本發(fā)明屬于獸藥和生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及為一種用于抗犬貓腹瀉的復(fù)合卵黃抗體粉及其制備生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
：作為人類最重要的伴侶動(dòng)物，犬貓?jiān)谖覀兊纳钪邪缪葜匾巧Ｈ欢?，在國?nèi)，犬貓的疾病防控研究卻嚴(yán)重滯后；犬貓?jiān)谖覀兊木幼…h(huán)境中遭受著種種不利因素的應(yīng)激和病原的侵襲，對(duì)其胃腸道健康狀況產(chǎn)生了較大的影響，特別是犬貓的腹瀉問題。引起犬貓病原性腹瀉多見于細(xì)小病毒、冠狀病毒和輪狀病毒等感染，還有條件性致病的腸毒素型大腸桿菌感染；前者由于是病毒性腹瀉，使用抗生素?zé)o效，后者由于大腸桿菌的耐藥性太強(qiáng)，使用抗生素的效果也不理想，這樣導(dǎo)致犬貓的腹瀉防治難度加大。因此，如何預(yù)防和治療犬貓腹瀉性疾病的發(fā)生，降低犬貓的發(fā)病率和死亡率，減少或取消抗生素藥物的使用，給犬貓疾病防治研究者提出了系列研究課題。近年來，有報(bào)道采用制備卵黃抗體的方法制備含有抗體的卵黃抗體粉，添加于飼料或其它活性藥物中飼喂動(dòng)物，能夠針對(duì)具有廣泛性的疾病起到一定的預(yù)防作用，提高動(dòng)物的抗病能力。例如，專利申請(qǐng)200810217587.6公開了一種含有抗豬cck/urease的雙效價(jià)卵黃抗體的卵黃粉及其制備方法；專利申請(qǐng)201710037459.2公開了一種用于防治斷奶仔豬腹瀉的藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用。然而，針對(duì)犬貓的有關(guān)常見疾病預(yù)防的添加物尚未見報(bào)道。另外，發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，在卵黃抗體的制備方法中，通常采用全病毒和全細(xì)菌滅活來制備抗原，以對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，然而，這樣的處理導(dǎo)致抗原特異性不強(qiáng)，抗體效價(jià)偏低，使用效果差，使用成本高，商業(yè)應(yīng)用價(jià)值不大。因此，仍需對(duì)制備生產(chǎn)方法進(jìn)行改進(jìn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決上述技術(shù)問題，發(fā)明人首先對(duì)影響犬貓健康狀況、尤其是胃腸道健康狀況的因素進(jìn)行篩選，選擇細(xì)小病毒、冠狀病毒、輪狀病毒和大腸桿菌f4\f5\f6\f18四價(jià)菌毛蛋白的重組抗原作為免疫原，分別對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，在獲得卵黃抗體粉之后再以一定比例進(jìn)行混合，可獲得能夠?qū)θ埑Ｒ娂膊?主要針對(duì)腹瀉)進(jìn)行預(yù)防的復(fù)合卵黃抗體粉，從而完成本發(fā)明。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種復(fù)合卵黃抗體粉，所述復(fù)合卵黃抗體粉中含有抗細(xì)小病毒抗體、抗冠狀病毒抗體、抗輪狀病毒抗體以及抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)抗體。所述抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)抗體包括抗f4大腸桿菌抗體、f5大腸桿菌抗體、f6大腸桿菌抗體、f18大腸桿菌抗體。優(yōu)選地，所述復(fù)合卵黃抗體粉中，抗細(xì)小病毒抗體滴度≥1600:1；抗冠狀病毒抗體滴度≥1600:1；抗輪狀病毒抗體滴度≥1600:1；抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)抗體滴度≥1600:1。采用以下方法對(duì)本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉中的卵磷脂含量進(jìn)行測(cè)定：(a)標(biāo)準(zhǔn)品的配制:首先將標(biāo)準(zhǔn)品溶解在甲醇/氯仿(1:1)溶液中，制成濃度約為2毫克/毫升的溶液，然后將該標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度按順序減半，旨在為每個(gè)分析物提供78至10000ngo.c.的校準(zhǔn)范圍；(b)卵黃粉樣品的配制：稱取90.3毫克卵黃粉倒入2毫升玻璃瓶中，加入150微升甲醇氯仿(1:1)溶液，渦流混合；再加入500微升乙腈，渦流混合，旨在使蛋白沉淀；再加入1350微升甲醇/氯仿(1:1)溶液，渦流混合且使其靜置；最后移取上清液并以10000克×3分鐘進(jìn)行離心，再移取上清液進(jìn)行hplc檢測(cè)；(c)數(shù)據(jù)分析:本測(cè)定所使用的hplc系統(tǒng)為hermoscientifictmhypersil、goldtmsilicacolumn，數(shù)據(jù)采用thermoscientifictmdionextmchromeleontmchromatographydatasystem軟件進(jìn)行整理和分析。優(yōu)選地，以重量計(jì)，所述復(fù)合卵黃抗體粉中卵磷脂含量為8％-12％。優(yōu)選地，以重量計(jì)，所述復(fù)合卵黃抗體粉中包含10-50％抗細(xì)小病毒卵黃抗體、10-50％抗冠狀病毒卵黃抗體、10-50％抗輪狀病毒卵黃抗體、10-50％抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體和1-2％拮抗劑，各組分之和為100％。所述拮抗劑優(yōu)選為二氧化硅。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了所述復(fù)合卵黃抗體粉的制備方法，所述方法包括以下步驟：a免疫原制備：將細(xì)小病毒、冠狀病毒、輪狀病毒以及腸毒素型大腸桿菌f4\f5\f6\f18四價(jià)菌毛蛋白的重組抗原加佐劑分別制成細(xì)小病毒免疫原、冠狀病毒免疫原、輪狀病毒免疫原和腸毒素型大腸桿菌四價(jià)免疫原；b產(chǎn)蛋雞的免疫：用所述細(xì)小病毒免疫原、冠狀病毒免疫原、輪狀病毒免疫原和腸毒素型大腸桿菌四價(jià)免疫原分別對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，接種3次，經(jīng)elisa檢測(cè)卵黃抗體滴度≥16000:1后，開始收集雞蛋；c卵黃抗體粉的制備：將所述雞蛋經(jīng)清洗、打蛋分離后得到卵黃，經(jīng)均質(zhì)、巴氏殺菌后，再經(jīng)噴霧干燥，分別獲得抗細(xì)小病毒卵黃抗體、抗冠狀病毒卵黃抗體、抗輪狀病毒卵黃抗體、抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體；d復(fù)合卵黃抗體粉的制備：將所述抗細(xì)小病毒卵黃抗體、抗冠狀病毒卵黃抗體、抗輪狀病毒卵黃抗體、抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體與拮抗劑混合，獲得復(fù)合卵黃抗體粉。其中，步驟a中的佐劑可以為任何類型的佐劑，優(yōu)選弗氏佐劑。優(yōu)選地，步驟c中，所述卵黃在8-16mpa壓力下均質(zhì)、50-68℃巴氏殺菌3-6分鐘，再在進(jìn)風(fēng)120-200℃、排風(fēng)50-80℃條件下噴霧干燥，分別獲得抗細(xì)小病毒卵黃抗體、抗冠狀病毒卵黃抗體、抗輪狀病毒卵黃抗體、抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體。在又一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明所述復(fù)合卵黃抗體粉的制劑，所述制劑為膏劑、沖劑或微囊劑。所述膏劑、沖劑或微囊劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法來制備。有益效果：本發(fā)明的用于抗犬貓腹瀉的復(fù)合卵黃抗體粉，同時(shí)包含病毒抗體和細(xì)菌抗體，可全面有效地預(yù)防和治療犬貓各類腹瀉，進(jìn)行減少甚至替代抗生素的使用，降低腹瀉的發(fā)病率和犬貓的死亡率。另一方面，犬貓的皮毛是保護(hù)其免受外界有害環(huán)境的影響，維持正常體溫、抵抗病原體侵害的重要屏障。皮毛的健康狀態(tài)是犬貓的重要特征，華麗的皮毛是寵物犬貓的第二生命。目前市場(chǎng)上，幫助犬貓亮膚亮毛的普通營養(yǎng)物質(zhì)主要有蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、維生素等。而本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉中還含有卵磷脂，能促進(jìn)犬貓亮膚亮毛，減少皮膚病發(fā)生。具體實(shí)施方式實(shí)施例1按照生產(chǎn)100kg用于抗犬貓腹瀉的復(fù)合卵黃抗體粉的規(guī)模，采用如下步驟進(jìn)行生產(chǎn)：a免疫原制備：將細(xì)小病毒、冠狀病毒、輪狀病毒以及腸毒素型大腸桿菌f4\f5\f6\f18四價(jià)菌毛蛋白的重組抗原加弗氏佐劑，分別制成細(xì)小病毒免疫原、冠狀病毒免疫原、輪狀病毒免疫原和腸毒素型大腸桿菌四價(jià)免疫原，其中，所述腸毒素型大腸桿菌四價(jià)免疫原為基因工程獲得的包含f4/f5/f6/f18大腸桿菌抗原的四價(jià)免疫原；b產(chǎn)蛋雞的免疫：用所述細(xì)小病毒免疫原、冠狀病毒免疫原、輪狀病毒免疫原和腸毒素型大腸桿菌四價(jià)免疫原分別對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫，接種3次，經(jīng)elisa檢測(cè)卵黃抗體滴度≥16000:1后，開始收集雞蛋；c卵黃抗體粉的制備：將所述雞蛋經(jīng)全自動(dòng)清洗、打蛋分離后得到卵黃，在12mpa壓力下均質(zhì)、68℃巴氏殺菌3分鐘，再在進(jìn)風(fēng)180℃、排風(fēng)70℃條件下噴霧干燥，分別獲得抗細(xì)小病毒卵黃抗體、抗冠狀病毒卵黃抗體、抗輪狀病毒卵黃抗體、抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體；d復(fù)合卵黃抗體粉的制備：將25kg所述抗細(xì)小病毒卵黃抗體、25kg抗冠狀病毒卵黃抗體、23kg抗輪狀病毒卵黃抗體、25kg抗腸毒素型大腸桿菌四價(jià)卵黃抗體與2kg二氧化硅混合，獲得復(fù)合卵黃抗體粉。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例1在本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中，研究了本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉對(duì)幼犬腹瀉的預(yù)防效果。1、試驗(yàn)方法：選擇體重與日齡相近的幼犬160只，隨機(jī)分入對(duì)照組和試驗(yàn)組，其中試驗(yàn)組80只，對(duì)照組80只，試驗(yàn)期30天。試驗(yàn)組飼喂含0.2％本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合卵黃抗體粉的飼料，對(duì)照組飼喂普通飼料，兩組飼養(yǎng)管理相同。2、試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。表1由以上結(jié)果可以看出，試驗(yàn)組較對(duì)照組成活率提高了6.25％，腹瀉發(fā)病率降低了10％，因此，本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉有效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)幼犬腹瀉的預(yù)防，提高了成活率。實(shí)驗(yàn)實(shí)施例2在本實(shí)驗(yàn)實(shí)施例中，研究了本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉對(duì)腹瀉幼貓的臨床療效。1、試驗(yàn)方法：北京某貓舍，選取臨床腹瀉幼貓60只，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室pcr確診為貓腸道冠狀病毒感染，隨機(jī)分入試驗(yàn)組和對(duì)照組，其中：試驗(yàn)組30只，對(duì)照組30只，治療期為5天，試驗(yàn)組按2g/kg體重的標(biāo)準(zhǔn)口服本發(fā)明實(shí)施例1的復(fù)合卵黃抗體粉，對(duì)照組口服微生態(tài)制劑(地依芽胞桿菌)進(jìn)行治療。2、試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。其中，完全治愈是指停藥后2天內(nèi)無嘔吐腹瀉癥狀，幼貓精神和食欲基本恢復(fù)正常；腹瀉好轉(zhuǎn)是指水便轉(zhuǎn)為稀便，含水量大大減少。表2項(xiàng)目試驗(yàn)組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)用只數(shù)3030完全治愈只數(shù)2711腹瀉好轉(zhuǎn)只數(shù)26死亡只數(shù)113治愈率(％)90.0％36.67％死亡率(％)3.33％43.33％由以上結(jié)果可以看出，試驗(yàn)組較對(duì)照組5天內(nèi)治愈率提高了53.33％，死亡率降低了40％，差異顯著，因此，本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉有效地實(shí)現(xiàn)了對(duì)幼貓腹瀉疾病的治療，大大提高了治愈率。此外，相較于飼喂普通飼料的犬貓，飼喂添加了本發(fā)明的復(fù)合卵黃抗體粉的飼料的犬貓，毛發(fā)明顯發(fā)亮。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當(dāng)前第1頁12