本發(fā)明屬于固定化酶制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種石墨相氮化碳納米片表面固定化酶的制備方法。

背景技術(shù)：

酶作為具有特殊催化功能的生物催化劑，由于其催化高效性、高專一性及反應(yīng)條件溫和等性質(zhì)被廣泛用于生物工程、食品工業(yè)、醫(yī)藥、精細化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域。游離酶在水溶液中催化活性很不穩(wěn)定，重復(fù)使用性差，同時在高溫、高離子濃度、強酸、強堿及部分有機溶劑等環(huán)境中不夠穩(wěn)定，容易降低甚至喪失其催化能力。另外，酶促反應(yīng)結(jié)束后游離酶不易從反應(yīng)體系中分離，產(chǎn)物中會殘留部分酶，導(dǎo)致產(chǎn)品純度不高甚至酶回收重復(fù)使用性變差。游離酶的這些不足極大制約了其在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用。

為了解決酶循環(huán)使用的問題，人們多采用將酶固定于載體材料。目前用于固定酶的方法主要有物理法(吸附和包埋)和化學(xué)法(交聯(lián)和共價結(jié)合)。物理法主要是通過氫鍵、靜電吸附、范德華力等微弱的分子間作用力將酶吸附到載體表面實現(xiàn)酶的固定化，操作簡單且成本低，易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，是目前使用較多的一種固定酶方法。但物理法中酶與載體材料之間的吸附力強度較弱，酶易從載體材料上脫落，進而影響固定化酶的催化活性以及循環(huán)使用效果?；瘜W(xué)法主要是通過載體的活性官能團與酶分子中的部分官能團形成共價鍵，由于這種共價結(jié)合力度強并且具有特異性固定的特征，從而大大提高了酶的穩(wěn)定性。

針對載體材料固定酶的專利及文獻，其載體材料主要是采用無機材料(如介孔碳材料、tio2、介孔二氧化硅及硅膠等)和聚合物材料(如多糖、苯乙烯樹脂、聚羥基丁酸戊酯等)來固定酶。中國專利cn201210421203.9公開了一種聚合物基材表面固定化酶的方法，在聚合物表面吸附光引發(fā)劑或共價連接光感應(yīng)休眠基團，在可見光或紫外光照射下，光引發(fā)劑或休眠基團產(chǎn)生自由基，引發(fā)含有游離酶的單體溶液進行可控交聯(lián)聚合反應(yīng)，最終將酶固定在表面交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。酶的固定化在可見光、低溫或室溫下進行，反應(yīng)條件溫和，有利于酶活性的保持。凝膠/基材復(fù)合結(jié)構(gòu)提高了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的機械強度，克服了凝膠網(wǎng)絡(luò)易被破壞的缺點。中國專利cn201010190239.1公開了一種聚氨酯納米纖維固定化酶的制備方法，以聚氨酯為原料，通過靜電紡絲制備出聚氨酯納米纖維，通過物理吸附的方法將惰性蛋白質(zhì)吸附在纖維表面，獲得表面改性的聚氨酯納米纖維，利用戊二醛作為交聯(lián)劑，通過共價鍵結(jié)合的方法將酶固定化在表面改性的納米纖維上。該發(fā)明制備的固定化酶具有在有機溶劑中失活或者在高溫下失活后，重新放置于緩沖溶液中能夠逐步恢復(fù)大部分活性的特性，從而使其在有機溶劑中或者高溫條件下具有更好的穩(wěn)定性和更長的使用壽命。中國專利cn201410114538.5公開了一種磁驅(qū)固定化酶，利用硅基化外殼包埋鐵粒子，目標酶通過基團化試劑引入的官能化基團固定化在硅基材料的外殼上，延長酶使用時間，賦予固定化酶磁釋放、驅(qū)動和回收能力，可以在大水體催化反應(yīng)中得到應(yīng)用。但是這些載體材料制備過程復(fù)雜，原料昂貴，不利于產(chǎn)業(yè)化。

近些年來，石墨相氮化碳材料，因其具有獨特的電子結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性，在能源轉(zhuǎn)化和材料相關(guān)領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。作為催化劑和催化劑載體，石墨相氮化碳材料在有機官能團的選擇性轉(zhuǎn)換、太陽能轉(zhuǎn)化利用、燃料電池陰極氧還原反應(yīng)等不同研究領(lǐng)域得到了廣泛地應(yīng)用。該材料可以由尿素、三聚氰胺、二氰二胺等廉價易得的原材料，通過簡單高溫煅燒法批量制備，具有大規(guī)模生產(chǎn)及商業(yè)化的潛力。文獻報道了利用空氣中的氧氣將石墨相氮化碳中層與層之間的結(jié)構(gòu)部分氧化，刻蝕，得到石墨相氮化碳納米片(p.niu,l.l.zhang,etal.advancedfunctionalmaterials2012,22,(22),4763)。這種制備方法操作簡單，可實現(xiàn)石墨相氮化碳納米片的生產(chǎn)。目前還未有利用氮化碳納米片為載體材料的固定化酶相關(guān)的文獻和專利。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有固定化酶所用載體材料制備過程復(fù)雜、原料成本高等問題，提供一種石墨相氮化碳納米片作為固定化酶載體材料在制備固定化酶中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種石墨相氮化碳納米片表面固定化酶的制備方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

石墨相氮化碳納米片表面具有氨基活性基團，本發(fā)明利用雙功能化學(xué)交聯(lián)劑實現(xiàn)了石墨相氮化碳納米片對生物酶分子的固定，提高了酶的操作穩(wěn)定性與底物環(huán)境相容性，為固定化酶的催化提供了有利的催化界面環(huán)境，提高了酶的催化效率。因此，石墨相氮化碳納米片可作為固定化酶載體材料用于制備固定化酶。

一種石墨相氮化碳納米片表面固定化酶的制備方法，包括以下步驟：

(1)交聯(lián)劑活化石墨相氮化碳納米片材料：將石墨相氮化碳納米片分散于含雙功能交聯(lián)劑的磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)中進行活化，活化后再通過洗滌除去未反應(yīng)的游離的交聯(lián)劑。

(2)石墨相氮化碳納米片表面固定化酶的制備：將目標酶溶解于磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)中，冷凍離心收集上層酶溶液，除去未完全溶解的酶。將上述活化后的石墨相氮化碳納米片與目標酶溶液混合，震蕩反應(yīng)使目標酶固定在石墨相氮化碳納米片上，反應(yīng)結(jié)束后洗滌、冷凍離心，得到石墨相氮化碳納米片表面固定化酶。

所述的石墨相氮化碳納米片優(yōu)選通過包括以下步驟的方法制備得到：將氮化碳前驅(qū)體于550～600℃煅燒2～4小時，得到石墨相塊狀氮化碳，將其研磨成粉末狀再于500～550℃煅燒2小時，得到石墨相氮化碳納米片。所述的氮化碳前驅(qū)體包括但不限于二腈二氨(dcda)。

步驟(1)中，所述的雙功能交聯(lián)劑優(yōu)選為戊二醛，磷酸緩沖液中戊二醛的質(zhì)量百分含量優(yōu)選為6～10％，石墨相氮化碳納米片在磷酸緩沖液中的濃度優(yōu)選25～35mg/ml；所述的活化的條件優(yōu)選為50～70℃下振蕩10～16小時。

步驟(2)中，所述的目標酶包括但不限于皺褶假絲酵母脂肪酶、柱狀假絲酵母脂肪酶；所述的震蕩反應(yīng)的條件優(yōu)選為30～37℃下振蕩10～16小時；石墨相氮化碳納米片與目標酶的質(zhì)量比優(yōu)選為1:0.2～4。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

(1)石墨相氮化碳納米片作為固定化酶載體，比表面積大，與酶結(jié)合率高且能夠?qū)⒚咐喂痰墓潭ㄔ谳d體表面，提高了酶的操作穩(wěn)定性。

(2)石墨相氮化碳納米片表面含有氨基可采用交聯(lián)劑戊二醛通過化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)固定酶，提高了固定化過程的特異性，增強了載體材料與酶之間的穩(wěn)定性。

(3)本發(fā)明首次以石墨相氮化碳納米片作為固定化酶載體材料，采用戊二醛固定酶，最大限度的保留酶的原有形貌及活性，材料成本低，制備簡單，易于產(chǎn)業(yè)化。

附圖說明

圖1是石墨相氮化碳納米片固定化crl酶和游離crl酶的相對酶活與反應(yīng)ph關(guān)系曲線圖。

圖2是石墨相氮化碳納米片固定化crl酶和游離crl酶的相對酶活與反應(yīng)溫度關(guān)系曲線圖。

圖3是石墨相氮化碳納米片固定化crl酶和游離crl酶的熱穩(wěn)定性圖。

圖4是石墨相氮化碳納米片固定化crl酶的重復(fù)使用性曲線圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例。

實施例1

(1)石墨相氮化碳納米片材料的制備：稱取6g二腈二氨(dcda)于50ml氧化鋁坩堝中。將坩堝置于管式爐中，按照2.3℃/min的速度，升溫到550℃，在該溫度下繼續(xù)煅燒4小時，反應(yīng)停止并自然冷卻到室溫，氧化鋁坩堝中的黃色塊狀固體即為石墨相塊狀氮化碳。取出黃色塊狀固體于瑪瑙研缽中研磨成粉末。稱取該黃色粉末3g于50ml瓷坩堝中。將坩堝置于管式爐中，按照5℃/min的速度，升溫到500℃，在該溫度下繼續(xù)煅燒2小時，反應(yīng)停止并自然冷卻到室溫，坩堝中的淺黃色粉末即為石墨相氮化碳納米片材料。

(2)戊二醛活化石墨相氮化碳納米片材料：稱取1.2g石墨相氮化碳納米片，超聲分散于38.76ml質(zhì)量百分含量為6％的戊二醛磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)中，在65℃下振蕩12小時進行活化，活化后的石墨相氮化碳納米片用超純水洗滌并真空抽濾收集。

(3)石墨相氮化碳納米片表面固定化crl酶(c3n4-ns@crl)的制備：稱取3.6g皺褶假絲酵母脂肪酶(crl)溶解于240ml0.1m、ph7.0的磷酸緩沖液中，冷凍離心收集上層酶溶液。將上述活化后的石墨相氮化碳納米片與crl酶溶液混合，37℃下振蕩反應(yīng)12小時；反應(yīng)結(jié)束后用磷酸緩沖液(0.1m，ph7.0)洗滌，固定化crl酶采用高速冷凍離心收集，并保存在4℃冰箱中。

測定所獲得的固定化crl酶(c3n4-ns@crl)及游離crl酶的在不同ph、溫度下的催化活性。酶催化活力是通過p-npp顯色法測定。固定化crl酶和游離crl酶在不同ph下的催化活性測定結(jié)果如圖1所示：相對于游離crl酶，固定化crl酶(c3n4-ns@crl)催化最佳ph向堿性環(huán)境偏移，并且固定化crl酶可以在更寬的ph范圍內(nèi)保持較高的催化活性。固定化crl酶和游離crl酶在不同溫度下的催化活性測定結(jié)果如圖2所示：固定化crl酶(c3n4-ns@crl)在40～80℃下的催化活性均高于游離crl酶，說明固定化crl酶(c3n4-ns@crl)耐高溫能力得到提高。

測定固定化crl酶和游離crl酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖3所示：在50℃下，隨反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)時間為90min時，游離crl酶的相對活性(此條件下的酶活性與初始酶活性的百分比)為20％，c3n4-ns@crl固定化酶的相對活性為64％；此外，當反應(yīng)時間延長到180min時，c3n4-ns@crl固定化酶的相對活性仍能保持在60％。這說明酶固定在本發(fā)明的石墨相氮化碳納米片載體材料上，其熱穩(wěn)定性有大幅度提高。

測定固定化crl酶重復(fù)使用率，測定結(jié)果如圖4所示：25mgc3n4-ns@crl固定化酶在1ml磷酸鹽緩沖溶液(0.1m，ph7.0)和1ml0.5％p-npp乙醇溶液組成的混合溶液中，37℃反應(yīng)5分鐘條件下重復(fù)使用10次后，其相對活性(此條件下的酶活性與首次使用酶活性的百分比)仍能保持為72％。這說明c3n4-ns@crl固定化酶的循環(huán)使用性能得到改善，有利于商品化、產(chǎn)業(yè)化。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。