本發(fā)明涉及生物細胞技術領域，尤其涉及一種表皮干細胞的富集方法。

背景技術：

皮膚是人體最大的器官，也是人體的第一道防線。表皮干細胞位于皮膚表皮的基底層，具有多種分化潛能以及高度增殖的能力。表皮干細胞最顯著的特征是慢周期性和自我更新能力，它不僅可以保持細胞恒定，還是皮膚及其附屬器官發(fā)生、改建和修復的關鍵性功能細胞。隨著組織工程、基因工程等科技領域的發(fā)展，大面積燒傷、嚴重創(chuàng)傷后的皮膚缺損的修復等臨床問題的出現，以及毒理學的皮膚刺激性評價的替代材料需求的日益提高，表皮干細胞的分離和培養(yǎng)，以及如何維持其干性，利用表皮干細胞構建動物替代皮膚模型，成為了研究人員的關注重點。

由于組織結構和遺傳發(fā)育背景的一致性，表皮干細胞在皮膚組織工程的研究中具有天然優(yōu)勢；研究表明，如連續(xù)傳代培養(yǎng)，表皮干細胞可進行140次分裂，即能產生1×10⁴⁰個子代細胞。近年來，國內外學者應用多種方法體外分離、培養(yǎng)表皮干細胞均獲得了成功，但如何方便、快捷地對所獲取的表皮干細胞進行純化培養(yǎng)一直沒有比較好的技術方法。

表皮干細胞純化培養(yǎng)的技術方法主要包括細胞外基質快速黏附法、流式細胞儀分選法、低密度單克隆篩選法等。細胞外基質快速黏附法是利用不同細胞的貼壁時間及粘附性能不同，從而達到分離的效果。利用ⅰ型、ⅳ型膠原快速粘附法快速的分離和篩選富集表皮干細胞應用越來越廣泛。但也有部分學者認為利用該法篩選的表皮干細胞中含有少量的非表皮干細胞存在，不夠充分精確。利用流式細胞儀進行表皮干細胞的分選，受抗體和細胞數量的影響，不能達到快速且準確的分離和富集表皮干細胞的目的。低密度單克隆篩選，是將細胞以克隆密度接種于含有滋養(yǎng)細胞的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)后計算克隆形成率，再將單個克隆挑取出來分散成單細胞接種培養(yǎng)，若一個克隆中95%以上細胞能再次形成細胞數大于50的克隆，即認為該克隆是干細胞的克隆。該方法對實驗室的無菌條件和操作者的操作技術水平要求較高，非簡便易行的方法。胰蛋白酶差速脫壁法主要是利用胰蛋白酶分離培養(yǎng)最先脫壁的細胞，再用胰蛋白酶消化未脫壁細胞，分別培養(yǎng)，多次后分離和純化表皮干細胞。該法雖然簡便易行，但得到純化的表皮干細胞需要較長時間。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種表皮干細胞的富集方法，能夠在短時間內獲得純度較高的表皮干細胞。

為達到上述目的，本發(fā)明實施例采用如下技術方案：

步驟一、利用無血清培養(yǎng)基對表皮干細胞進行富集；

步驟二、利用型膠原對表皮干細胞進行二次富集。

進一步地，所述步驟一具體包括如下幾個步驟：

（1）將三種商用無血清培養(yǎng)基mcdb153、k-sfm和kmg中的任意兩種培養(yǎng)基按照1:1的比例配制的混合培養(yǎng)基；

（2）將g418加入混合培養(yǎng)基中，g418的濃度范圍為500~800μg/ml，配制完成的培養(yǎng)基放入4℃冰箱保存待用；g418能抑制成纖維細胞生長，去除表皮干細胞中混雜的成纖維細胞和黑色素細胞；

（3）在無菌條件下切取皮膚，去除疏松結締組織，用pbs進行浸洗；將組織切割成3mm×9mm大小，每15塊組織放入1個25ml血清瓶中，加入質量分數為1%的dispase酶和0.3mg/ml的透明質酸酶消化8h，后分離表皮和真皮層，表皮中加入胰酶消化液，37℃、5%co2培養(yǎng)箱中消化10min，消化完成后，每個25ml消化瓶中加入0.1的胎牛血清的dmem培養(yǎng)終止消化，后過200目網篩，800rpm離心6min，棄上清，用pbs輕柔吹打細胞，至細胞懸液完全混勻，用計數板計數；

（4）根據計數結果，按照5e6~8e6/瓶進行接種，每瓶加入15ml上述混合培養(yǎng)基，放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后輕輕倒掉上清液，每瓶用10ml的混合培養(yǎng)基吹打細胞，直至所用的貼壁細胞全部脫落，吸出細胞混合懸液，800rpm離心6min，棄上清；再次加入上述混合培養(yǎng)基5ml，重懸細胞，并移入t75一次性培養(yǎng)瓶，用5ml混合培養(yǎng)基清洗離心管，一同加入培養(yǎng)瓶，再給培養(yǎng)瓶中加入5ml上述培養(yǎng)基，放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后，按照上述方法得到第2代細胞。

進一步地，所述步驟二具體包括如下幾個步驟：

（1）型膠原以醋酸溶解并以0.01mol/lpbs稀釋至0.1g/l，無菌過濾后，在六孔板的每孔中加入50~100μl，確保涂滿6孔板，置4℃冰箱過夜，棄上清，40℃干燥箱烘干，紫外線照射2h消毒備用；用0.01mol/lpbs漂洗3次，洗去未貼壁的膠原；置37℃自然干燥后，再重復2~3次，得到預鋪型膠原的6孔培養(yǎng)板；

（2）將利用無血清培養(yǎng)基富集得到的第2代表皮干細胞懸液1.0e5~5e5/ml接種于預鋪型膠原的6孔培養(yǎng)板，37℃、5%co2培養(yǎng)箱內靜置20min；吸出培養(yǎng)液和未貼壁的細胞，pbs清洗3次，去除殘留細胞，保證型膠原表面附著性質均一的表皮干細胞；

（3）用原代消化液消化粘附于型膠原表面的表皮干細胞，離心獲得表皮干細胞沉淀。使用表皮細胞培養(yǎng)液重懸細胞干細胞，得到純度較高的第三代表皮干細胞。

進一步地，所述原代消化液為質量分數為0.25%的胰酶消化液。

本發(fā)明實施例提供一種表皮干細胞的富集方法，該方法包括如下幾個步驟：步驟一、利用無血清培養(yǎng)基對表皮干細胞進行富集；步驟二、利用型膠原對表皮干細胞進行二次富集?；谏鲜鰧嵤├拿枋?，該方法能夠在短時間內獲得純度較高的表皮干細胞。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行詳細地描述。

實施例1

本實施例中，表皮干細胞的富集方法，包括g418濃度篩選、細胞富集和結果鑒定，具體步驟為：

1、g418濃度篩選

選取實驗室培養(yǎng)的人皮膚成纖維細胞，按照每孔100個細胞進行鋪板，體積100μl，g418濃度梯度為0，50，100，150，200，300，400，500，600，700，800，900，1000μg/ml，每個濃度設2個平行，培養(yǎng)時間為10天，以細胞全部死亡最低濃度為基準，篩選出最適合用于篩選成纖維細胞的濃度，最終選取500μg/ml作為混合培養(yǎng)基中的濃度；

2、細胞富集

（a）將k-sfm和kmg兩種培養(yǎng)基按照1:1的比例配制成500ml的混合培養(yǎng)基，混合后添加g418，g418的濃度為500μg/ml。人胎型膠原以醋酸溶解并以0.01mol/lpbs稀釋至0.1g/l，無菌過濾后，在六孔板的每孔中加入60μl，確保涂滿6孔板，置4℃冰箱過夜，棄上清，用0.01mol/lpbs漂洗3次，洗去未貼壁的膠原，40℃干燥箱烘干，得到預鋪型膠原的6孔培養(yǎng)板，紫外線照射2h消毒備用。

（b）選取正常人包皮組織，在無菌條件下，用pbs溶液浸洗直至無血污，將組織切割成3mm×9mm大小，用質量分數為1%的dispase酶和0.3mg/ml的透明質酸酶消化8h，分離表皮和真皮，表皮中加入0.25%的胰酶消化液，37℃、5%co2培養(yǎng)箱中消化10min，消化完成后，加入0.1的胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，后過200目網篩，800rpm離心6min，棄上清，用pbs輕柔吹打細胞，至細胞懸液完全混勻，用計數板計數。用表皮細胞培養(yǎng)液按照3e6/瓶接種一瓶，后續(xù)待用。

（c）根據計數結果，按照5e6/瓶進行接種，每瓶加入15ml上述混合培養(yǎng)基，放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24h后輕輕倒掉上清液，每瓶用10ml的混合培養(yǎng)基吹打細胞，直至所用的貼壁細胞全部脫落，吸出細胞混合懸液，800rpm離心6min，棄上清。再次加入上述混合培養(yǎng)基5ml，重懸細胞，并移入t75一次性培養(yǎng)瓶，用5ml混合培養(yǎng)基清洗離心管，一同加入培養(yǎng)瓶，再給培養(yǎng)瓶中加入5ml上述培養(yǎng)基，放入37℃5%co2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，按照上述方法得到第2代細胞。

（d）將利用無血清培養(yǎng)基富集得到的第2代表皮干細胞懸液按照5e5/ml接種于預鋪型膠原的6孔培養(yǎng)板，37℃、5%co2培養(yǎng)箱內靜置20min。吸出培養(yǎng)液和未貼壁的細胞，pbs清洗3次，去除殘留細胞，保證型膠原表面附著性質均一的表皮干細胞。

（e）用原代消化液（質量分數為0.25%的胰酶消化液）消化粘附于iv型膠原表面的表皮干細胞，離心獲得表皮干細胞沉淀。使用表皮細胞培養(yǎng)液重懸表皮干細胞，得到純度較高的第3代表皮干細胞。

3、結果鑒定

分別取表皮細胞第1代、第3代，吸掉培養(yǎng)液，用胰酶消化液消化得到表皮細胞，后用1%bsa洗滌后制成細胞懸液，按照每孔1e6個細胞接種于6孔板。對照孔中只加入pe標記的小鼠igg1抗體及fitc標記的小鼠igg1抗體，其他孔中分別加入fitc標記的小鼠抗人細胞表面分子cd29、cd49f抗體。室溫孵育30min，用含1%bsa的pbs洗滌后，流式細胞儀檢測。結果顯示，第1代表皮細胞cd29陽性率為93.24%，cd49f陽性率為88.45%，而經過本發(fā)明方法富集后，第3代表皮細胞cd29陽性率為96.89%，cd49f陽性率為96.72%。由此說明，使用本發(fā)明方法進行表皮干細胞的富集，不僅時間短，而且富集效果明顯，能夠應用于體外3d皮膚的重建。

本發(fā)明實施例提供一種表皮干細胞的富集方法，該方法包括如下幾個步驟：步驟一、利用無血清培養(yǎng)基對表皮干細胞進行富集；步驟二、利用型膠原對表皮干細胞進行二次富集?；谏鲜鰧嵤├拿枋?，該方法能夠在短時間內獲得純度較高的表皮干細胞。

以上所述，僅為本申請的具體實施方式，但本申請的保護范圍并不局限于此，任何在本申請揭露的技術范圍內的變化或替換，都應涵蓋在本申請的保護范圍之內。因此，本申請的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。