本發(fā)明屬于酶的固定化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種易于分離的磁性納米酶反應(yīng)器酶@zif-8@fe3o4及其制備方法。

背景技術(shù)：

酶催化反應(yīng)由于具有條件溫和、高效定向、環(huán)境友好等特點(diǎn)，如今已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)合成、藥物制備等領(lǐng)域，被視為化學(xué)品綠色合成的重要手段，對實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略具有重要意義。酶是由氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有四級空間結(jié)構(gòu)，它的高級結(jié)構(gòu)對環(huán)境非常敏感，許多外界因素如物理因素(溫度、壓力)、化學(xué)因素(氧化還原、有機(jī)溶劑、ph、離子強(qiáng)度、金屬離子)和生物因素(酶的修飾、酶降解)都會(huì)對酶的活性有比較大的影響。酶即使在最適條件下進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)速度也會(huì)隨反應(yīng)時(shí)間的延長而有所下降，并且游離酶在參與反應(yīng)后，很難回收再利用，增加了反應(yīng)成本。酶的這些劣勢可以通過酶的固定化來改善，從而增加其操作穩(wěn)定性。

金屬-有機(jī)骨架材料(metal-organicframeworks，簡稱mofs)，又稱為無機(jī)-有機(jī)雜化材料，是指由金屬中心與多齒有機(jī)配體間自組裝形成的具有一維、二維或三維超分子微孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶態(tài)多孔材料。mofs材料具有良好的孔結(jié)構(gòu)、孔道分布均勻、比表面積大、高穩(wěn)定性并且結(jié)構(gòu)和功能具有可調(diào)性等特點(diǎn)，因此在氣體吸附和分離、化學(xué)催化、藥物傳遞及釋放、蛋白質(zhì)固定化等領(lǐng)域有非常廣泛的運(yùn)用。將mofs材料用作酶的固定化載體，在酶的使用過程中可以較大限度的避免酶的泄露，提高其操作穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。這是因?yàn)閙ofs材料合適的孔尺寸，完美的形貌和一些表面修飾的基團(tuán)有利于酶的固定化。以mofs材料微平臺(tái)設(shè)計(jì)合成固定化酶反應(yīng)器是一個(gè)較新的研究領(lǐng)域，通過改變構(gòu)筑mofs材料過程中的有機(jī)配體類型，可以構(gòu)筑出不同孔徑大小以及表面帶有不同修飾基團(tuán)的mofs材料用于酶的固定化。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種易于分離的酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器，以及該反應(yīng)器的制備方法。

解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：該磁性納米酶反應(yīng)器是以檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子為核，在其表面包覆一層zif-8外殼，形成zif-8@fe3o4核殼結(jié)構(gòu)，然后將酶固定在載體上，其中所述的酶為氯過氧化物酶、辣根過氧化物酶、細(xì)胞色素c中的任意一種，檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子的粒徑為250～300nm，其表面包覆的固載酶的zif-8外殼的厚度為50～80nm。

本發(fā)明酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的制備方法由下述步驟組成：

1、檸檬酸修飾fe3o4磁性納米粒子

將磁性fe3o4粉末均勻分散于超純水中，然后加入1～3mol/l的檸檬酸水溶液，在n2保護(hù)下80～100℃攪拌60～120分鐘，冷卻至室溫，用磁鐵分離產(chǎn)物后用純水洗滌，真空干燥，得到檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子。

2、制備酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器

將檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子均勻分散于乙醇水溶液，再加入zn(no3)2、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37％的hcl水溶液、2-甲基咪唑、聚乙烯吡咯烷酮、酶，常溫?cái)嚢?0～20分鐘，用磁鐵分離產(chǎn)物后，依次用乙醇和超純水洗滌，真空干燥，得到酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器。

上步驟1中，優(yōu)選磁性fe3o4粉末與檸檬酸的摩爾比為1:(2～3)，進(jìn)一步優(yōu)選在n2保護(hù)下90℃攪拌90分鐘。

上述步驟2中，zn(no3)2、2-甲基咪唑、hcl的摩爾比為1:(8～12):(0.05～0.2)，檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子與酶、zn(no3)2、聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為100:(0.1～1):(80～150):(150～250)，優(yōu)選zn(no3)2、hcl、2-甲基咪唑的摩爾比為1:0.1:10，檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子與酶、zn(no3)2、聚乙烯吡咯烷酮的質(zhì)量比為100:0.4:110:180。

上述步驟2中，所述乙醇水溶液中乙醇的體積濃度優(yōu)選為40％～60％。

上述的聚乙烯吡咯烷酮的重均分子量為8000～12000。

本發(fā)明利用denovo法在fe3o4磁性納米粒子表面修飾檸檬酸后包覆zif-8，形成zif-8@fe3o4核殼結(jié)構(gòu)，同時(shí)在包覆zif-8的過程中將氯過氧化物酶(cpo)、辣根過氧化物酶(hrp)和細(xì)胞色素c(cytc)三種酶固載到zif-8上，得到具有磁性分離效果的酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器。本發(fā)明制備方法簡便，所得酶@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較游離酶均有顯著提高，且具有極佳的重復(fù)使用性。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的掃描電鏡圖。

圖2是實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的透射電鏡圖。

圖3是zif-8、fe3o4、ca-fe3o4和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器及實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的x射線粉末衍射圖。

圖4是zif-8、ca-fe3o4和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器及實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的紅外光譜圖。

圖5是實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的eds能譜圖。

圖6是zif-8@fe3o4和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的熱重分析圖。

圖7是zif-8@fe3o4和實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的熱重分析圖。

圖8是zif-8@fe3o4和實(shí)施例3制備的cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的熱重分析圖。

圖9是溫度對hrp游離酶和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器催化活性的影響。

圖10是溫度對cpo游離酶和實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器催化活性的影響。

圖11是溫度對cytc游離酶和實(shí)施例3制備的cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器催化活性的影響。

圖12是hrp游離酶和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器在60℃下反應(yīng)不同時(shí)間對催化活性的影響。

圖13是cpo游離酶和實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器在50℃下反應(yīng)不同時(shí)間對催化活性的影響。

圖14是cytc游離酶和實(shí)施例3制備的cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器在70℃下反應(yīng)不同時(shí)間對催化活性的影響。

圖15是hrp游離酶和實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的ph穩(wěn)定性。

圖16是cpo游離酶和實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的ph穩(wěn)定性。

圖17是cytc游離酶和實(shí)施例3制備的cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的ph穩(wěn)定性。

圖18是實(shí)施例1制備的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的重復(fù)使用性效果圖。

圖19是實(shí)施例2制備的cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的重復(fù)使用性效果圖。

圖20是實(shí)施例3制備的cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的重復(fù)使用性效果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。

實(shí)施例1

1、檸檬酸修飾fe3o4磁性納米粒子

將1.0g(4mmol)磁性fe3o4粉末、50ml超純水加入250ml三口燒瓶中，在攪拌下超聲20分鐘，使磁性fe3o4粉末均勻分散于超純水中，然后加入4.5ml2.0mol/l的檸檬酸水溶液，在n2保護(hù)下90℃攪拌90分鐘，冷卻至室溫，用磁鐵分離出產(chǎn)物，產(chǎn)物用純水洗滌干凈后置于真空干燥箱中60℃真空干燥5小時(shí)，得到檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子(ca-fe3o4)。

2、制備hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器

將50.0mg檸檬酸修飾的fe3o4磁性納米粒子研磨后置于100ml燒杯中，加入10ml體積分?jǐn)?shù)為50％的乙醇水溶液，再加入55.0mg(0.29mmol)zn(no3)2及3mg質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37％(0.029mmol)的hcl水溶液，將混合液在室溫下超聲20分鐘，使固體粉末均勻分散在乙醇水溶液中，再加入235.0mg(2.86mmol)2-甲基咪唑、90mg重均分子量為10000的聚乙烯吡咯烷酮和200μl1mg/ml辣根過氧化物酶，搖勻后將混合液攪拌10分鐘，用磁鐵收集產(chǎn)物，分別用乙醇和超純水洗滌三次，得到的產(chǎn)物置于真空干燥箱中30℃真空干燥8小時(shí)，得到hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中，用等質(zhì)量的氯過氧化物酶(cpo)替換實(shí)施例1中的辣根過氧化物酶，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器。

實(shí)施例3

本實(shí)施例中，用等質(zhì)量的細(xì)胞色素c(cytc)替換實(shí)施例1中的辣根過氧化物酶，其他步驟與實(shí)施例1相同，得到cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器。

發(fā)明人采用環(huán)境掃描電子顯微鏡-eds能譜、透射電子顯微鏡、x射線衍射儀、傅里葉變換紅外光譜儀、熱分析系統(tǒng)分別對實(shí)施例1～3所得磁性納米酶反應(yīng)器進(jìn)行表征，結(jié)果見圖1～8。由圖1、2可見，檸檬酸修飾的磁性fe3o4在包覆了zif-8后尺寸明顯增大，檸檬酸修飾的磁性fe3o4的粒徑約為250～300nm，zif-8外殼約為50～80nm，形成的hrp@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器為形貌均一的球形。由圖3可見，hrp@zif-8@fe3o4和cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的衍射峰中均既有zif-8的特征峰，還存在fe3o4的特征衍射峰，酶的加入并不會(huì)影響zif-8@fe3o4的結(jié)構(gòu)。由圖4可見，hrp@zif-8@fe3o4和cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器同時(shí)有fe3o4和zif-8所具有的官能團(tuán)，由圖5可見，hrp@zif-8@fe3o4和cpo@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器中存在c、n、o、fe、zn幾種元素。圖3～5的表征結(jié)果說明成功合成了酶@zif-8@fe3o4核殼結(jié)構(gòu)。

由圖6、7、8可見，hrp@zif-8@fe3o4、cpo@zif-8@fe3o4和cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器的失重比例均大于zif-8@fe3o4的失重比例，可以歸屬為樣品中蛋白質(zhì)的分解，說明三種酶均能引入zif-8@fe3o4結(jié)構(gòu)，該固定化方法對這三種酶具有普適性。

為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器催化abts過氧化反應(yīng)生成藍(lán)綠色的abts⁺，以三種磁性納米酶反應(yīng)器催化abts的轉(zhuǎn)化率及相對轉(zhuǎn)化率考察這三種磁性納米酶反應(yīng)器的穩(wěn)定性，具體實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下：

1、熱穩(wěn)定性

將三種游離酶(hrp、cpo和cytc)和實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器分別在不同溫度下溫浴3h后用于催化abts過氧化反應(yīng)，比較游離酶和磁性納米酶反應(yīng)器的熱穩(wěn)定性大小。反應(yīng)體系中：h2o2濃度為0.1mol·l^-1、ph＝5、hrp濃度為200μmol·l^-1、cpo濃度為400μmol·l^-1、cytc濃度為500μmol·l^-1。試驗(yàn)結(jié)果見圖9～11。圖9～11的結(jié)果表明，游離hrp、cpo和cytc的最佳反應(yīng)溫度分別為25℃、35℃和40℃，而hrp@zif-8@fe3o4、cpo@zif-8@fe3o4和cytc@zif-8@fe3o4的最佳反應(yīng)溫度分別為30℃、40℃和50℃，最適反應(yīng)溫度均有所提高。最適反應(yīng)溫度之后，游離酶和磁性納米酶反應(yīng)器的催化活性都隨著溫度的升高而下降，與游離酶相比，三種磁性納米酶反應(yīng)器都在較高溫條件下表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。

將三種游離酶(hrp、cpo和cytc)和實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器分別在一定溫度下(hrp：60℃；cpo：50℃；cytc：70℃)溫浴3h，比較游離酶和磁性納米酶反應(yīng)器的熱穩(wěn)定性大小。由圖12～14可見，隨著溫浴時(shí)間的延長，游離酶和磁性納米酶反應(yīng)器的催化活性逐漸降低，在60℃溫浴3h后游離hrp僅剩余30.1％的催化活性，而實(shí)施例1制備的磁性納米酶反應(yīng)器仍有71.4％催化活性；在50℃溫浴3h后游離cpo催化活性不足10％，而實(shí)施例2制備的磁性納米酶反應(yīng)器仍有81.3％的催化活性；在70℃溫浴3h后，游離cytc僅剩31.7％的催化活性，而實(shí)施例3制備的磁性納米酶反應(yīng)器仍具有84.1％的催化活性，進(jìn)一步說明三種磁性納米酶反應(yīng)器比相應(yīng)的游離酶展現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。

2、酸堿穩(wěn)定性

將三種游離酶(hrp、cpo和cytc)和實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器在不同ph(3.0～7.0)的0.1mol/l磷酸緩沖溶液中用于催化abts過氧化反應(yīng)，考察它們在不同ph的磷酸緩沖溶液中的酸堿穩(wěn)定性大小(底物濃度：400mol/l；h2o2濃度：0.1mol/l；溫度：30℃)。試驗(yàn)結(jié)果見圖15～17。由圖15～17可見，三種磁性納米酶反應(yīng)器反應(yīng)的最適ph較相應(yīng)的游離酶均發(fā)生偏移，在不同ph下，磁性納米酶反應(yīng)器的催化效率總是高于游離酶。

3、重復(fù)使用性

將實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器分別用于abts過氧化反應(yīng)，反應(yīng)30min后離心測定上層反應(yīng)液在415nm處的吸光度值，將下層的磁性納米酶反應(yīng)器用于催化下一次的abts過氧化反應(yīng)，以第一次abts轉(zhuǎn)化率為100％，將之后每一次的轉(zhuǎn)化率與第一次的比較，以殘余活性表征磁性納米酶反應(yīng)器的重復(fù)使用性。結(jié)果見圖18～20。由圖18～20可見，實(shí)施例1～3制備的磁性納米酶反應(yīng)器均具有極佳的重復(fù)使用性，hrp@zif-8@fe3o4、cpo@zif-8@fe3o4和cytc@zif-8@fe3o4磁性納米酶反應(yīng)器在重復(fù)使用5次后分別保持90.0％、89.1％、88.4％的催化活性，在重復(fù)使用12次之后均保持50％以上的催化活性。