本發(fā)明屬于活性分子領域，尤其涉及一種提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法。

背景技術：

蝦青素(astaxanthin)是一種具有強抗氧化活性的類胡蘿卜素。蝦青素的化學名稱為3,3’-二羥基-4,4-二酮基-β,β’-胡蘿卜素，分子式為c40h52o4，其具有的長的共軛不飽和雙鍵以及共軛雙鍵末端的α-羥基酮結構，使得其具有更活潑的電子效應，能夠有效清除自由基，具有強的抗氧化作用。

目前投入生產(chǎn)的蝦青素的來源主要有三種，水產(chǎn)廢料，紅發(fā)夫酵母(phaffiarhodozyma)及雨生紅球藻(rangarao,a2010)。相比而言雨生紅球藻有以下優(yōu)點：1.自身可以進行光合作用，不需要額外提供碳源，2.逆境下誘導積累大量類胡羅卜素的方式，不僅賦予了其在逆境脅迫下的強大生存能力也使其成為天然蝦青素含量最高的物種。雨生紅球藻細胞內(nèi)合成的蝦青素是左旋蝦青素，而工業(yè)生產(chǎn)的及其他來源的蝦青素都是三種旋光物的混合物。但同時利用雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素也有一些弊端：如藻生物量積累緩慢，增殖緩慢，容易污染，及需要外界脅迫條件來誘導產(chǎn)生蝦青素。因此國內(nèi)外學者正致力于通過雨生紅球藻培養(yǎng)條件的優(yōu)化、分子改良等方法使雨生紅球藻可以同時獲得蝦青素和生物量的積累。

微藻由于具有生物量大，生長周期短，易培養(yǎng)等優(yōu)點，被視為生產(chǎn)色素，維生素，多不飽和脂肪酸等高附加值產(chǎn)品的重要來源。產(chǎn)類胡蘿卜素的微藻可以在逆境下天然合成包括蝦青素在內(nèi)的大量類胡蘿卜素(最多可占藻干重的4～5％)，雨生紅球藻最高可生產(chǎn)占干重3～5％的蝦青素(jinek,m.,etal.2012)。

雨生紅球藻(haematococcuspluvialis)屬于綠藻門(chlorophyta)、綠藻綱(chlorophyceae)、團藻目(volvoeales)、紅球藻科(haematococceae)、紅球藻屬(haematococcus)。是一種具有雙鞭毛的淡水單細胞綠藻，藻細胞直徑約5～50μm，細胞壁由纖維素層和果膠質(zhì)層等內(nèi)外兩層組成。雨生紅球藻具有三種營養(yǎng)類型，即光合自養(yǎng)(photoautotrophic)、化能異養(yǎng)(heterotrophic)及混合營養(yǎng)(mixtrophic)。有研究證明在光照條件下額外添加醋酸鹽可以有效提高雨生紅球藻的營養(yǎng)水平。雨生紅球藻的生活史呈現(xiàn)多樣性，具有微小細胞(microzooid)，游動細胞(motilemacrozooid)，不動孢子(non-motilepalmelloid)和紅細胞(haematocyst)四種形態(tài)。在弱光、氮磷豐富的環(huán)境中主要以綠色的游動細胞的形式存在，細胞呈前端凸起的橢圓形，原生質(zhì)體和細胞壁間存在較大空間，細胞具兩條頂生、等長、長度約等于體長的鞭毛，細胞大小約20～30μm，這一過程中藻細胞生長旺盛，光合作用強，細胞多呈綠色，細胞內(nèi)主要含有葉綠素a、葉綠素b、葉黃素，僅有少量β-胡蘿卜素；而在不利條件(高光、高溫、高鹽和營養(yǎng)饑餓)下，則以不動孢子(厚壁孢子)形式存在，此時藻細胞呈圓形，失去鞭毛無法游動，細胞直徑10μm～50μm不等，此時細胞內(nèi)含有的主要色素成分是蝦青素和β-胡蘿卜素，藻細胞呈現(xiàn)紅色。傳統(tǒng)觀點認為，累積蝦青素主要在厚壁孢子階段進行。雨生紅球藻的增殖方式為細胞分裂，遭遇不良環(huán)境會轉(zhuǎn)變成厚壁孢子。雨生紅球藻是否營有性生殖目前尚無明確報道。雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的技術仍有待完善，尤其在雨生紅球藻培養(yǎng)、蝦青素積累及提取等方面仍存在微藻生產(chǎn)蝦青素含量低技術難題。

有研究表明，雨生紅球藻在生長階段和蝦青素積累階段，對光照、溫度、無機鹽等生長條件的要求有所不同，低光強、低溫和充足的營養(yǎng)物質(zhì)更加有利于雨生紅球藻的快速生長，而高光、高溫、各種營養(yǎng)物質(zhì)的脅迫則會導致蝦青素的大量積累。因此，目前國內(nèi)外對雨生紅球藻都是用二階段培養(yǎng)法，首先采用最適生長條件實現(xiàn)微藻營養(yǎng)細胞的高密度生長，繼而對其進行脅迫處理，促使營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)楹癖阪咦?，最大程度的提高蝦青素產(chǎn)量。

脅迫條件是雨生紅球藻積累蝦青素的關鍵環(huán)節(jié)，并在很大程度上決定了蝦青素的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前，盡管對光照、溫度等傳統(tǒng)脅迫因子條件參數(shù)已基本確定，但高光等脅迫方式不僅導致細胞大量死亡，同時由于形成厚壁孢子，降低了生物的直接利用率，并使蝦青素的提取成本和難度大為增加。

綜上所述，目前還沒有一種能顯著促提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法和產(chǎn)品，因此尋找一種有效且工藝處理成本低的提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明公開了一種提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法，能顯著促進微藻生產(chǎn)蝦青素，而且該方法效率高，成本低，具有廣泛的工業(yè)應用前景。

本發(fā)明公開了醇類化合物在提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量中的應用。

本發(fā)明還公開了在制備提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的產(chǎn)品中的應用。

在一些實施例中，所述醇類化合物為甲醇、乙醇或丁醇中的一種或多種。

在一些實施例中，所述醇類化合物為甲醇或/和乙醇。

在一些實施例中，所述醇類化合物為乙醇。

在一些實施例中，所述乙醇為無水乙醇。

在一些實施例中，所述微藻為雨生紅球藻、杜氏鹽藻或小球藻中的一種。

在一些實施例中，所述微藻為雨生紅球藻。

其中，雨生紅球藻、杜氏鹽藻或小球藻同屬綠藻，雨生紅球藻、杜氏鹽藻或小球藻均能合成蝦青素，均含有蝦青素合成途徑。在合成蝦青素的微藻中，雨生紅球藻是模式微藻。對于杜氏鹽藻或小球藻來說，對醇類化合物(如乙醇)產(chǎn)生同樣的生理生化反應，因此，醇類化合物能促進雨生紅球藻、杜氏鹽藻或小球藻合成蝦青素。

本發(fā)明還公開了一種提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的促進劑，包括：醇類化合物和微藻培養(yǎng)基。

在一些實施例中，所述微藻培養(yǎng)基為所述微藻的生長需要的培養(yǎng)基。

本發(fā)明提供了一種提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法，包括以下步驟：

1)獲得處于平臺期的微藻，將醇類化合物與平臺期微藻混合處理，得到處理后的微藻；

2)收集處理后的微藻，分離、提取微藻中的蝦青素。

其中，正常生長情況下，處于平臺期的雨生紅球藻，細胞呈圓形，無鞭毛，整個藻細胞呈綠色并充滿原生質(zhì)體，細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)一些儲存有蝦青素的脂質(zhì)油滴。而乙醇處理情況下，處于平臺期的雨生紅球藻整個細胞呈紅色，細胞壁特化，細胞內(nèi)充滿脂質(zhì)油滴。

在一些實施例中，所述醇類化合物為甲醇、乙醇或丁醇中的一種或多種。

在一些實施例中，所述醇類化合物為乙醇。

作為優(yōu)選，所述醇類化合物在平臺期微藻中的體積百分比為0.0999％-0.3984％。

更為優(yōu)選，所述醇類化合物在平臺期微藻中的體積百分比為0.0999％-0.2991％。

最為優(yōu)選，所述醇類化合物在平臺期微藻中的體積百分比為0.1996％。

在一些實施例中，所述平臺期微藻的密度為1×10⁵-2×10⁵個/ml。

在一些實施例中，所述平臺期微藻的密度為1.42×10⁵個/ml。

在一些實施例中，所述微藻為雨生紅球藻、杜氏鹽藻或小球藻中的一種。

在一些實施例中，所述微藻為雨生紅球藻。

在一些實施例中，所述醇類化合物與平臺期微藻的混合處理時間為5～7天。

本發(fā)明的目的針對現(xiàn)有技術還沒有一種能顯著提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法和產(chǎn)品。因此，本發(fā)明意外的發(fā)現(xiàn)醇類化合物在促進微藻合成蝦青素中的應用和醇類化合物在制備促進微藻合成蝦青素產(chǎn)品中的應用，實驗數(shù)據(jù)表明，醇類化合物確實能顯著提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量，與正常培養(yǎng)的微藻中的蝦青素含量相比，醇類化合物處理微藻生產(chǎn)的蝦青素顯著提高，醇類化合物處理組的總蝦青素的含量由干重的0.7％上升至3.85％。結果表明，醇類化合物使得微藻處于脅迫狀態(tài)，乙醇處理后的微藻細胞呈紅色，細胞壁特化，細胞內(nèi)大量充滿脂質(zhì)油滴，說明醇類化合物能促進微藻生產(chǎn)蝦青素。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示雨生紅球藻生長曲線測定結果，其中，橫坐標為時間(單位：天)，縱坐標為細胞密度(單位：10⁴個/ml)；

圖2示不同濃度的乙醇梯度處理雨生紅球藻的蝦青素含量，其中，橫坐標為每50ml雨生紅球藻中乙醇含量，縱坐標為蝦青素相對od值；

圖3示光學顯微鏡下的雨生紅球藻細胞形態(tài)，其中，a為正常生長組，b為乙醇處理組；

圖4示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的透射電鏡分析，其中，a為正常生長組，b為乙醇處理組；

圖5示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的hplc色譜圖，其中，a為正常生長組，b為乙醇處理組；

圖6示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的蝦青素和脂質(zhì)含量變化，其中，control為正常生長組，etoh為乙醇處理組，橫坐標的free-ast為蝦青素，monoester為蝦青素單脂，diester為蝦青素雙脂，縱坐標為在干重中的重量百分比；

圖7示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的葉黃素和類胡蘿卜素含量變化，其中，control為正常生長組，etoh為乙醇處理組，橫坐標的lutein為葉黃素，carotenoid為類胡蘿卜素，縱坐標為在10⁶個細胞的質(zhì)量；

圖8示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的光合作用活性，其中，control為正常生長組，etoh為乙醇處理組，橫坐標為時間(天)，縱坐標為fv/fm比值；

圖9示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的電子傳遞速率，其中，control為正常生長組，etoh為乙醇處理組，橫坐標為時間(單位為天)，縱坐標為電子傳遞速率；

圖10示正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的脂肪酸成分，其中，wt為正常生長組1，wt4為正常生長組4，etoh為乙醇處理組，橫坐標為不同種類的脂肪酸，縱坐標為脂肪酸含量百分比。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量的方法，本發(fā)明的方法能顯著提高微藻生產(chǎn)蝦青素含量，而且該方法效率高，成本低，具有廣泛的工業(yè)應用前景。

下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

其中，以下實施例的試劑均為市售。

實施例1

藻種的培養(yǎng)，具體步驟如下：

雨生紅球藻haematococcuspluvialisccap3601購買自廈門大學海洋藻類研究中心。雨生紅球藻的培養(yǎng)采用液體bbm培養(yǎng)基。雨生紅球藻的培養(yǎng)在恒溫培養(yǎng)箱中進行，溫度為25±1℃，光照強度18.75±2.5μmolm-2s-1，12h/12h光暗周期下靜置培養(yǎng)，每天手動震蕩1～2次。

實施例2

生長曲線的測定，具體步驟如下：

初始接種濃度為1×10⁴個細胞/ml，從接種的第二天開始，連續(xù)22天每天用浮游植物計數(shù)框?qū)θ科叫性鍢拥臐舛冗M行計算，從而測定雨生紅球藻的生長周期，繪制生長曲線。

生長曲線測定的結果如圖1，通過計數(shù)，本實驗中得到的雨生紅球藻的生長曲線如圖所示，初始接種的藻細胞數(shù)目為1×10⁴個細胞/ml，從第二天開始，雨生紅球藻快速生長，到了第16天，微藻生長緩慢，接種的第1～15天為對數(shù)生長期，第16天進入平臺期。

實施例3

不同濃度的乙醇梯度處理雨生紅球藻，具體步驟如下：

將處于平臺期(從10⁴個/ml接種培養(yǎng)到第16天)的雨生紅球藻，分為8組，每組體積為50ml，ctr組為正常培養(yǎng)，5μl組為添加5μl乙醇處理組，10μl組為添加10μl乙醇處理組，20μl組為添加20μl乙醇處理組，50μl組為添加50μl乙醇處理組，100μl組為添加100μl乙醇處理組，150μl組為添加150μl乙醇處理組，200μl組為添加200μl乙醇處理組，分別處理7天，固定乙醇添加量，其他的培養(yǎng)條件不變，測定雨生紅球藻的生物量和蝦青素的含量。蝦青素的相對含量采用檢測od480值的方法測定。

結果如圖2，在480nm的波長處測其od值。結果與正常生長組比較可發(fā)現(xiàn)，低劑量的乙醇(5μl、10μl、20μl)對雨生紅球藻積累蝦青素的影響不大，高劑量的乙醇進行脅迫處理可明顯提高提高蝦青素的積累量。其中，在50ml處于平臺期的雨生紅球藻中邊搖晃瓶身邊緩慢加入100μl的無水乙醇，單位藻細胞內(nèi)蝦青素積累達到最大值。

實施例4

光學顯微鏡下的雨生紅球藻細胞形態(tài)，具體步驟如下：

將處于平臺期(從10⁴個/ml接種培養(yǎng)到第16天，培養(yǎng)條件為在恒溫培養(yǎng)箱中進行，溫度為25±1℃，光照強度18.75±2.5μmolm-2s-1，12h/12h光暗周期下培養(yǎng))的雨生紅球藻，分為兩組，每組體積為50ml，a組為正常生長組，不添加任何物質(zhì)，b組為乙醇處理組，b組中添加100μl乙醇，處理時間為7天，兩組的處理條件為在恒溫培養(yǎng)箱中進行，溫度為25±1℃，光照強度18.75±2.5μmolm-2s-1，12h/12h光暗周期下培養(yǎng)。

將正常生長組和乙醇處理組的雨生紅球藻分別用5％的甲醇固定液固定，吸取10μl至載玻片上，使用普通光學顯微鏡進行鏡檢，物鏡倍數(shù)60×，觀察乙醇處理藻的形態(tài)變化。

結果如圖3所示，正常生長組雨生紅球藻藻液仍為綠色，在培養(yǎng)基中均勻分布，無明顯貼壁生長狀況，藻細胞呈圓形，無鞭毛，藻細胞整體呈綠色，原生質(zhì)體充滿整個細胞，細胞內(nèi)已經(jīng)有存儲有蝦青素的脂質(zhì)油滴出現(xiàn)；乙醇處理組的雨生紅球藻呈紅色，細胞壁特化，細胞內(nèi)充滿大量的脂質(zhì)油滴。

實施例5

正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的透射電鏡分析，具體步驟如下：

取實施例4的a組正常生長組，b組乙醇處理組的雨生紅球藻細胞30ml，在4℃，3000×g條件下分別離心10min收集。去掉上清液后，藻細胞分別用1×pbs緩沖液懸浮清洗3次，5000g離心3min收集藻細胞。溶于ph7.2含有2.5％(v/v)戊二醛及2％(w/v)多聚甲醛濃度為0.1mnah2po4緩沖液中的進行固定，并在4℃條件下用真空泵真空處理30min。5000×g離心1min并去掉上清液，重新加固定液在4℃固定12h。固定完成后，5000×g離心1min去除固定液，并加入ph7.2濃度為0.1m的nah2po4緩沖液清洗4次(15min和30min各2次)。之后樣品用1％(w/v)四氧化鋨在4℃下固定3h，完成后用0.1mnah2po4緩沖液(ph7.2)清洗4次(15min和30min各2次)。完成后用梯度濃度的乙醇(30％，50％，70％，80％，90％v/v)對樣品進行脫水，每隔10min更換一種濃度，最后用100％的乙醇沖洗兩次(每次30min)。之后樣品分別重懸于環(huán)氧丙烷(2次，每次30min)和1:1(v/v)環(huán)氧丙烷：環(huán)氧樹脂(1次，30min)中進行細胞滲透。完成后藻細胞固定于100％w/v環(huán)氧樹脂中，24h，且在70℃中包埋的時間不少于8h。藻細胞完成包埋后利用8800ultratomeiii進行超微切片，并用乙酸雙氧鈾及檸檬酸鉛對切片進行染色。處理后的切片利用tecnai-10透射電子顯微鏡進行觀察。

透射電鏡觀察藻細胞內(nèi)部細胞結構變化如圖4所示，圖4a正常生長組的雨生紅球藻可見明顯的細胞核、葉綠體、蛋白核、細胞壁等結構，葉綠體中具有多層類囊體膜結構，在細胞周邊分散分布。乙醇處理組的雨生紅球藻如圖4b，可見細胞壁增厚，依然可以看到清晰的細胞核結構，但葉綠體減少，細胞中充滿了脂質(zhì)油滴。

實施例6

正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的hplc色譜圖，具體步驟如下：

標準品配制：先分別在干凈的棕色瓶中配制蝦青素、番茄紅素、葉黃素、巖藻黃素和β-胡蘿卜素標準品的母液，保存于-80℃冰箱中備用。分別取8ul標準品母液于新的棕色瓶中，混合均勻，標記好再放入-20℃冰箱待測。

色譜條件：色譜柱為atlantisc18(4.6×250mm)，流動相a相為乙腈：甲醇：去離子水(75:15:5)，b相為甲醇：乙酸乙酯(70:30)，其中甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純。柱溫設置為室溫，進樣量10ul，流速為1ml/min，檢測波長為432nm、442nm、455nm和480nm。

取實施例4的a組正常生長組，b組乙醇處理組的雨生紅球藻進行色譜分析。結果如圖5～圖7可見，乙醇處理組的蝦青素單酯和蝦青素二酯大量積累，乙醇處理組的蝦青素單酯和蝦青素二酯的含量極顯著提高，p<0.01。由峰面積計算各種色素的含量變化，如圖6所示，乙醇處理后總蝦青素(monoester和diester含量總和)的含量由干重的0.7％上升至3.85％，如圖7所示，β胡蘿卜素作為蝦青素的合成前體，含量有極顯著下降，p<0.01，而葉黃素水平保持穩(wěn)定。

實施例7

取實施例4的a組正常生長組，b組乙醇處理組的雨生紅球藻測定其光合作用效率和電子傳遞速率。

結果如圖9可見，乙醇處理組的雨生紅球藻的光合作用效率和電子傳遞速率隨處理時間延長而顯著下降，表明乙醇處理讓雨生紅球藻處于脅迫狀態(tài)，在受到外界脅迫作用時光合作用效率會下降。

實施例8

雨生紅球藻脂肪酸成分分析，具體步驟如下：

取平臺期(從10⁴個/ml接種培養(yǎng)到第16天)的雨生紅球藻，分成3組，每組為50ml，wt組為3瓶，wt4組為3瓶，etoh組為3瓶。

根據(jù)yang等人的方法(ffectofanintroducedphytoenesynthasegeneexpressiononcarotenoidbiosynthesisinthemarinediatomphaeodactylumtricornutummar.drugs2015,13,5334-5357)進行脂質(zhì)的提取，使用氣相色譜-質(zhì)譜進行分析。4400rpm離心10min收集藻細胞，采用凍干儀器凍干藻，并稱其干重，向干燥好的藻細胞加入koh-ch3oh，超聲波破碎，上清與hcl-ch3oh混勻后75℃反應10min后液體分層，用正己烷萃取，加入c19內(nèi)標，由氮吹儀吹干。用于脂肪酸干重和組分的分析。

正常生長和乙醇處理雨生紅球藻的脂肪酸成分如圖10所示。wt組的脂肪酸含量從高到低依次是c16：0，c18：2和c18：3，隨著生長時間延長，四天之后的wt4組雨生紅球藻脂肪酸組成差異不大，但c18：2有所降低而c18：3有所升高。乙醇處理后的etoh組主要脂肪酸發(fā)生了變化，含量由高到低依次為c16:0，c18:0和c18:1，etoh組的c16:0，c18:0和c18:1均有極顯著提高，p<0.01，而這一結果與蝦青素酯中的脂肪酸的主要成分一致。乙醇處理后的etoh組飽和脂肪酸(sfa)中除c18:0顯著上升外，其余種類變化不顯著。乙醇處理后的etoh組單不飽和脂肪酸(mufa)都有不同程度的顯著增長，而多不飽和脂肪酸(pufa)都呈下降趨勢。

綜上所述，以上實施例的實驗數(shù)據(jù)表明，醇類化合物確實能顯著促進微藻生產(chǎn)蝦青素，與正常培養(yǎng)的微藻中的蝦青素含量相比，醇類化合物處理微藻生產(chǎn)的蝦青素顯著提高，醇類化合物處理組的總蝦青素的含量由干重的0.7％上升至3.85％。結果表明，醇類化合物使得微藻處于脅迫狀態(tài)，乙醇處理后的微藻細胞呈紅色，細胞壁特化，細胞內(nèi)大量充滿脂質(zhì)油滴，說明醇類化合物能促進微藻生產(chǎn)蝦青素。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。