本申請是分案申請，其母案的中國申請?zhí)柺?01180048224.4，國際申請?zhí)柺莗ct/ep2011/067372，申請日是2011年10月5日。本發(fā)明涉及一種通過連續(xù)灌流培養(yǎng)懸浮中的細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)止血蛋白的方法，所述細胞培養(yǎng)物向所述培養(yǎng)物懸液中表達所述止血蛋白，其中所述細胞培養(yǎng)物流經(jīng)過濾組件，所述過濾組件通向收獲孔，所述過濾組件具有允許止血蛋白得以通過的0.1-2.9μm的篩目大小，其中所述流經(jīng)該過濾組件的流動為交替式切向流。本發(fā)明還涉及通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的蛋白質。
背景技術：
：止血蛋白是凝血級聯(lián)的組分。如果缺乏任何一種止血蛋白，輕則會引發(fā)健康并發(fā)癥（healthcomplications），重則患上危及生命的疾病。止血蛋白缺乏癥起初是通過補充動物源性的止血蛋白來治療的。典型地，已通過連續(xù)灌流發(fā)酵法或者反復分批發(fā)酵法生產(chǎn)重組止血蛋白。這些發(fā)酵方法提供高質量的產(chǎn)物。然而，對于提供在不降低質量標準的情況下產(chǎn)生較高量的產(chǎn)物的方法，仍存在著持續(xù)的需求。本發(fā)明提供了這樣的方法。技術實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種通過連續(xù)灌流培養(yǎng)懸浮中的細胞培養(yǎng)物生產(chǎn)止血蛋白的方法，所述細胞培養(yǎng)物向所述培養(yǎng)物懸液中表達所述止血蛋白，所述細胞培養(yǎng)物流經(jīng)過濾組件，所述過濾組件通向收獲孔，所述過濾組件具有允許止血蛋白得以通過的0.1-2.9μm的篩目大小，并且其中所述流經(jīng)該過濾組件的流動為交替式切向流。包含于所述過濾組件內(nèi)的篩目的大小允許止血蛋白通過所述過濾組件，但不允許細胞或細胞碎片通過。與先前使用的方法相比，本發(fā)明的第一方面的方法允許在顯著更高的滴度下生產(chǎn)高質量的止血蛋白。此外，從實驗室規(guī)模發(fā)酵（5l左右）到大規(guī)模發(fā)酵（至少500l）均獲得在不損害生長、生產(chǎn)力和產(chǎn)物質量的情況下的更高滴度的優(yōu)勢。本發(fā)明使得能夠在不損害產(chǎn)物質量的情況下產(chǎn)生數(shù)量高達現(xiàn)有技術方法的10倍的所需蛋白。本發(fā)明使得能夠對工藝參數(shù)實施仔細控制，使得方法能夠在某一細胞密度下運行，以便在生物反應器的物理特性內(nèi)的高濃度下提供高質量產(chǎn)物。附圖說明圖1：在實驗室規(guī)模和中試工廠規(guī)模(大于500l)下關于因子ix的活細胞濃度和存活率，使用用泄放（bleed）進行的atf。圖2：在用于因子ix的先前方法（“半連續(xù)方法”）與atf方法之間的大規(guī)模（大于500l）產(chǎn)量比較(在相對比例尺上)。圖3：實驗室規(guī)模下關于因子ix細胞系的活細胞濃度和存活率，使用在沒有泄放下進行的atf。圖4：實驗室規(guī)模下，使用atf的關于因子viii的活細胞濃度和存活率。圖5：實驗室規(guī)模下，使用atf的關于因子vii的活細胞濃度和存活率。具體實施方式本發(fā)明的方法中，止血蛋白優(yōu)選為因子vii(fvii)、因子viii(fviii)或因子ix(fix)之一。本領域存在數(shù)量眾多的描述諸如fvii、fviii或fix等止血蛋白的生產(chǎn)的文獻。細胞系、細胞培養(yǎng)和蛋白生產(chǎn)技術為公知的并描述于如下文獻中：例如，關于fvii的us2006/0166915和wo2004/000366，關于fvii和fix的us2009/0130060和wo2006/018204，關于fix的wo2009/130198和us4,770999，以及關于fviii的us20100120094、wo97/43436、wo88/08035、wo87/04187、wo90/02175、us20050227913和ep1707634。所有這些文獻均通過引用結合并描述止血蛋白生產(chǎn)的公知原理，所述生產(chǎn)的方法步驟可依據(jù)本發(fā)明使用。為了根據(jù)本發(fā)明重組地生產(chǎn)蛋白，使用在培養(yǎng)時表達該蛋白(在適當條件下)的細胞系。這樣的細胞系（含有編碼止血蛋白例如fvii、fviii或fix的重組核酸）是本領域已知的，例如幼倉鼠腎細胞（bhk）、包括無限增殖化人細胞（如per.c6細胞）在內(nèi)的人細胞、大鼠細胞和小鼠細胞。根據(jù)本發(fā)明，所述細胞培養(yǎng)物優(yōu)選是中國倉鼠卵巢（cho）細胞系的培養(yǎng)物，該細胞系在培養(yǎng)中表達目的止血蛋白。更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)物是cho-ki細胞系。所述細胞培養(yǎng)物以懸液存在?？捎糜谒雠囵B(yǎng)物和目的蛋白重組生產(chǎn)的培養(yǎng)基的例子是公知的。合適的例子可以在包括上述專利文獻在內(nèi)的現(xiàn)有技術和本申請文件的實施例部分中找到。本發(fā)明是一種連續(xù)灌流培養(yǎng)細胞的方法。術語“灌流培養(yǎng)細胞的方法”具有本領域的常規(guī)意義，意指：培養(yǎng)過程中，細胞通過分離裝置得以保留；存在具有比分離前低的細胞密度的液體（自培養(yǎng)物）流出，并且存在細胞培養(yǎng)基流入（至培養(yǎng)物）。本發(fā)明涉及所需蛋白的生產(chǎn)。自所述方法收獲的澄清液體具有與所述細胞培養(yǎng)物處于相同范圍的所需蛋白的濃度。本發(fā)明中，優(yōu)選至少一種細胞培養(yǎng)基組分是連續(xù)加入的。培養(yǎng)基的其它組分可以連續(xù)、半連續(xù)或以其他方式加入。本發(fā)明的分離裝置是過濾組件。該過濾組件優(yōu)選是管狀膜形式的中空纖維過濾器。這樣的過濾器/膜在本領域是普遍已知的，可以從例如generalelectric（其前身是amersham）得到。選擇所述過濾器使得篩目大小為0.1到2.9微米。這是本發(fā)明的一個顯著特征，因為選擇該篩目大小以盡可能地防止細胞碎片通過過濾器。本發(fā)明優(yōu)選使用的過濾器包括由ps（聚砜）或者pes（聚醚砜）制得的過濾器。自早至2000年以來，交替式切向流（atf）一直有被述及。atf系統(tǒng)通常由隔膜和過濾器（如上所述）組成，該過濾器可與任何類型的生物反應器（不銹鋼、玻璃、一次性使用的生物反應器等等）連接。通過改變過濾器的孔徑大小，所生產(chǎn)的產(chǎn)物可在生物反應器中濃縮，或連續(xù)移出。atf意味著所述過濾組件處有交替式切向流出現(xiàn)，也就是說，存在一種與過濾組件的膜表面處于同一方向（即與其相切）的流動，并且存在另一種處于與所述過濾器表面基本垂直的方向的流動。切向流可以通過本領域已知的方法獲得，例如美國專利第6,544,424中記載的方法，該專利的內(nèi)容通過引用結合。優(yōu)選的生物反應器為經(jīng)典的攪拌式生物反應器，該反應器設置有泄放孔（bleedport）、atf孔（收獲孔）、培養(yǎng)基孔、底孔、氣孔和用于其它添加物的附加孔。先前未曾想到可在方法中使用atf以生產(chǎn)具有與在其它方法中生產(chǎn)時類似的質量（質量如例如gla分布或活化型或二醇分布(glycol-profile)或重鏈）的止血蛋白，而使用其它方法生產(chǎn)的材料具有顯著較低的產(chǎn)量，例如日產(chǎn)量水平或體積產(chǎn)量水平或者主體產(chǎn)物濃度（bulkproductconcentration）。系統(tǒng)的參數(shù)通常是本領域描述的那些參數(shù)。細胞培養(yǎng)基的ph、溫度、溶解氧濃度和摩爾滲透壓濃度原則上并不關鍵，并且取決于所選的細胞和正在生產(chǎn)的產(chǎn)物?？筛淖儏?shù)以使產(chǎn)物質量和數(shù)量最大化。通常需要平衡。按照本發(fā)明，灌流率優(yōu)選為每天0.7至10倍體積，更優(yōu)選每天0.9至4倍體積。該方法可經(jīng)“泄放”以移出未經(jīng)過濾的細胞培養(yǎng)物懸液，以便平衡正被收獲的液體的體積和正被添加至培養(yǎng)物的液體體積。該泄放率可變化。未經(jīng)過濾的液體優(yōu)選以每天0-0.2倍體積（該方法的總體積）的速率從該方法中移出。未經(jīng)過濾的細胞培養(yǎng)物懸液可從該方法中連續(xù)移出（連續(xù)泄放）?；蛘?，未經(jīng)過濾的細胞培養(yǎng)物懸液可從該方法中不連續(xù)地移出（脈沖泄放）。對于因子ix而言，優(yōu)選的泄放率是每天0.01-0.2倍體積（該方法的總體積）。該泄放在生產(chǎn)階段期間應用以保持高細胞存活率，如例如高于80%。所需的止血蛋白經(jīng)由收獲孔從所述系統(tǒng)中收獲。其最優(yōu)選在下游處理中進行純化。可組合數(shù)個下游處理步驟。本發(fā)明蛋白的典型下游處理在本領域已有描述，例如包括上面所提到的專利文獻在內(nèi)的現(xiàn)有技術。本發(fā)明的方法中，流經(jīng)過濾組件的液體含有所需蛋白，該蛋白通過流過過濾器與懸液培養(yǎng)物中的細胞和細胞碎片分離。該液體為澄清的經(jīng)過濾的懸液，其含有所產(chǎn)生的止血蛋白。所述經(jīng)過濾的懸液優(yōu)選以每天0.7-10倍體積（該方法的總體積）、優(yōu)選每天0.7-1.0倍體積或0.8-1.4倍體積或1.0-1.2倍體積的速率收獲。該方法的生產(chǎn)力在一定程度上取決于該方法的參數(shù)，并且在其它方面取決于表達止血蛋白的細胞克隆。本發(fā)明的益處為與使用同一細胞克隆的非atf方法中的產(chǎn)量相比更高的產(chǎn)量。在該方法的起始和該方法期間的細胞存活率應該大于80%，優(yōu)選大于90%。該方法期間應該測量細胞存活率，并且若細胞存活率降至低于所需水平的話，則調整所有培養(yǎng)物中的條件。細胞密度可以有所不同。合適接種物為在3-6x105個細胞/ml的范圍內(nèi)的。培養(yǎng)物中的靶細胞密度低于80x106個細胞/ml。更高的細胞密度產(chǎn)生較低的產(chǎn)物數(shù)量和/或質量。在fix的一個優(yōu)選的實施方案中，培養(yǎng)物中的細胞密度低于8x106個細胞/ml。懸液溫度優(yōu)選保持在35.5-37.5℃左右，最優(yōu)選36.5℃左右。懸液ph優(yōu)選保持在6,95±0,45左右。懸液中的溶解氧濃度是重要的。優(yōu)選其為20%至120%左右，優(yōu)選30%至70%左右，優(yōu)選45%至55%左右，優(yōu)選50%左右。可通過任何方式實現(xiàn)通風。典型且優(yōu)選的方式包括通過噴霧器的通風，其使用空氣和氧氣的混合物(優(yōu)選100%氧氣)，同時在頂部空間具有恒定的氣流。特別地，本發(fā)明涉及一種如權利要求1所述的方法，用于生產(chǎn)因子vii或因子viii或因子ix蛋白。本發(fā)明的第二方面提供通過本發(fā)明第一方面的方法生產(chǎn)的fvii、fviii或者fix蛋白。第一方面的所有優(yōu)選特征同樣適用于第二方面。由于止血蛋白在本領域是已知的，可依照該蛋白的標準去測量該蛋白的質量。fvii和fix質量的測量通常涉及gla分布（gla10-12）。fviii質量的測量通常涉及組合的輕鏈和重鏈(heavyclaim)。實施例實施例1實施例1描述了使用本發(fā)明的方法在5l生物反應器（實驗室規(guī)模）中于atf灌流裝置中進行的因子ix蛋白培養(yǎng)。使用atf灌流裝置進行了培養(yǎng)。該培養(yǎng)導致產(chǎn)生穩(wěn)定的細胞密度、存活率和產(chǎn)物產(chǎn)量。泄放范圍為0-20%。至于產(chǎn)物的質量，在方法中活化fix（“fixa”）保持穩(wěn)定和低水平。隨著fix濃度升高，關于gla11&12的gla分布(fix的富含谷氨酸的γ-羧基谷氨酸結構域)輕微地從90-95%降至80-85%。在不損害產(chǎn)物質量的情況下，所達到的fix產(chǎn)量是所使用的現(xiàn)有技術（非atf）方法的10倍左右。品系詳情細胞類型為表達fix的cho-k1品系。培養(yǎng)基：所用的培養(yǎng)基為支持細胞和產(chǎn)物的生長和產(chǎn)出的商業(yè)培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基通常補充有胰島素、維生素k1、谷氨酰胺和葡萄糖。方法概述遵循用于fix培養(yǎng)的方法以建立本發(fā)明的atf方法。該方法包括解凍細胞庫小瓶并將細胞轉移至具有低攪動(＜30rpm)的t-瓶或搖瓶中。細胞擴繁在搖瓶中進行直到產(chǎn)生足夠的細胞以便接種5l生物反應器。在所有方法步驟，細胞均在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。生物反應器中，以分批方式進行培養(yǎng)達頭2-3天。當滿足開始灌流、脈沖和收獲的標準時，連續(xù)供應培養(yǎng)基。通過推注（bolus）或連續(xù)加入谷氨酰胺和葡萄糖(如果需要的話)。將收獲物通過離心和/或過濾gmo凈化，并轉移至初級回收。生物反應器參數(shù)-5lbiostatbplus的準備與測試ph電極用4.0和7.4緩沖液校準，并用7.0緩沖液校驗，然后裝配罐。將罐用pbs(9.6g/l)殺菌，隨后將其用培養(yǎng)基更換。在pbs溶液中用氮氣(0%)和空氣(100%)對氧電極進行校準。最終將ph電極重新校準至外部ph測量結果。將罐、管道系統(tǒng)和過濾器針對滲漏進行檢查。方法操作條件根據(jù)下表1中的規(guī)定調整方法參數(shù)的設定值。表1：5lbiostatbplus的方法操作條件參數(shù)單位設定值溫度℃34-38）ph6.7-7.5dot（溶解氧張力）空氣飽和%10-90攪拌速度rpm100-150工作體積l4堿（用于ph控制的碳酸鈉）m1-3co2(頂部空間)na視需要而定氧氣或空氣或混合物(噴射)%0-100%接種接種細胞的濃度靶定在3-6x105個細胞/ml的范圍內(nèi)。接種后，連接堿長達2天。生長期當細胞濃度達到實驗生長期時，開始灌流和泄放。泄放率/收獲率之比為10/90(%)。培養(yǎng)過程中每天更換收獲瓶。當細胞濃度高于細胞濃度靶標（6x106個細胞/ml）時，立即應用脈沖泄放策略。取決于細胞的濃度，脈沖泄放大小為生物反應器的工作體積的0-20%。將收獲率保持恒定并每日檢查。收獲將細胞培養(yǎng)物自罐收獲至藍蓋瓶中。將培養(yǎng)物用0.22μm的過濾器過濾除菌。將約1l的收獲物轉移至無菌袋中并冷凍。結果細胞濃度保持穩(wěn)定在約7-8x106個細胞/ml。培養(yǎng)中存活率保持在約85%和90%。其導致產(chǎn)生約0.07%的fixa含量。至于gla分布，gla-11和gla-12保持高于80%。在連續(xù)泄放中仍獲得高生產(chǎn)力和穩(wěn)定產(chǎn)物。實施例2實施例2描述了使用本發(fā)明的方法在atf灌流裝置中大規(guī)模（大于500l）進行的因子ix蛋白培養(yǎng)。大規(guī)模的方法(實施例2)使用與上文在實施例1中描述的相同的品系、培養(yǎng)基和一般方法步驟進行。對于方法參數(shù)(即生物反應器參數(shù)、操作條件等)而言，它們亦與上文在實施例1中所描述的相似。表2：實驗室規(guī)模和大規(guī)模下，先前方法（“半連續(xù)方法”）和atf方法的關于因子ix的產(chǎn)物質量數(shù)據(jù)。生物反應器方法gla11+12（%）fixa（%）實驗室規(guī)模半連續(xù)方法90~0.03大規(guī)模（大于500l）半連續(xù)方法90-930.02-0.06實驗室規(guī)模atf80-900.06-0.13大規(guī)模（大于500l）atf87-960.02-0.15結果表2表明與先前方法（“半連續(xù)方法”）相比，使用atf方法保持了所產(chǎn)生的因子ix的質量。然而，atf方法產(chǎn)生高得多的量/產(chǎn)量（如圖2所示）。當前第1頁12