本發(fā)明涉及游離dna保存領(lǐng)域，具體的涉及一種游離dna保存液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞凋亡或壞死后，細(xì)胞內(nèi)部的dna釋放入體液形成游離dna(cfdna)。而癌癥患者的cfdna中含有的腫瘤循環(huán)dna(ctdna)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程緊密相關(guān)。游離dna與腫瘤組織的基因突變一致，遺傳信息豐富；與腫瘤負(fù)荷正相關(guān)，檢測靈敏度高；對疾病的發(fā)展最早做出反應(yīng)；半衰期短(<1.5h)，可實現(xiàn)實時監(jiān)測。因此，游離dna作為重要的腫瘤特異性標(biāo)志物，完整獲取和保存則對癌癥早篩、階段用藥指導(dǎo)及預(yù)后等方面應(yīng)用提供前提與基礎(chǔ)?，F(xiàn)有技術(shù)中，游離dna保存常采用血液樣本，必需經(jīng)專業(yè)醫(yī)師操作、過程繁復(fù)、且耗費時間；樣本成分復(fù)雜而保存提取難度較大；游離dna片段分布范圍在35～1500bp，而腫瘤游離dna片段多集中在100～300bp，片段小易丟失而失去遺傳信息的完整性；游離細(xì)胞不穩(wěn)定破碎后釋放的細(xì)胞內(nèi)dna造成游離dna的污染，導(dǎo)致檢測結(jié)果失真；樣本中dnase豐富使得游離dna降解快速而難于保存；游離dna保存通常需要低溫條件的冷鏈運輸，成本較高。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在解決上面描述的問題。本發(fā)明的目的是提供一種游離dna保存液，主要應(yīng)用于人體尿液、組織液游離dna的保存。相對于傳統(tǒng)的抽血采集的方式來說，尿液樣本的采集過程完全無創(chuàng)、操作簡便、成本低、易接受，能最大限度的擴大基因疾病篩查或診斷的取樣范圍。組織液主要指的是腹水及胸水，兩者樣本通過微創(chuàng)手術(shù)即可獲得，游離dna較血漿豐富度更高、含量更多，且可連續(xù)收集、動態(tài)監(jiān)測腫瘤隨時間的遺傳學(xué)變異過程，并最終用于臨床治療和診斷。同時本發(fā)明的保存液，dna片段保存完整度高，可室溫實現(xiàn)中長期保存；可最大程度避免樣本稀釋，最終降低樣本采集、保存、運輸成本。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種游離dna保存液，包括以下組分，以100ml計，所述各組分的含量為：其中，包括以下組分，以100ml計，所述各組分的含量為：其中，包括以下組分，以100ml計，所述各組分的含量為：其中，包括以下組分，以100ml計，所述各組分的含量為：其中，所述游離dna保存液的ph值范圍為5.5～7.0。其中，所述ph穩(wěn)定劑可以是tris-hcl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。其中，所述游離dna保存液與保存樣品的比例為1:20～1:10。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供一種游離dna保存液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將預(yù)定含量的乙二胺四乙酸二鈉、ph穩(wěn)定劑、咪唑烷基脲、甘氨酸置于燒杯中，60～65℃水浴25～35min；溶解后，添加預(yù)定含量的tritonx-100，最后添加去離子水定容至100ml，混合均勻；0.25μm濾膜抽濾，即得游離dna保存液。其中，包括以下步驟：將預(yù)定含量的乙二胺四乙酸二鈉、ph穩(wěn)定劑、咪唑烷基脲、甘氨酸置于燒杯中，65℃水浴30min；溶解后，添加預(yù)定含量的tritonx-100，最后添加去離子水定容至100ml，混合均勻；0.25μm濾膜抽濾，即得游離dna保存液。根據(jù)本發(fā)明的第三個方面，提供游離dna保存液在保存尿液、組織液游離dna上的應(yīng)用。人體尿液、組織液樣本中的游離dna極不穩(wěn)定，游離細(xì)胞破碎后細(xì)胞內(nèi)成分的污染、細(xì)菌污染、dnase的催化降解、ph變化均會影響樣本中游離dna的穩(wěn)定；樣本中酮體、蛋白等成分也會對游離dna造成干擾。本發(fā)明的游離dna保存液中的咪唑烷基脲作為甲醛緩釋劑可以穩(wěn)定細(xì)胞膜，避免樣本細(xì)胞內(nèi)dna釋放到細(xì)胞外，污染游離dna；同時咪唑烷基脲作為廣譜抑菌劑可以高效抑制細(xì)菌繁殖；是穩(wěn)定樣本游離dna的主要作用試劑。咪唑烷基脲緩釋的甲醛作為交聯(lián)劑/固定劑，一方面可以穩(wěn)定樣本的細(xì)胞、蛋白、dna，但是如果過量有可能引起dna質(zhì)量降低。甘氨酸可以在常溫下與咪唑烷基脲緩釋出的過剩甲醛結(jié)合，生成羥甲基衍生物。研究過程中發(fā)現(xiàn)，對于成分簡單的尿液、腹水、胸水樣本，例如健康人的尿液樣本，添加0～2.7g的甘氨酸可以與組分含量為8～32g的咪唑烷基脲緩釋的過剩甲醛結(jié)合，使得樣本中的游離dna可以很好地保存。然而對于成分復(fù)雜的樣本，例如孕婦、病患，在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，僅需低濃度甘氨酸輔助穩(wěn)定ph或不需要添加。dnase作為降解樣本游離dna的重要因素，主要有dnasei、ii、iii三種。其中，dnasei存在于細(xì)胞外，最佳ph為7.1，依賴金屬離子催化作用；dnaseii存在于溶酶體中，通過內(nèi)吞作用降解dna，降解dna不依賴金屬離子，最適ph值為4.5～5.5；dnaseiii定位于細(xì)胞核中，其催化dna降解不依賴金屬離子，最適ph值為8.5。在本發(fā)明的游離dna保存液中添加0.005～0.036mol的乙二胺四乙酸二鈉作為金屬離子螯合劑可以絡(luò)合金屬離子從而抑制dnasei作用。本發(fā)明的游離dna保存液中的ph穩(wěn)定劑的含量在0～0.005mol；可以使保存樣本的ph穩(wěn)定在5.5～7.0，可以抑制dnaseii、dnaseiii降解dna的活性，同時穩(wěn)定樣本在正常ph范圍內(nèi)，保證樣本中各成分的穩(wěn)定。ph穩(wěn)定劑可以是tris-hcl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液等緩沖試劑。同時，甘氨酸也可以作為ph緩沖物質(zhì)與ph穩(wěn)定劑共同作用，維持樣本ph與各成分的穩(wěn)定。本發(fā)明中的乙二胺四乙酸二鈉與ph穩(wěn)定劑的含量均指的是干物質(zhì)含量。在保存液配制過程中，使用的是乙二胺四乙酸二鈉溶液或tris-hcl緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。本發(fā)明中所包含的去離子水的含量為乙二胺四乙酸二鈉溶液和緩沖液的去離子水的含量以及最后定容所加入的去離子水的總和。本發(fā)明的游離dna保存液還添加了50～100μl含量范圍的tritonx-100，該含量范圍的tritonx-100可以破壞dnasei表面的親水層，降低dna酶的活性，從而在室溫穩(wěn)定樣本游離dna。由于保存液中的各組分在樣本中尤其在復(fù)雜樣本中會產(chǎn)生一系列復(fù)雜反應(yīng)，各組分協(xié)同作用的結(jié)果往往不能預(yù)知。所以本發(fā)明中咪唑烷基脲、乙二胺四乙酸二鈉、ph穩(wěn)定劑、tritonx-100、甘氨酸的比例范圍是經(jīng)過大量試驗而獲得的；并且針對復(fù)雜的樣本得到了各組分的優(yōu)選比例范圍。從而使得本發(fā)明的保存液可以中長期保存樣本中的游離dna，適用樣本范圍廣且保存效果穩(wěn)定；并且可以保證游離dna的完整度，避免游離dna被細(xì)胞內(nèi)dna污染而干擾檢測結(jié)果。將預(yù)定含量的乙二胺四乙酸二鈉、ph穩(wěn)定劑、咪唑烷基脲、甘氨酸置于燒杯中，60～65℃水浴25～35min；優(yōu)選的，65℃水浴30min；溶解后，添加預(yù)定含量的tritonx-100，最后添加去離子水定容至100ml，混合均勻；0.25μm濾膜抽濾，即得游離dna保存液。本游離dna保存液與保存樣品的比例為1:20～1:10。在該比例范圍內(nèi)，樣本中的游離dna的具有很好的保存效果。本游離dna保存液的應(yīng)用到人體尿液、腹水、胸水游離dna的保存，可以制成保存試劑盒，包括：存放有該游離dna保存液的保存管、生物安全袋、說明書、個人信息卡、編號條形碼、回寄快遞單，組裝成游離dna保存試劑盒；樣本保存管為優(yōu)質(zhì)無菌、無dnase、無rnase和熱源的15ml/50ml塑料尖底離心管，內(nèi)含約0.1倍樣本體積的保存液；采集保存樣本直接轉(zhuǎn)移到保存管中，密閉混勻即可室溫保存，快遞單直接到付室溫轉(zhuǎn)運，客戶編號條形碼方便后期樣本數(shù)據(jù)分析處理。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在：1、本發(fā)明可高效抑制人體尿液、組織液樣本中的dnase避免游離dna被降解。2、本發(fā)明保存液室溫條件下可穩(wěn)定保存尿液、組織液游離dna至少2周。3、本發(fā)明可穩(wěn)定尿液樣本中的細(xì)胞，保證細(xì)胞膜的完整性，避免游離dna被細(xì)胞內(nèi)dna污染而干擾檢測結(jié)果，且蛋白尿、血尿等病理尿液樣本的游離dna亦可完整保存。4、本發(fā)明制備方法簡單，不含有毒試劑，無需特殊處理。5、成本低、適合工業(yè)化生產(chǎn)。參照附圖來閱讀對于實施例的以下描述，本發(fā)明的其他特性特征和優(yōu)點將變得清晰。附圖說明并入到說明書中并且構(gòu)成說明書的一部分的附圖示出了本發(fā)明的實施例，并且與描述一起用于解釋本發(fā)明的原理，在這些附圖中，類似的附圖標(biāo)記用于表示類似的要素，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施例，而不是全部實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1示出了本發(fā)明的游離dna保存液對普通健康人尿液樣本對比實驗的凝膠電泳檢測圖；圖2示出了本發(fā)明的游離dna保存液對健康孕婦尿液樣本對比實驗的凝膠電泳檢測圖；圖3示出了本發(fā)明的游離dna保存液與對照組保存0d(2h)、8d、14d的凝膠電泳檢測圖；圖4示出了本發(fā)明的游離dna保存液與對照組保存0d(2h)、8d、14d時條帶的光密度分布圖；圖5示出了本發(fā)明的游離dna保存液實驗組、對照組尿液游離dna樣本在4℃、37℃保存14天的凝膠電泳檢測圖；圖6示出了本發(fā)明的游離dna保存液實驗組、對照組尿液游離dna樣本在4℃、37℃保存14天條帶的光密度分布圖；圖7示出了本發(fā)明的游離dna保存液多尿液游離dna樣本保存14天的凝膠電泳檢測圖；圖8示出了本發(fā)明的游離dna保存液不同稀釋比例保存效果圖；圖9示出了本發(fā)明的游離dna保存液與不同配方保存液對尿液游離dna保存0d、+3d、+8d、+14d的凝膠電泳檢測圖；圖10示出了本發(fā)明的游離dna保存液與不同配方保存液對500bp游離dna隨時間變化的保存效果；圖11示出了本發(fā)明的游離dna保存液與不同配方保存液對200bp游離dna隨時間變化的保存效果；圖12示出了本發(fā)明的游離dna保存液與不同配方保存液對100bp游離dna隨時間變化的保存效果。具體實施方式為使本發(fā)明實施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可以相互任意組合。本發(fā)明提供一種游離dna保存液，包括以下組分，以100ml計，各組分的含量為：咪唑烷基脲8～32g；乙二胺四乙酸二鈉0.005～0.036mol；甘氨酸0～2.7g；tritonx-10050～100μl；ph穩(wěn)定劑0～0.005mol；去離子水70～85ml。優(yōu)選的，各組分的含量為：咪唑烷基脲15～32g；乙二胺四乙酸二鈉0.02～0.036mol；甘氨酸0～2.7g；tritonx-10050～100μl；ph穩(wěn)定劑0～0.005mol；去離子水70～83ml。進一步優(yōu)選的，各組分的含量為：咪唑烷基脲30g；乙二胺四乙酸二鈉0.02～0.036mol；tritonx-10050μl；ph穩(wěn)定劑0.005mol；去離子水75～80ml。或咪唑烷基脲30g；乙二胺四乙酸二鈉0.02mol；甘氨酸0.25g；tritonx-10050μl；ph穩(wěn)定劑0.005mol；去離子水76ml。本發(fā)明還提供了游離dna保存液的制備方法，包括以下步驟：將預(yù)定含量的乙二胺四乙酸二鈉、ph穩(wěn)定劑、咪唑烷基脲、甘氨酸置于燒杯中，60～65℃水浴25～35min，優(yōu)選的，65℃水浴30min；溶解后添加預(yù)定含量的tritonx-100，最后添加去離子水定容至100ml，混合均勻；0.25μm濾膜抽濾，即得游離dna保存液。所得保存液的ph值為5.5～7.0。本發(fā)明的游離dna保存液應(yīng)用于保存尿液、組織液的游離dna。該保存液與上述保存樣品的比例為1:20～1:10。實施例保存液制備量取預(yù)定含量的濃度為0.5m的乙二胺四乙酸二鈉溶液、濃度為1m的tris-hcl緩沖液，稱取預(yù)定含量的咪唑烷基脲、甘氨酸置于燒杯中，65℃水浴30min；溶解后，添加預(yù)定含量的tritonx-100，最后添加去離子水定容至100ml，混合均勻；0.25μm濾膜抽濾，即得游離dna保存液。各組分的數(shù)據(jù)可以如表1所示，同時，表1還示出了各實施例保存液的ph值。需要指出的是，本發(fā)明的保存液的配方含量并不局限于表1中數(shù)據(jù)。表1游離dna保存液實施例對比測試?yán)旅娼o出本發(fā)明游離dna保存液的保存效果對比測試?yán)?。由于影響人體尿液、胸水及腹水中游離dna穩(wěn)定性的因素基本一致，考慮到獲取檢測樣本的簡便性和多樣性，選擇尿液樣本進行游離dna保存的對比實驗測試。晨尿中核酸濃度較高、遺傳信息更為豐富，降解風(fēng)險相對較高，更能檢驗保存液質(zhì)量，故采集晨尿樣本。普通健康人尿液中游離dna含量較低(含量范圍0.06～25ng/μl，中值3ng/μl)，對樣本量、提取操作造成一定困難，游離dna片段分布范圍主要在100～1000bp，故采集樣本當(dāng)下設(shè)計添加一定量dnamarker，方便游離dna保存效果檢測與呈現(xiàn)，且節(jié)約時間與成本。以下實施例的尿液游離dna保存液相關(guān)測試實驗中無特殊說明均采集晨尿樣本并添加定量外源dnamarker。對比測試?yán)?普通健康人和健康孕婦尿液游離dna對比實驗保存效果測試1、儀器、試劑和樣本主要儀器：臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司autopure-32)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：實施例1-7保存液、0.1倍添加某品牌血液游離dna保存液cw0.1、0.01倍添加某品牌血液游離dna保存液cw0.01、無菌水對照h2o、磁珠法游離dna提取試劑盒(英芮誠生化科技(上海)有限公司)。樣本：普通健康人、健康孕婦新鮮尿液樣本；dnamarker(smobiodm2000、dm2100)。2、實驗方案：向普通健康人、健康孕婦新鮮尿液樣本中添加定量marker作為含游離dna尿液模型，按比例添加實施例1-7保存液、cw0.1、cw.0.01保存液、無菌水，室溫保存1天，使用磁珠法游離dna提取試劑盒提取各組尿液樣本中的游離dna，電泳檢測提取樣本條帶的完整性，觀察各保存液對尿液游離dna的保存效果。電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠、1×tae緩沖液、110v、25min。電泳上樣量為marker0.95μl、實驗組dna提取樣品5μl。上樣順序從左到右：m(dnamarker)、1(實施例1)、2(實施例2)、3(實施例3)、4(實施例4)、5(實施例5)、6(實施例6)、7(實施例7)、8(cw0.1)、9(cw.0.01)、10(無菌水)。實驗組：各保存液(實施例1-7保存液、cw0.1、cw0.01、h2o)室溫保存尿液游離dna模型1天(+1d)；陰性對照組：無菌水h2o組室溫保存尿液1天(+1d)。3、實驗結(jié)果：對普通健康人，實施例1-7保存液組分均可穩(wěn)定保存游離dna+1d；對孕婦，實驗組中實施例1、2、6保存液對游離dna的保存效果均優(yōu)于其他組保存液的保存效果及無菌水對照。具體見圖1、2。同時，表2還示出了對健康孕婦尿液樣本對比實驗的紫外吸收檢測結(jié)果。表2各保存液的紫外吸收檢測結(jié)果樣本260/280濃度(ng/μl)回收率實施例11.7512.9890.14％實施例21.7613.1291.11％實施例30.00-1.120實施例41.704.6232.08％實施例51.777.5252.11％實施例61.8113.8496.11％實施例71.7710.3972.15％cw0.11.666.3043.75％cw0.010.00-2.460h2o0.00-1.570實驗結(jié)論：實施例1-7的保存液可穩(wěn)定保存普通健康人尿液的游離dna，效果與市售血液游離dna保存液效果相當(dāng)；實施例1、2、6的保存液相較其他配方及市售血液游離dna保存液可以更好地保存健康孕婦尿液的游離dna，適用樣本更廣。對比測試?yán)?保存液與空白對照實驗1、試劑、儀器和樣本主要儀器：臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、磁力架(上海奧潤微納新材料科技有限公司)、數(shù)顯恒溫水浴鍋(邦西儀器科技(上海)有限公司hh-2)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：dnamarker(smobiodm2100)、磁珠法游離dna提取試劑盒(英芮誠生化科技(上海)有限公司)、實施例6保存液。樣本：采集普通健康人新鮮晨尿樣本約35ml。2、實驗方案：晨尿添加保存液后室溫保存，0d(2h)、8d、14d檢測游離dna保存效果。實驗組：14ml尿液添加1ml專利保存液，混勻后室溫保存；對照組：14ml尿液添加1ml無菌水，混勻后室溫保存。檢測時間點：0d(2h)、8d、14d。預(yù)處理：取實驗組、對照組兩組保存樣本各700μl，分別添加等量dnamarker70μl于兩管，充分混勻，各組均分于3個1.5ml離心管室溫保存，用于0d(2h)、8d、14d三個時間點的保存效果檢測。檢測前樣本需進行1000×g離心10min，取上清，使用游離dna提取試劑盒進行游離dna提取。電泳檢測提取樣本條帶的完整性，觀察各保存液對尿液游離dna的保存效果。電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠、1×tae緩沖液、110v、25min。電泳上樣量為marker2μl、實驗組dna提取樣品7μl。上樣順序(從左到右)：ca-0(對照組0d)、ca-8(對照組8d)、ca-14(對照組14d)、n-0(專利保存液組0d)、n-8(專利保存液組8d)、n-14(專利保存液組14d)。3、實驗結(jié)果：保存液產(chǎn)品中游離dna可被完整保存，且回收率達到80％以上，而對照組游離dna則降解快速，具體見圖3、圖4。4、實驗結(jié)論：采用本專利所述試劑盒產(chǎn)品處理的dna可完整保存樣本dna各片段條帶，保存效果良好。對比測試?yán)?尿液樣本極端室溫保存測試實驗1、儀器、試劑和樣本主要儀器：全溫振蕩培養(yǎng)箱(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司hzq-f100)、冰箱(青島海爾股份有限公司bcd-190tmpk)、臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司autopure-32)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：磁珠法游離dna提取試劑盒(英芮誠生化科技(上海)有限公司)、dnamarker(smobiodm2000)、實施例6保存液。樣本：普通健康人新鮮尿液樣本。2、實驗方案：采集普通健康人新鮮尿液樣本，1000×g離心10min取上清，添加定量dnamarker混勻，實驗組和對照組分別使用專利保存液和無菌水保存尿液，保存溫度條件為4℃、37℃，保存0d(2h)、14d對游離dna進行試劑盒提取和電泳條帶完整度檢測。電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠、1×tae緩沖液、110v、25min。電泳dna提取樣品上樣量7μl。實驗組(c組)：保存液保存尿液樣本放置于4℃、37℃；對照組(n組)：無菌水保存尿液樣本放置于4℃、37℃；3、實驗結(jié)果：保存液組4℃、37℃回收率均在80％以上，而對照組則當(dāng)天2h內(nèi)迅速降解。具體見圖5、圖6。表3保存液與無菌水的紫外吸收檢測結(jié)果樣本260/280濃度(ng/μl)回收率c-0d(2h)1.755.0129.47％n-0d(2h)1.7616.9499.65％4℃-c-0d0.000.0004℃-n-14d1.7016.6898.12％37℃-c-0d1.770.070.41％37℃-n-14d1.8116.7898.71％實驗結(jié)論：尿液游離dna保存試劑盒可在4℃、37℃條件下穩(wěn)定保存尿液樣本中的游離dna。對比測試?yán)?保存液多樣本尿液游離dna保存測試實驗1、儀器、試劑和樣本主要儀器：臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司autopure-32)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：磁珠法游離dna提取試劑盒(英芮誠生化科技(上海)有限公司)、實施例6保存液；樣本：普通健康人新鮮尿液。2、實驗方案：針對個體差異問題的存在，為驗證本保存液產(chǎn)品對尿液游離dna樣本保護的有效范圍，采集隨機8人尿液樣本，其中包括男性4人、女性4人(1#為孕期女性；2#為經(jīng)期女性；3#為已婚育女性；4#為未婚女性；5#為糖尿男性；6#、8#為已婚男性、7#為未婚男性)，添加一定量游離dna，進行保存液室溫保存14d，提取0d、+14d游離dna。1000×g離心10min獲取樣本上清，試劑盒提取游離dna，電泳檢測最終提取的游離dna洗脫液，電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠、1×tae緩沖液、電壓100v、時間25min。電泳上樣量為實驗組dna提取樣品7μl。3、實驗結(jié)果：實驗組回收率均在80％以上，條帶保存完整，具體如圖7所示。4、實驗結(jié)論：保存液產(chǎn)品可滿足人群多樣性，可對多種尿液樣本游離dna進行中長期保存。對比測試?yán)?保存液抑菌效果實驗1、儀器、試劑和樣本主要儀器：生物安全柜(東聯(lián)哈爾儀器設(shè)備有限公司classiitypea2)、全溫振蕩培養(yǎng)箱(蘇州培英實驗設(shè)備有限公司hzq-f100)、移液器、一次性培養(yǎng)皿、玻璃涂布棒等。主要試劑：lb固體培養(yǎng)基、實施例6保存液、無菌水。樣本：普通健康人新鮮尿液2、實驗方案：設(shè)實驗組保存液、對照組無菌水保存尿液樣本，分別取室溫保存了6d、10d的尿液樣本同時進行抑菌效果檢測。lb固體培養(yǎng)基鋪lb平板，取各組200μl保存樣本均勻涂于lb平板上，隔天計數(shù)平板菌斑數(shù)。實驗組：保存液保存尿液樣本6d、10d；對照組：無菌水保存尿液樣本6d、10d。3、實驗結(jié)果：對照組6d、10d的lb平板長滿菌落，實驗組6d的lb平板上僅6個菌斑、10d無菌斑。4、實驗結(jié)論：保存液抑菌效果明顯，可避免細(xì)菌繁殖對游離dna的影響。對比測試?yán)?保存液對蛋白尿、血尿模常規(guī)14項檢測效果影響1、儀器、試劑和樣本主要儀器：尿液分析儀(煙臺寶威醫(yī)療器械有限公司)；主要試劑：實施例6保存液、bsa(牛血清白蛋白/新鮮雞血)；樣本：普通健康人新鮮尿液樣本。2、實驗方案：向普通健康人新鮮尿液樣本中添加1gbsa作為蛋白尿模型；添加1ml新鮮雞血作為血尿模型，使用保存液對樣本保存8d、14d(血尿模型為18d)，觀察保存液對尿常規(guī)檢測14項檢測參數(shù)的影響效果。實驗組：保存液保存尿液組0d、8d、14d(血尿18d)；對照組：無菌水組保存尿液組0d、8d、14d(血尿18d)；3、實驗結(jié)果：對照組亞硝酸鹽出現(xiàn)假陽性、其他數(shù)據(jù)無變化；實驗組保存液保存后14項數(shù)據(jù)均無變化。4、實驗結(jié)論：保存液可穩(wěn)定保存蛋白尿、血尿的常規(guī)14項的檢測結(jié)果。對比測試?yán)?保存液稀釋比例對尿液游離dna保存效果的試驗1、儀器、試劑和樣本主要儀器：臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、全自動核酸提取儀(杭州奧盛儀器有限公司autopure-32)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：實施例6保存液。樣本：普通健康人尿液樣本；dnamarker(smobiodm2000)。2、實驗方案：向普通健康人新鮮尿液樣本中添加定量marker作為含游離dna尿液模型，實驗組按1:10、1:20、1:30比例添加專利保存液，室溫保存0d、7d、14d，觀察不同稀釋比例的專利保存液對尿液游離dna的保存效果。3、實驗結(jié)果：按照1:10和1:20比例添加的專利保存液能夠在室溫14天內(nèi)高效保存尿液游離dna，而按1:30比例添加的保存液在14天時的保存效果較差，具體見圖8。4、實驗結(jié)論：本專利保存液的使用稀釋比例在1:20～1:10之間。對比測試?yán)?保存液與其他保存液對尿液游離dna保存效果的試驗1、儀器、試劑和樣本主要儀器：臺式高速冷凍離心機(鹽城市安信儀器設(shè)備有限公司tgl16m)、全自動核酸提取儀(英芮誠生化科技(上海)有限公司ep300)、電泳儀(北京六一生物科技有限公司dyy-8c)、凝膠成像儀(上海天能科技有限公司tanon3500)、微量分光光度計(capitalbionanoqtm)、移液器等。主要試劑：磁珠法游離dna提取試劑盒(英芮誠生化科技(上海)有限公司)、實施例6保存液、其他各成分保存液見設(shè)組。樣本：普通健康人尿液樣本；dnamarker(smobiodm2000)。2、實驗方案：向普通健康人新鮮尿液樣本中添加定量dnamarker作為含游離dna的尿液模型，實驗組按保存液成分不同設(shè)組，室溫保存0d、3d、8d、14d，觀察不同保存液對尿液游離dna的保存效果及常規(guī)項檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。1000×g離心10min獲取樣本上清，試劑盒提取游離dna，電泳檢測最終提取的游離dna洗脫液，電泳條件為：2％瓊脂糖凝膠、1×tae緩沖液、電壓100v、時間25min。電泳上樣量為marker1.8μl(代表100％回收率)、實驗組dna提取樣品8μl。設(shè)組：ca(對照組-無菌水)、tdz(某品牌市售尿液保存液)、a、d、e、f(對應(yīng)保存液a、d、e、實施例6保存液)。ca：無菌水，ph8.0；a:250mmedta·2na、0.9％nacl、0.5％pfa、0.2％dtt、30％無水乙醇50mmtris-hcl，ph8.0；d：1％peg6000、1％丁酰胺、250mmedta·2na、50mmtris-hcl，ph8.0；e：2％peg、0.4％pfa、20mmedta·2na、5％tris-hcl、50％無水乙醇，ph7.4；f：30g咪唑烷基脲、0.02moledta、50μltritonx-100、0.005moltris-hcl、76ml去離子水，ph6.7；時間點：0d(+4h)、3d、8d、14d。3、實驗結(jié)果：a：各配方保存液dna樣本凝膠電泳檢測圖9及代表游離dna典型片段范圍的500bp、200bp、100bp的光密度圖10-12，500bp代表游離dna較大片段，200bp、100bp代表小片段。無菌水ca組在2h內(nèi)便降解70％、電泳條帶模糊，3天時已完全降解；d組可以短期(3d)保存游離dna，之后大片段逐步降解為小片段(14d時，c組500bp含量下降而200bp、100bp上升)；a、e在實驗周期內(nèi)可完整保存較大片段(500bp80％以上)，但200bp以下的小片段不能保存；市售同類產(chǎn)品tdz組與本發(fā)明的保存液f組可以在14天內(nèi)對所有片段保存，但是對小片段100bp的保存效果f組(約85％)明顯優(yōu)于tdz組(約70％)。b：在常規(guī)14項的檢測結(jié)果的穩(wěn)定性實驗的第三天，無菌水ca組出現(xiàn)潛血項假陽性、ph從6.0增加到7.5；市售同類產(chǎn)品tdz組出現(xiàn)亞硝酸鹽假陽性、ph為7.5；專利保存液f組各項結(jié)果穩(wěn)定僅ph從6.0增加到6.5稍有變動。常規(guī)項檢測實驗結(jié)果僅體現(xiàn)0、+3d的，+8d、+14d實驗結(jié)果與+3d一致。4、實驗結(jié)論：專利保存液相較于市售某品牌尿液保存液可以更完整、更長時間地保存ucfdna和穩(wěn)定尿常規(guī)項的檢測結(jié)果。綜上所述，根據(jù)本發(fā)明提供的游離dna保存液可以完整地中長期保存人體尿液、組織液中的游離dna、可以適用多樣本尿液、組織液游離dna的保存，適用范圍廣，可以保證后續(xù)樣本檢測的準(zhǔn)確度和可信度。最后應(yīng)說明的是：在本文中，術(shù)語“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包含一系列要素的過程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下，由語句“包括一個…”限定的要素，并不排除在包括所述要素的過程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素。以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制。盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的精神和范圍。當(dāng)前第1頁12