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CYB5R1作為兒童I型糖尿病的診斷標(biāo)志物的制作方法

文檔序號(hào):11246467閱讀:459來(lái)源:國(guó)知局
本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域,涉及一種兒童i型糖尿病的診斷工具,還涉及血液中cyb5r1基因在制備兒童i型糖尿病診斷工具中的應(yīng)用。
背景技術(shù)
:i型糖尿病(t1dm)為在遺傳基礎(chǔ)上由環(huán)境因素激發(fā)的、自身免疫介導(dǎo)的以胰腺β細(xì)胞受損為特征的自身免疫性疾病,是一種由于胰島素缺乏或作用不足引起的能量代謝疾病。通常在兒童、少年、青年時(shí)期被診斷,發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)最高的年齡段是10-14歲,青少年以后,發(fā)病率下降。兒童i型糖尿病以往多指小于15歲發(fā)生的糖尿病,由于who(世界衛(wèi)生組織)已經(jīng)兒童定義為0-18歲,因此兒童糖尿病應(yīng)指小于18歲發(fā)生的糖尿病。兒童1型糖尿病的臨床表現(xiàn)為多尿、多飲、多食及消瘦。兒童1型糖尿病比成人糖尿病重,起病較急,不易早期發(fā)現(xiàn),胰島β細(xì)胞的功能可出現(xiàn)明顯下降甚至發(fā)展為衰竭,早期并發(fā)癥即可出現(xiàn),如糖尿病酮癥甚至酸中毒,如處理不及時(shí)或不當(dāng),可能危及生命。i型糖尿病確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,目前認(rèn)為是遺傳、免疫和環(huán)境因素共同作用所致。高通量測(cè)序技術(shù)(high-throughputsequencing)是指能夠一次并行對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條dna分子進(jìn)行序列測(cè)定,每一次序列測(cè)定的讀長(zhǎng)一般較短的測(cè)序技術(shù)。高通量測(cè)序技術(shù)是對(duì)傳統(tǒng)測(cè)序一次革命性變革,隨著2005年羅氏的454測(cè)序儀及2006年solexa測(cè)序儀出現(xiàn)后飛速發(fā)展,2009年左右高通量測(cè)序技術(shù)在國(guó)內(nèi)興起。高通量測(cè)序類(lèi)型分為多種,基因芯片、基因深度測(cè)序(genomere-sequencing)、轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序(transcriptomere-sequencing又稱(chēng)rna-seq)等。細(xì)胞的功能是從基因的表達(dá)開(kāi)始的,轉(zhuǎn)錄組是指某一時(shí)間細(xì)胞內(nèi)所有基因轉(zhuǎn)錄而來(lái)的rna總稱(chēng)。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)可獲得基因表達(dá)的rna水平有關(guān)信息,可以揭示基因表達(dá)與一些生命現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系。高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用,為兒童i型糖尿病發(fā)病機(jī)理的研究提供了更加全面和快速的分析手段,也為兒童i型糖尿病的進(jìn)一步治療方案提供嶄新思路。深入研究?jī)和痠型糖尿病相關(guān)基因的調(diào)控機(jī)制,有助于了解兒童i型糖尿病的遺傳分子機(jī)制,為尋找新的藥物提供理論依據(jù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明利用芯片篩選并使用實(shí)時(shí)熒光定量pcr驗(yàn)證獲知cyb5r1基因在兒童i型糖尿病血液中差異表達(dá)。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)cyb5r1基因在兒童i型糖尿病中的作用,可用于開(kāi)發(fā)通過(guò)檢測(cè)cyb5r1基因來(lái)診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種診斷兒童i型糖尿病的工具,所述產(chǎn)品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中,所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針,所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)cyb5r1基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì)cyb5r1基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的cyb5r1蛋白的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測(cè)包括cyb5r1基因在內(nèi)的多個(gè)基因(例如,與兒童i型糖尿病相關(guān)的多個(gè)基因)的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括cyb5r1蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋白質(zhì)(例如與兒童i型糖尿病相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì))的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與兒童i型糖尿病的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè),可大大提高兒童i型糖尿病診斷的準(zhǔn)確率。其中,所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試劑盒包括用于檢測(cè)cyb5r1基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括cyb5r1蛋白的特異性抗體。進(jìn)一步,所述試劑包括使用rt-pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片方法檢測(cè)cyb5r1基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選的,所述試劑包括針對(duì)cyb5r1基因的引物和/或探針。根據(jù)cyb5r1基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)cyb5r1基因表達(dá)水平的引物和探針。所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)cyb5r1基因表達(dá)水平的試劑。所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸,所述寡核苷酸能夠檢測(cè)cyb5r1基因的轉(zhuǎn)錄水平。與cyb5r1基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制,只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合,任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣,所述探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng),甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響,所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì),最長(zhǎng)一般不超過(guò)30個(gè)堿基對(duì),與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì),以免影響雜交效率。進(jìn)一步,所述cyb5r1蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述cyb5r1蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如,嵌合抗體、scfv、fab、f(ab’)2、fv等。只要所述片段能夠保留與cyb5r1蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的,并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,所述針對(duì)cyb5r1基因的引物序列如下:正向引物序列如seqidno.1所示,反向引物如seqidno.2所示。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面,本發(fā)明還提供了檢測(cè)cyb5r1基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷兒童i型糖尿病的工具中的應(yīng)用。進(jìn)一步,上面所提到的檢測(cè)產(chǎn)品包括:通過(guò)rt-pcr、實(shí)時(shí)熒光定量pcr、免疫檢測(cè)、原位雜交、芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)cyb5r1基因的表達(dá)水平以診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品。進(jìn)一步,所述用rt-pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增cyb5r1基因的引物;所述用實(shí)時(shí)熒光定量pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增cyb5r1基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括:與cyb5r1蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括:與cyb5r1基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括與cyb5r1蛋白特異性結(jié)合的抗體,基因芯片包括與cyb5r1基因的核酸序列雜交的探針。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,所述用實(shí)時(shí)熒光定量pcr診斷兒童i型糖尿病的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增cyb5r1基因的引物的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。優(yōu)選地,所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測(cè)序平臺(tái)。其中,高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷工具,檢測(cè)cyb5r1基因表達(dá)的產(chǎn)品可以應(yīng)用于該平臺(tái)實(shí)現(xiàn)對(duì)cyb5r1基因的表達(dá)情況的檢測(cè)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,對(duì)一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜,容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此,在高通量測(cè)序中獲知cyb5r1基因的異常與兒童i型糖尿病相關(guān)也屬于cyb5r1基因的用途,同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明中cyb5r1基因和cyb5r1蛋白來(lái)源包括但不限于血液、組織液、尿液、唾液、脊髓液等可以獲得基因組dna及其或者蛋白的體液。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中,用于診斷兒童i型糖尿病的cyb5r1基因及蛋白的來(lái)源是血液。在發(fā)明的具體實(shí)施方案中,血液是取自?xún)和痠型糖尿病患者和正常兒童的血液。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了可用于診斷兒童i型糖尿病的血液分子標(biāo)志物,由于分子標(biāo)志物的變化早于臨床癥狀,通過(guò)檢測(cè)分子標(biāo)志物的變化可在疾病隱匿期或者疾病早期即可診斷出疾病是否發(fā)生或者判斷疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)概率,以便受試者能夠得到及時(shí)的治療和預(yù)防。附圖說(shuō)明圖1顯示利用免疫印跡檢測(cè)cyb5r1蛋白在兒童i型糖尿病患者和正常兒童中的表達(dá)差異。具體的實(shí)施方式cyb5r1基因本發(fā)明的“cyb5r1基因”(nc_000009.12(36336398..36487384)的具體序列可在國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)genebank中查詢(xún)到。本發(fā)明的“cyb5r1基因”包括上述cyb5r1基因及其功能等同物,所述功能等同物是指與cyb5r1基因序列存在差異但是能夠編碼具有相同功能的蛋白質(zhì)的序列。cyb5r1蛋白本發(fā)明的“cyb5r1蛋白”的具體序列可在ncbi中查詢(xún)到。本發(fā)明的“cyb5r1蛋白”包括上述cyb5r1蛋白以及cyb5r1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括cyb5r1蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段,或其活性衍生物,等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與cyb5r1的dna雜交的dna所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的“cyb5r1蛋白”還包括上述cyb5r1蛋白以及cyb5r1蛋白的任何功能等同物的修飾蛋白。通常,已知的是,一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、缺失、插入、替換是保守修飾,其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是cyb5r1蛋白的融合蛋白。對(duì)于與cyb5r1蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制,只要所得的融合蛋白保留cyb5r1蛋白的生物學(xué)活性即可。本發(fā)明的cyb5r1蛋白也包括蛋白氨基酸序列的非保守修飾,只要經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留cyb5r1蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少,例如6個(gè)或者更少,例如3個(gè)或者更少。診斷本發(fā)明的“診斷”包括疾病狀態(tài)的判斷,疾病風(fēng)險(xiǎn)的判斷、疾病預(yù)后判斷。下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法,通常按照常規(guī)條件,例如sambrook等人,分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1篩選兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因1、臨床對(duì)象:內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者10例,其中男5例,女5例,年齡5-16歲;正常對(duì)照組8例,其中男3例,女5例皆為健康體檢者,無(wú)糖尿病家族史,并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病,年齡5-16歲,與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn),入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。2、樣本采集與樣本rna提取兒童i型糖尿病和正常兒童在清晨空腹抽取靜脈血,使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進(jìn)行血液總rna的提取?;静襟E:(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻;(2)加入氯仿幫助有機(jī)相和水相分層;(3)異丙醇沉淀rna;(4)漂洗rna沉淀;(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、rna濃度的檢測(cè)用雙蒸水將核酸蛋白定量檢測(cè)儀的rna檢測(cè)孔洗滌3遍,晾干,取1‰depc液作陰性對(duì)照,檢測(cè)本底。取rna溶液2μl,用98μl1‰depc液稀釋50倍,記錄相關(guān)的od260、od280值。rna濃度=od260×40μg/ml×稀釋倍數(shù)。4、rna純度=od260/od280,rna純度應(yīng)在1.8~2.0之間。當(dāng)rna純度符合要求時(shí)才可繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。5、rna的完整性檢測(cè)取rna樣品3μl,depc水補(bǔ)充至15μl,65℃變性10min,然后置于冰上,加入2μl10×rnaloadingbuffer,將甲醛變性瓊脂糖凝膠放入裝有mops緩沖液的電泳槽中,100v電泳約5min,將rna樣品點(diǎn)入點(diǎn)樣孔中,100v電泳,指示劑擴(kuò)散至凝膠的1/3處時(shí)拍照。凝膠掃描成像系統(tǒng)觀察見(jiàn)28s、18s條帶完整清晰,無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象??捎糜谶M(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。6、組織rna的高密度人類(lèi)基因表達(dá)譜芯片分析依托博奧生物公司提供的基因芯片分析平臺(tái)的技術(shù)服務(wù),選擇affx人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片(affxhumangenomeu133plus2.0array,affimetrix公司),完成了血液樣本rna的基因芯片篩查分析,其工作原理及全部操作流程參照該公司常規(guī)的基因芯片分析方法,主要細(xì)節(jié)如下:(1)取以上人類(lèi)基因組表達(dá)譜芯片共18張,分別與18例血液rna進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn),并重復(fù)三次;(2)利用luxscan10ka雙通道激光掃描儀,對(duì)雜交后的基因芯片進(jìn)行掃描分析;(3)利用sam軟件,并以正常兒童為對(duì)照,對(duì)兒童i型糖尿病患者的芯片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與統(tǒng)計(jì)分析,其稱(chēng)為聚類(lèi)分析(geneclusteranalysis);(4)以?xún)杀懂惓=^對(duì)值差異作為量化比較的界限,獲得兒童i型糖尿病患者或正常兒童之間差異表達(dá)候選基因。通過(guò)以上雜交、掃描和數(shù)據(jù)分析,發(fā)現(xiàn)兒童i型糖尿病患者與正常兒童比較,有(2倍及以上)差異表達(dá)基因480種,其上調(diào)表達(dá)基因有321種,下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?59種。實(shí)施例2實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)的基因1、臨床對(duì)象:內(nèi)分泌科初次就診的兒童i型糖尿病(按who1999年糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn))住院患者120例,其中男64例,女59例,年齡5-16歲(9.99士3.28)歲;正常對(duì)照組78例,其中男38例,女40例皆為健康體檢者,無(wú)糖尿病家族史,并排除內(nèi)分泌疾患及其他慢性疾病,年齡5-16(10.51士3.25)歲,與糖尿病患兒性別、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)備案并批準(zhǔn),入選患兒及健康對(duì)照兒童合法監(jiān)護(hù)人均簽署臨床研究同意書(shū)。2、血液總rna提取使用博凌科為tripurelsreagent血液(血液樣本)rna抽提試劑進(jìn)行血液總rna的提取?;静襟E:(1)按照3:1的體積比例加入tripurelsreagent和血液振蕩混勻;(2)加入氯仿幫助有機(jī)相和水相分層;(3)異丙醇沉淀rna;(4)漂洗rna沉淀;(5)rnase-freeh2o重新溶解rna沉淀。3、逆轉(zhuǎn)錄用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)lμg總rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna。采用25μl反應(yīng)體系,每個(gè)樣品取1μg總rna作為模板rna,在pcr管中分別加入以下組分:depc水,5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液,10mmol/ldntp,0.1mmol/ldtt,30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv,模板rna。42℃孵育1h,72℃10min,短暫離心。4、實(shí)時(shí)熒光定量pcr熒光定量pcr是在常規(guī)pcr基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的定量,隨著pcr反應(yīng)的進(jìn)行,pcr反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán),都會(huì)收集到一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào),這樣就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化來(lái)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。結(jié)果顯示,擴(kuò)增曲線ct值均小于32,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可用,本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。(1)熒光定量pcr反應(yīng)體系以上一步合成的互補(bǔ)dna(cdna)為模板進(jìn)行熒光定量pcr反應(yīng),反應(yīng)體系為20μ1(表1)。表1反應(yīng)體系組分體積(μl)sybrpremixextaqll(2x)10pcr上游引物(10μm)2pcr下游引物(10μm)2dna模板2rnasefreedh2o20引物序列:cyb5r1基因的正向引物序列為5’-ctgaaagtccctgaagat-3’(seqidno.1),反向引物序列為5’-ctgaaagtccctgaagat-3’(seqidno.2);擴(kuò)增gapdh基因的正向引物序列為5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3),反向引物序列為5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。(2)反應(yīng)條件啟動(dòng)lightcyder1.5實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀,預(yù)熱后將pcr反應(yīng)毛細(xì)管放入pcr儀中,反應(yīng)條件如表2所示。65℃至95℃繪制融解曲線。表2實(shí)時(shí)熒光定量pcr反應(yīng)條件5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)時(shí)熒光定量的結(jié)果采用美國(guó)abi公司sds2.4軟件進(jìn)行分析,具體采用comparativedelta-deltact法,該方法的優(yōu)點(diǎn)是只需對(duì)待測(cè)樣品分別進(jìn)行pcr即可,無(wú)需分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用spss19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)值變量以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量中兒童i型糖尿病患者樣本與正常兒童樣本的結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。6、結(jié)果采用2-△△ct相對(duì)定量法,以正常兒童組的mrna相對(duì)表達(dá)水平為1,兒童i型糖尿病組cyb5r1基因mrna水平為0.13±0.03,顯著下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。實(shí)施例3免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兒童i型糖尿病患者和正常兒童中差異表達(dá)基因的表達(dá)產(chǎn)物1、臨床對(duì)象:同實(shí)施例2。2、單核細(xì)胞蛋白分離兒童i型糖尿病患者和正常兒童取靜脈血10ml,注入盛肝素的無(wú)菌小瓶中,加蓋后立即輕輕搖勻。肝素化的血液用pbs按1∶1比例稀釋。將兩倍體積的稀釋后血液置于一倍體積的密度為1.080的ficoll-hypaque之上(boyum,seand.j.clin.lab.invest.97:1-109,1968),于20℃以1000g離心30分鐘。取出外周血單核細(xì)胞層,用5倍體積的pbs洗一次。將分離后的外周血單核細(xì)胞重懸于5ml的紅細(xì)胞裂解緩沖液中(155mmnh4cl,10mmnahco3,ph7.4,0.1mmedta),冰浴中放置5分鐘,用pbs洗兩遍。分離后的外周血單核細(xì)胞重懸于0.1或0.2ml(大約10倍于細(xì)胞體積)的緩沖液(20mmhepes,ph7.5,5mmmgcl2,120mmkci,10%甘油,1mm二硫蘇糖醇)中,該緩沖液還包含0.5%nonidetp-40,繼續(xù)冰浴10分鐘裂解細(xì)胞。在25℃以8000g離心6分鐘,獲得上清物質(zhì)-胞漿提取物。取上清用brandford法定量蛋白,分裝成2.5μg/μl,-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?、westernblot檢測(cè)(1)根據(jù)測(cè)定的蛋白濃度,按試驗(yàn)所需確定最小上樣蛋白量,加入上樣蛋白質(zhì)量體積比5倍的蛋白上樣緩沖液,用雙蒸水補(bǔ)充上樣總體積至15μl,然后將上樣漩渦振蕩,5000g離心5min,95℃恒溫金屬浴變性5-10min,得離心變性樣品,備用;(2)將(1)制備好的樣品進(jìn)行sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳,待溴酚藍(lán)跑至玻璃板底部前,停止電泳;(3)將(2)完成電泳后的另一塊凝膠用于做轉(zhuǎn)膜,按濾紙-膠-nc膜-濾紙從下至上的順序疊放,置于裝有轉(zhuǎn)膜緩沖液的槽中,冰上,100伏恒壓轉(zhuǎn)移1h-2h;(4)將(3)轉(zhuǎn)膜結(jié)束的nc膜用tbst洗3次,每次5min,然后用5%脫脂奶粉封閉液封閉90min,將封閉好的nc膜放入用tbst稀釋好的一抗中,室溫?fù)u床上孵育1h-2h,然后4℃保存,備用;(5)取(4)制備的膜,室溫孵育1h后用tbst洗膜3次,每次10min,然后將膜放入用tbst稀釋好的二抗中,室溫孵育90min,用tbst洗膜3次,每次10min,采用ecl化學(xué)曝光法,將洗脫后的nc膜用圖像掃描儀掃描,即得wb圖譜。蛋白上樣緩沖液由下列原料配置而成:32%0.5mol/ltris.hclph6.8,7.8%二硫蘇糖醇,10%sds,0.2%溴酚藍(lán),50%甘油,混勻后分裝,-20℃保存,使用前解凍。sds-聚丙烯酰胺凝膠由8%分離膠和4%濃縮膠組成;8%分離膠配置成分如下:2.7ml30%acr/bic(acr/bic比例為29.2:0.8),2.5ml1.5mol/ltris.hclph8.8,0.1ml10%sds,0.1ml10%過(guò)硫酸銨,0.006mltemed,4.6mlddh2o,總體積10ml;4%濃縮膠配置成分如下:0.067ml30%acr/bic(acr/bic比例為29.2:0.8),1.25ml0.5mol/ltris.hclph6.8,0.05ml10%sds,0.05ml10%過(guò)硫酸銨,0.005mltemed,3.581mlddh2o,總體積5ml。轉(zhuǎn)膜緩沖液由下列原料的百分比配置而成:0.29%甘氨酸,0.58%tris堿,0.037%sds,甲醇20%,蒸餾水79%,溶解后室溫保存。tbst由下列原料的百分比配置而成:0.1%tween-20,99.9%tbs,混勻后使用,現(xiàn)配現(xiàn)用,tbs配置方法:由3gtris-baseph7.5,8gnacl,0.2gkcl,ddh2o800ml,濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值到7.4,定容至1000ml,4℃貯存?zhèn)溆谩?、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將蛋白條帶的灰度值使用imagej軟件進(jìn)行分析,以β-actin為內(nèi)參,將目的白條帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示,采用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的,兩者之間的差異采用t檢驗(yàn),認(rèn)為當(dāng)p<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。6、結(jié)果結(jié)果如圖1所示,與正常兒童相比,兒童i型糖尿病患者血液中cyb5r1蛋白含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出,對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾,這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。sequencelisting<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司<120>cyb5r1作為兒童i型糖尿病的診斷標(biāo)志物<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<400>1ctgaaagtccctgaagat18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2ctgaaagtccctgaagat18<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3tttaactctggtaaagtggatat23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4ggtggaatcatattggaaca20當(dāng)前第1頁(yè)12
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