本發(fā)明屬于食源性生物活性肽開發(fā)技術領域，具體涉及以牛乳或者酪蛋白為原料制備具有降血壓及抗血栓活性多肽的制備方法。
背景技術：
由于現(xiàn)代人們工作壓力大、生活節(jié)奏快，以及睡眠不足、過度飲食、嗜煙和酗酒等不良的生活習慣的影響，心腦血管疾病中的血栓性疾病現(xiàn)已成為人類的頭號殺手，目前，心血管疾病在歐洲每年造成幾百萬人過早死亡，在我國心血管疾病流行趨勢越發(fā)顯著。據(jù)調查，我國心血管疾病患病率男性為1.78%，女性1.10%，且患病率隨年齡升高而增加，我國每年有近350萬人死于心血管疾病，占總死亡人數(shù)的41%以上。
目前血栓性疾病屬于主要危害我國居民生活健康的心腦血管疾病之一，而高血壓是心血管疾病的一個主要誘因。用來治療血栓的藥物主要有肝素、華法林等，雖效果較好但是都存在一定的副作用，如血小板減少和引起出血等。同樣，用于治療高血壓的藥物主要為ace抑制劑（acei）類藥物，如依那普利、卡托普利、賴諾普利等，雖可以有效地抑制ace的活性，降低血壓，但是有明顯的副作用，長期服用會導致降壓過度、泌尿系統(tǒng)病變、咳嗽、味覺失真及血管神經性水腫等副作用。認識到這些藥物的缺點，人們開始研究開發(fā)更安全健康的降血壓、抗血栓藥物。在這種背景下，生物活性肽由于其吸收性好、安全性高的特性引起了廣大研究者的關注。目前，已經有研究報道了某些肽類化合物可顯著抑制血管緊張素轉換酶或者凝血酶活性，具有顯著的降血壓及抗血栓活性。按活性肽的來源不同可將其分為非食源性肽和食源性肽兩大類，其中非食源性抗凝肽已有較長的研究歷史，而食源性抗凝肽的研究近年來才引起廣泛的關注。
目前，從預防的角度來說，抑制相關生理系統(tǒng)關鍵酶或者關鍵因子的活性是開發(fā)降血壓及抗血栓產品的主要切入點，是公認的較為理想的選擇。對于降血壓及抗血栓活性產物來說公認的最關鍵作用靶點分子分別是血管緊張素轉換酶及凝血酶。
血管緊張素轉換酶是含有zn2+的金屬肽酶，zn2+結合位點是血管緊張素轉換酶催化反應的活性基團所在部位。血管緊張素轉換酶抑制肽(降血壓肽)能與血管緊張素轉換酶活性部位的zn2+結合使之失活，從而阻礙血管緊張素轉換酶催化水解血管緊張素ⅰ成為血管緊張素ⅱ,以及催化水解舒緩激肽成為失活片段的兩種生化反應過程,起到降血壓的作用。從最初1965年ferreira等從美洲茅頭蝮蛇的蛇毒中發(fā)現(xiàn)第一個降血壓肽到后期以牛奶蛋白、小麥胚芽蛋白、豬血紅蛋白、魚蛋白、米渣蛋白、芝麻蛋白等為原料采用體外酶解、生物酶解、體內消化等方式獲得超過千種降血壓肽。
水蛭素是較早被研究的可以抑制凝血酶活性的多肽，水蛭素與凝血酶分子表面上堿性氨基酸組成的纖維蛋白原識別位點結合，使凝血酶構型發(fā)生輕微改變，進而水蛭素與凝血酶的酶活性中心結合，從而抑制凝血酶的催化活性，阻止凝血酶和纖維蛋白原相互作用。采采蠅凝血酶抑制劑tti是從采采蠅的唾液腺提取物中分離得到的，比較n–端氨基酸順序發(fā)現(xiàn)其與己經鑒定的絲氨酸蛋白酶抑制劑及其他天然抗凝劑無同源性。壁虱抗凝肽tap是由60個氨基酸組成的單鏈酸性肽，可以與凝血酶的催化位點結合，分子結構與水蛭素類似，其通過與xa因子結合，從而阻止凝血激酶復合物的形成，以抑制凝血酶原的激活。線蟲抗凝肽是一系列小分子多肽，通過與凝血因子活性位點結合，來抑制凝血原酶或凝血酶合成。比伐盧定是一種合成的凝血酶抑制劑，屬于水蛭素衍生出的小分子多肽。比伐盧定同凝血酶結合形成1:1復合物，直接抑制凝血酶活性，從而起到抗凝作用，但其抑制凝血酶活性的持續(xù)時間較短。美拉加群是一種纖維蛋白二肽類似物，其抗凝機制是與凝血酶活性位點結合，可以競爭性直接抑制凝血酶。目前已報道的各類具有抗凝血功能的活性肽，有些本身是動物唾液或毒液的有效成分，盡管抗凝效果良好，但同時也可能具有強烈的副作用，存在安全隱患；有些抗凝血肽在天然生物體內含量極少，分離和純化成本高，所以大多數(shù)多肽難以規(guī)?；a；還有的抗凝血肽活性周期短、有的不能口服等。這些弊端促使研究者們極力開發(fā)食源性的抗凝血肽，而且這些抗凝血物質的開發(fā)都是從臨床藥物的角度進行的。對于血栓的早期預防，從功能性食品組分的角度入手是較為理想的手段。
多數(shù)食物蛋白質中都存在生物活性肽序列，通過酶解作用可將食物蛋白序列中的肽釋放出來，得到多種具有生物功能或生理效應的活性肽。食源性抗凝血活性肽是指以天然動物或植物蛋白為前體物質，直接提取或進行再加工獲得的具有相關生物活性的多肽。相關應用基礎研究和產品開發(fā)凸顯出重要意義。
近年來，從不同食物蛋白中尋找具有降血壓、抗凝血功能蛋白水解物的研究逐漸受到關注。rafik等以烏賊肌肉為原料，用多種蛋白酶水解，利用葡聚糖凝膠層析法和反相高效液相色譜法分離得到3種具有降血壓活性的多肽，經鑒定，ace抑制活性最強的是met-ala-trp，ic50為16.32μmol/l。tsai等以文蛤肉為原料，用復合蛋白酶水解，得到具有ace抑制活性的二肽，氨基酸序列為tyr-asn，其ic50為51μmol/l。shimizu等利用木瓜蛋白酶(papain)水解豬肉，分離得到的肽組分對大鼠給藥后顯示較好的抗血栓活性。楊萬根等利用alcalase2.4l和proteasen水解蛋清蛋白，得到了具有抗凝血活性的水解產物。rajapakse等從魚肉蛋白酶解物中獲得了具有抗凝血和抑制血小板聚集的單鏈單體蛋白。聶毅磊等使用胰蛋白酶水解明膠，發(fā)現(xiàn)明膠水解物的抗凝效果顯著。還有研究發(fā)現(xiàn)來源自k–酪蛋白的抗血栓活性肽能夠減少凝血酶引起的血小板聚合，并呈顯著的量效關系。但這些研究水解過程的控制具有一定的盲目性，而且大都停留在實驗室階段，這是此類產品開發(fā)中的技術瓶頸。
目前采用各種方式獲得的兼具降血壓及抗血栓活性的多肽鮮有報道，僅有2012年rojas–ronquillo等通過發(fā)酵牛乳酪蛋白從β-酪蛋白中鑒定出兼具降血壓及抗血栓活性的17肽yqepvlgpvrgpfpiiv（aa192-209）。酶解法制備活性多肽是利用蛋白酶水解蛋白的特定氨基酸位點，從而得到具有生物活性的多肽。該方法操作相對簡單、生產條件溫和、產品安全性高，是獲得食品級生物活性肽的常用方法。我國牛乳資源豐富，酪蛋白是多種生物活性肽的良好來源，因此將酪蛋白為原料開發(fā)鑒定兼具降血壓及抗血栓活性肽具有積極重要的意義。采用酶法水解制備凝血酶抑制肽正日益受到國內外學者的重視，將其進一步開發(fā)作為功能性食品配料用于預防心腦血管疾病，具有廣闊的市場前景。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是解決酪蛋白多種功能活性肽開發(fā)利用中存在的技術問題，本發(fā)明提供了一種制備同時具有降血壓及抗血栓活性肽的制備方法。本發(fā)明對于牛乳多功能保健食品及藥品的開發(fā)及利用具有重要意義。
本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：制備方法步驟如下：
一、將酪蛋白溶于ph為7.0～8.0的水溶液中，加熱至50～90℃處理5～10min，冷卻至室溫后得到酪蛋白溶液；
二、將步驟一樣品冷卻至室溫后調節(jié)體系的ph，然后加入蛋白酶進行水解反應，滅酶處理后得到酶解溶液；
三、對酶解溶液進行離心處理，收集上清液，然后采用截留分子量1k～10kda的膜進行超濾過濾，得到過濾后的酶解溶液；
四、將過濾后的酶解溶液在50～75℃、15～30mpa的條件下進行均質處理，得到均質后的酶解溶液；
五、將均質后的酶解溶液采用反滲透的方式進行脫鹽處理，經殺菌、干燥后得到分子量低于5000的多肽質量百分含量占40%～80%的降血壓及抗血栓活性多肽。
六、采用分子垂釣等方式，獲得目標序列的多肽；
1、采用分子垂釣的方式篩選在酶解混合物中，究竟是哪個肽與凝血酶進行相互作用分析。采用生物膜干涉技術（bli）進行分析。該方法的原理是，一束可見光穿過光纖，在傳感器末端的光學膜層的兩個界面會形成兩束反射光譜，疊加形成一束干涉光譜，分子結合導致膜層厚度變化，并通過干涉光譜的位移值而體現(xiàn)。
2、將凝血酶固定到“通用型傳感器”如streptavidin(sa)、superstreptavidin(ssa)、highprecisionstreptavidin(sax)、aminereactive2ndgeneration(ar2g)、aminopropylsilane(aps)；或者“捕獲型”傳感器如anti-penta-his(his)、ni-nta(his)、anti-gst等傳感器上。
3、采用吸附緩沖溶液對傳感器進行洗脫，將未結合或結合不牢固的凝血酶洗脫下來。
4、將酶解得到的多肽混合物濃度控制在1～1000ug/ml，并以一個合適的流速流過傳感器表面。
5、采用緩沖溶液對傳感器進行洗脫，將未結合或結合不牢固的多肽洗脫下來。
6、采用脫附緩沖溶液對結合在傳感器的多肽進行洗脫，收集各組分進行uplc-q-tof-ms的檢測，確定與凝血酶親和力強大的多個活性肽的氨基酸序列asn-met-ala-ile-asn-pro-ser-lys-glu-asn-leu-cys-ser-thr-phe-cys-lys。
7、上述篩選出的多肽再根據(jù)分子對接的活性大小，綜合判定，最終篩選出符合要求的多肽。
七、采用固相合成的方式得到多肽產品。
進一步地，當步驟2）所述的蛋白酶為胰蛋白酶時，使用堿性調節(jié)劑調節(jié)酪蛋白溶液體系的ph至7.0～8.5，然后在45～65℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g胰蛋白酶進行水解反應5～180min。
進一步地，當步驟2）所述的蛋白酶為菠蘿蛋白酶蛋白酶時，水解反應過程是用堿性調節(jié)劑調節(jié)體系的ph至6.0～8.0，在50～60℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g菠蘿蛋白酶進行水解5～180min。
進一步地，當步驟2）所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶時，水解反應過程是用堿性調節(jié)劑調節(jié)體系的ph至5～7，在50～65℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g木瓜蛋白酶進行水解反應5～240min。
本發(fā)明所述的具有降血壓及抗凝血活性的生物活性肽的制備方法，以牛乳或者酪蛋白為原料，選取合適的蛋白酶，在一定條件下酶解制備酪蛋白降血壓及抗凝血活性肽粗產品，然后采用膜技術進行濃縮，采用反滲透的方式進行脫鹽，并采用真空冷凍干燥技術或者低溫噴霧干燥技術，最終制備得到降血壓及抗血栓肽。
本發(fā)明的有益效果為：1、以酪蛋白為原料開發(fā)具有降血壓及抗凝血活性肽段，目前并未見相關專利文獻；經過鑒定，根據(jù)本發(fā)明所述酶解制備方法制備的具降血壓及抗血栓活性肽不同于目前報道的同類產品。該肽血管緊張素轉換酶抑制率及凝血酶抑制肽的抑制率較高，該1mg抗血栓肽干粉的凝血酶抑制率分別為30～80%及70～98%。2、采用牛乳或者酪蛋白為原料開發(fā)生物活性肽，原料非常豐富，價格低廉，可滿足大規(guī)模工業(yè)化生產。對于牛乳產品多樣化，酪蛋白生物活性肽在功能性食品、保健食品或者藥品中的開發(fā)利用具有重要的意義。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步解釋說明。
實施例一
本實施方式所述的具有降血壓及抗血栓活性多肽的氨基酸序列為asn-met-ala-ile-asn-pro-ser-lys-glu-asn-leu-cys-ser-thr-phe-cys-lys。
本發(fā)明降血壓及抗血栓的活性肽酶解制備方法按下列步驟實施：
一、將酪蛋白溶于ph為7.0～8.0的水溶液中，加熱至50～90℃處理5～10min，冷卻至室溫后得到酪蛋白溶液；
二、將步驟一樣品冷卻至室溫后調節(jié)體系的ph，然后加入蛋白酶進行水解反應，滅酶處理后得到酶解溶液；
三、對酶解溶液進行離心處理，收集上清液，然后采用截留分子量1k～10kda的膜進行超濾過濾，得到過濾后的酶解溶液；
四、將過濾后的酶解溶液在50～75℃、15～30mpa的條件下進行均質處理，得到均質后的酶解溶液；
五、將均質后的酶解溶液采用反滲透的方式進行脫鹽處理，經殺菌、干燥后得到分子量低于5000的多肽質量百分含量占40%～80%的降血壓及抗血栓活性多肽。
六、肽的固相合成：
1合成順序：從序列c端到n端，步驟如下：a.稱取n當量樹脂放入反應器，加入dcm(二氯甲烷)溶脹半小時，然后抽掉dcm，加入序列中第一個氨基酸2n當量，加2n當量的diea，適量的dmf，dcm，diea（二異丙基乙胺）、dmf（二甲基甲酰胺）、dcm，氮氣鼓泡反應60min。然后加入約5n當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用dmf、meoh洗凈；b.往反應器中加入序列中第二個氨基酸（也為2n當量），2n當量hbtu（1－羥基,苯并,三氯唑四甲基六氟磷酸鹽）及diea，n2鼓泡反應半小時，洗掉液體，茚三酮檢測，然后用吡啶和乙酸酐封端。最后洗凈，加入適量的脫帽液去除fmoc（9-芴甲氧羰基）保護基，洗凈，茚三酮檢測；c.依步驟b的方式依次加入序列中不同的氨基酸并進行各種修飾；d.將樹脂用氮氣吹干后從反應柱中取下，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量（切割液和樹脂大約以10ml/克的比例）的切割液（組成是95%tfa，2%乙二硫醇，2%三異丙基硅烷，1%水），震蕩，濾掉樹脂；e.得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗即可得到序列的粗產物；2多肽純化：開發(fā)新工藝用高效液相色譜將粗品提純至要求純度。3多肽凍干：純化好的液體放入凍干機中進行濃縮，凍干成白色粉末。
本實施例的步驟一中的酪蛋白可以是牛奶為原料通過調酸沉淀的方式得到酪蛋白，也可以用商品化的酪蛋白或者酪蛋白酸鈉產品。步驟一中ph為7.0～8.0的水溶液，是指氫氧化鈉的水溶液。
當步驟二所述的蛋白酶為胰蛋白酶時，使用堿性調節(jié)劑調節(jié)酪蛋白溶液體系的ph至7.0～8.5，然后在45～65℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g胰蛋白酶進行水解反應5～180min；
當步驟二所述的蛋白酶為菠蘿蛋白酶蛋白酶時，水解反應過程是用堿性調節(jié)劑調節(jié)體系的ph至6.0～8.0，在50～60℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g菠蘿蛋白酶進行水解5～180min；
當步驟二所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶時，水解反應過程是用堿性調節(jié)劑調節(jié)體系的ph至5～7，在50～65℃恒溫水浴條件下加入500～10000u/g木瓜蛋白酶進行水解反應5～240min；
本實施方式通過酶水解及超濾過濾使抗血栓肽產品中分子量低于5000da的多肽含量盡可能多：
1、通過采用合適的酶添加量（500～10000u/g）、控制酶解時間（5～240min）、控制有效的體系溫度（40～65℃）、體系ph（6.0～9）等參數(shù)控制酶解過程；
2、將水解液滅酶后離心取上清，進行超濾處理，通過控制超濾膜的孔徑范圍（1k～10kda）等方法實現(xiàn)產物的有效分子量截留。
本實施方式發(fā)現(xiàn)分子量較低的多肽具有更好的生物學活性。對于抗血栓活性而言，分子量較小的多肽能夠和凝血酶的活性部位更好的結合，分子量較大的肽段空間位阻較大會影響其本身與血管緊張素轉換酶及凝血酶的結合。因此，分子量低于5kda的多肽含量越高，產品的生物學活性越好。
實施例二：本實施方式與實施例一不同的是步驟一所述的酪蛋白蛋白溶液的濃度為4wt%～12wt%。其它步驟及參數(shù)與實施例一相同。
實施例三：本實施方式與實施例一或二不同的是步驟二中所述的堿性調節(jié)劑為naoh溶液、koh溶液、碳酸氫鈉溶液或碳酸氫鉀溶液。其它步驟及參數(shù)與實施例一或二相同。
實施例四：本實施方式與實施例二不同的是步驟一所述的酪蛋白的制備過程如下：將牛奶經過離心脫脂處理，制備得到脫脂乳，調節(jié)脫脂乳ph為4.5～4.8，靜置離心收集沉淀，得到酪蛋白。其它步驟及參數(shù)與實施例二相同。
實施例五：本實施方式與實施例一不同的是步驟二中所述的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰酶之間兩種及多種蛋白酶復合酶解。其它步驟及參數(shù)與實施例一相同。
實施例六：本實施方式與實施例一不同的是當步驟二所述的蛋白酶胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰酶的復合蛋白酶時，滅酶處理是在80～100℃下滅酶5～20min。其它步驟及參數(shù)與實施例一相同。
實施例七：本實施方式與實施例一至六之一不同的是當步驟二所述的蛋白酶為胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶及胰酶，滅酶處理是滴加酸性調節(jié)劑或堿性調節(jié)劑調節(jié)酶解液的ph至4.0～5.0或者10-12。其它步驟及參數(shù)與實施例一至六之一相同。
實施例八：本實施方式與實施例一至七之一不同的是步驟五所述的殺菌處理是在管式熱交換器中以130～142℃的溫度進行超高溫瞬時殺菌2～8s。其它步驟及參數(shù)與實施例一至七之一相同。
本實施方式步驟五也可以通過膜過濾除菌結合巴氏殺菌的方式。采用0.2～1.2μm孔徑的無機陶瓷膜進行過濾除菌，然后進行62～65℃的巴氏殺菌，處理時間為20～30min。
實施例九：本實施方式與實施例一至八之一不同的是步驟五所述的干燥處理是通過真空冷凍干燥法，控制冷阱溫度-73～-40℃，真空度為0.01～0.5mbar，干燥時間為3～24h。其它步驟及參數(shù)與實施例一至八之一相同。
實施例十：本實施方式與實施例一至九之一不同的是步驟五所述的干燥處理是先加入占殺菌后的酶解溶液重量2%～3%的麥芽糊精和0.5%～2%的β-環(huán)狀糊精，再通過噴霧干燥方法進行干燥處理，噴霧干燥時的進風溫度為145～200℃，排風溫度為70～95℃。其它步驟及參數(shù)與實施例一至九之一相同。
實施例十一：本實施方式與實施例一至十之一不同的是步驟六所述的干燥處理是通過120～160℃（低溫）低溫噴霧干燥法進行的。其它步驟及參數(shù)與實施例一至十之一相同。
本實施例在多肽產品中采用q-tof質譜技術鑒定出具有降血壓及抗血栓活性多肽nmainpskenlcstfck來自于α-s2-酪蛋白（alpha-s2-casein）。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內，根據(jù)本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。
sequencelisting
<110>大連工業(yè)大學
<120>一種生物活性肽及其制備方法
<130>2017.6.12
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<213>人工合成
<400>1
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151015
lys