑、等準備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-nh2、生物素標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-nh2、堿性磷酸酶標記試劑盒-sh(dojindolaboratories)；過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標記試劑盒-nh2、過氧化物酶標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；藻膽蛋白標記試劑盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-nh2、藻膽蛋白標記試劑盒-sh、b-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2，b-藻紅蛋白標記試劑盒-sh、r-藻紅蛋白標記試劑盒-nh2、r-藻紅蛋白標記試劑盒sh(dojindolaboratories)；熒光標記試劑盒諸如熒光素標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)555標記試劑盒-nh2、hilytefluor(tm)647標記試劑盒-nh2(dojindolaboratories)；及dylight547和dylight647(technochemicalcorp.)、zenon(tm)、alexafluor(tm)抗體標記試劑盒、qdot(tm)抗體標記試劑盒(invitrogencorporation)和ez-標記物蛋白質(zhì)標記試劑盒(funakoshicorporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經(jīng)過標記的抗體或其片段。

預(yù)測預(yù)后是指預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果，并不意味著能以100％的準確度預(yù)測患者狀況的過程或結(jié)果。預(yù)測預(yù)后是指確定某些過程或結(jié)果的可能性是否增加，而并不意味著通過與某些過程或結(jié)果不發(fā)生的情況比較來確定發(fā)生某些過程或結(jié)果的可能性。如本發(fā)明而言，本發(fā)明中reps1基因或reps1蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患者相比，更有可能觀察到特定過程或結(jié)果。

進一步，所述檢測reps1基因或reps1蛋白的產(chǎn)品可以是檢測reps1基因或reps1蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測序平臺。

利用前面所述的檢測產(chǎn)品檢測兒童受試者樣本中的reps1基因或reps1蛋白的表達水平，與正常兒童相比，兒童受試者樣本中的reps1基因或reps1蛋白的表達水平降低，則診斷該兒童受試者為兒童i型糖尿病患者或該患有兒童i型糖尿病的兒童受試者的預(yù)后差。

作為依照本發(fā)明的檢測產(chǎn)品的樣本，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自兒童受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病的工具，所述工具能夠檢測兒童受試者樣本中reps1基因或reps1蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結(jié)合reps1基因的核酸或者能夠結(jié)合reps1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的表達水平；所述物質(zhì)能夠檢測reps1蛋白的表達水平。

進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進一步，所述診斷兒童i型糖尿病的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷兒童i型糖尿病的工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知reps1基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于reps1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明還提供了一種預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后的工具，所述工具能夠檢測兒童受試者樣本中reps1基因或reps1蛋白的表達水平，所述預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后工具包括能夠結(jié)合reps1基因的核酸或者能夠結(jié)合reps1蛋白的物質(zhì)(例如抗體)。所述核酸能夠檢測reps1基因的mrna水平；所述物質(zhì)能夠檢測reps1蛋白的表達水平。

進一步，所述核酸和所述物質(zhì)的性質(zhì)同前面所述。

進一步，所述預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測序中獲知reps1基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于reps1基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗reps1抗體或其片段所識別的氨基酸的數(shù)目沒有特別限制，只要抗體能夠結(jié)合reps1即可。當抗體作為治療藥物時，優(yōu)選的是它能夠識別盡可能多的氨基酸，只要它能抑制reps1功能?？贵w或其片段識別的氨基酸的數(shù)目是至少一個，更優(yōu)選至少三個。抗體的免疫球蛋白類別不受限制，可以是igg、igm、iga、ige、igd或igy。

本發(fā)明的檢測產(chǎn)品、診斷工具中使用的抗reps1抗體的其他性質(zhì)同前面所述。

進一步，所述受試者樣本可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品或流體。樣本不受特別限制，只要它適于本發(fā)明的測定；例如，它可以包括組織、血液、血漿、血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經(jīng)過處理的材料。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本來自受試者的血液。

本發(fā)明還提供了一種診斷兒童i型糖尿病或預(yù)測兒童i型糖尿病預(yù)后的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲取兒童受試者的樣品；

(2)檢測兒童受試者樣品中reps1基因或蛋白的表達水平；

(3)將測得的reps1基因或蛋白的表達水平與兒童受試者的患病與否關(guān)聯(lián)起來。

(4)與正常兒童相比，reps1基因或蛋白的表達水平降低，則該兒童受試者被診斷為兒童i型糖尿病，或判斷患有兒童i型糖尿病的兒童受試者預(yù)后差。

在本發(fā)明的上下文中，“診斷兒童i型糖尿病”既包括判斷兒童受試者是否已經(jīng)患有兒童i型糖尿病、也包括判斷兒童受試者是否存在患有兒童i型糖尿病的風險。

本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷兒童i型糖尿病以及預(yù)測兒童i型糖尿病患者預(yù)后的分子標志物，使用該分子標志物可以在兒童i型糖尿病發(fā)生的早期即可作為判斷，提高了患者的生存率。另外，通過預(yù)測患者的預(yù)后，本發(fā)明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方案策略。

附圖說明

圖1顯示利用qpcr檢測reps1基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達差異；

圖2顯示利用免疫印跡檢測reps1基因在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達差異。

具體的實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達的基因

1、臨床對象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標準)住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無統(tǒng)計學差異。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會備案并批準，入選患兒及健康對照兒童合法監(jiān)護人均簽署臨床研究同意書。

2、血液總rna提取

使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。

基本步驟：

(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；

(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；

(3)異丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、rna樣品的質(zhì)量分析

利用nanodrop2000對所提rna的濃度和純度進行檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna完整性，agilent2100測定rin值。單次建庫要求rna總量5μg，濃度≥200ng/μl，od260/280介于1.8～2.2之間。

3、高通量轉(zhuǎn)錄組測序

(1)rna-seq讀段定位

首先將低質(zhì)量的讀段去除得到清潔讀段，然后利用tophatv1.3.1將清潔片段與ucsch.sapiens參考基因組(hg19)進行匹配，h.sapiensucschg19版的預(yù)先構(gòu)建的索引從tophat主頁下載，并作為參考基因組，利用tophat與基因組匹配時，允許每個讀段(默認到20)有多個匹配位點，最多2次錯配。tophat根據(jù)外顯子區(qū)域和gt-ag剪切信號建立可能的剪切位點庫，根據(jù)這些剪切位點庫將沒有定位到基因組的讀段定位到基因組上。我們使用tophat方法的系統(tǒng)默認參數(shù)。

(2)轉(zhuǎn)錄豐度評估

匹配上的讀段文件通過cufflinksv1.0.3處理，cufflinksv1.0.3將rna-seq片段數(shù)目進行標準化計算轉(zhuǎn)錄本的相對豐度。fpkm值指的是每一百萬測序片段中匹配到特定基因1kb長的外顯子區(qū)域的片段數(shù)目。通過貝葉斯推理方法計算fpkm估計值的置信區(qū)間。cufflinks使用的參考的gtf注釋文件從ensembl數(shù)據(jù)庫下載(homo_sapiens.grch37.63.gtf)。

(3)差異表達基因的檢測

將下載的ensemblgtf文件和通過tophat匹配的原始文件傳輸?shù)絚uffdiff，cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算gtf文件中列出的轉(zhuǎn)錄本的表達豐度，檢測差異表達。在cuffidff輸出中只有q值＜0.01，測試顯示成功的比較才被認為是差異表達。

6、結(jié)果

rna-seq結(jié)果顯示，與正常兒童與兒童i型糖尿病患者血液中存在差異表達基因共443個，其中，在兒童i型糖尿病患者血液中表達上調(diào)的基因有251個，表達下調(diào)的基因是192個。

實施例2qpcr實驗驗證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達的基因

選擇實施例1篩選出的reps1基因進行大樣本驗證。

1、臨床對象：內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標準)住院患者10例，其中男5例，女5例，年齡5-16歲；正常對照組8例，其中男3例，女5例皆為健康體檢者，無糖尿病家族史，并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病，年齡5-16歲，與糖尿病患兒性別、年齡無統(tǒng)計學差異。本研究經(jīng)醫(yī)學倫理委員會備案并批準，入選患兒及健康對照兒童合法監(jiān)護人均簽署臨床研究同意書。

2、血液總rna提取

使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進行血液總rna的提取。

基本步驟：

(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻；

(2)加入氯仿幫助有機相和水相分層；

(3)異丙醇沉淀rna；

(4)漂洗rna沉淀；

(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。

3、逆轉(zhuǎn)錄

用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對lμg總rna進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系，每個樣品取1μg總rna作為模板rna，在pcr管中分別加入以下組分：depc水，5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暫離心。

4、qpcr

采用25μl反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復三次以上以保證結(jié)果的可靠性。

配制以下反應(yīng)體系：sybrgreen聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μl，正向引物(5μm/μl)1μl，反向引物(5μm/μl)1μl，模板cdna2.0μl，無酶水8.5μl。

引物序列如下：

擴增reps1基因的正向引物序列為5’-gcatcacaaccttctatt-3’(seqidno.1)，反向引物序列為5’-gcaattcgctattcaatc-3’(seqidno.2)；

擴增gapdh基因的正向引物序列為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

擴增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*45個循環(huán)。以sybr

green作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行pcr反應(yīng)，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，δδct法進行相對定量。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中reps1基因的mrna水平顯著下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

實施例3免疫印跡實驗驗證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達基因的表達產(chǎn)物

1、臨床對象：同實施例2。

2、單核細胞分離

兒童i型糖尿病患者和正常兒童取靜脈血10ml，注入盛肝素的無菌小瓶中，加蓋后立即輕輕搖勻。用無菌吸管加入等體積的hbss(nacl8.0g，na2hpo40.132g，kh2po40.06g，kcl0.4g，酚紅1ml，nahco30.35g，d-葡萄糖1.0g，溶于1000ml雙蒸水)，以降低紅細胞的凝聚。吸取8ml淋巴細胞分層液置50ml離心管中，將稀釋血液沿管壁緩慢加入，保持界面清楚，勿使兩者相混，在20℃2000r/min離心30min，小心吸取分層液與血漿交接部位混濁的灰白色層，即淋巴細胞層，加入另一支離心管中，用5倍體積的hbss洗滌2次，依次以2000r/min、1500r/min在室溫下離心10min，以便去除大部分混雜的血小板，用10ml雙蒸水與細胞團塊混合1min，使殘余紅細胞裂解，然后迅速加入等量1.8％nacl溶液，2000r/min離心，去上清，經(jīng)細胞計數(shù)后用hbss溶液調(diào)整細胞至1×10⁶個/ml備用。

3、單核細胞總蛋白質(zhì)提取

將上述實驗所得細胞懸液(濃度為1×10⁶個/ml)室溫1000r/min離心10min，棄上清后加入100μl裂解緩沖液，4℃震蕩1h，用超聲波儀破碎細胞，每次10s，共10次，于4℃12000r/min離心1h；取上清用brandford法定量蛋白，分裝成2.5μg/μl，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4、westernblot檢測

細胞總蛋白用brandford法定量，取適量與樣品緩沖液混合煮沸5min，冷卻5min；取30pg蛋白上樣到制備好的15％聚丙烯酰胺凝膠，進行電泳，開始設(shè)為80v恒壓，看見marker后增加至120v；將電泳后的膠取出，使用bio.rad半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)于100v轉(zhuǎn)移50min；轉(zhuǎn)膜完畢后，用1xpbs洗一次，浸入封閉液，40c過夜；倒掉封閉液，加入western洗滌液洗滌5-10min，加入一抗搖床室溫雜交2h；按照適當比例用western二抗稀釋液稀釋于封閉緩沖液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ecl試劑顯影、定影檢測蛋白表達。

5、統(tǒng)計學處理

將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條帶的灰度值進行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當p<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2所示，與正常兒童相比，兒童i型糖尿病患者血液中reps1蛋白含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。

sequencelisting

<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>reps1在制備兒童i型糖尿病診斷產(chǎn)品中的用途

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<400>1

gcatcacaaccttctatt18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gcaattcgctattcaatc18

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tttaactctggtaaagtggatat23

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ggtggaatcatattggaaca20