用于活化干細胞的方法和裝置制造方法
【專利摘要】本文描述的本發(fā)明實施方案包括用于刺激干細胞源中的間充質(zhì)干細胞分化為能夠形成骨的成骨細胞的方法和裝置。所述裝置和方法包括以有效形成活化干細胞的方式將干細胞源(諸如骨髓抽吸物，脂肪組織和/或純化的異體干細胞)暴露于活化劑。
【專利說明】用于活化干細胞的方法和裝置
[0001] 本申請是中國申請200980153430.4的分案申請，該母案的國際申請日為2009年 10月30日，本分案采用了與該母案一致的發(fā)明名稱。
[00(間相關申請
[0003] 本專利申請要求享有下列申請的申請日：2008年10月31日提交的美國臨時專利 申請系列號61/110, 096,標題為"利用生長因子的體外刺激活化骨髓抽吸物W改善骨形成 的裝置值EVICE FOR ACTIVATING BONE MARROW ASPIRATE USING EX VIVO STIMULATION BY GROWTH FACTORS FOR IMPROVED BONE FORMATION)"，和 2009 年 2 月 13 日提交的美國臨時 專利申請系列號61/152, 335,標題為"用于形成骨髓抽吸產(chǎn)物的方法和裝置（METHOD AND DEVICE FOR FORMING A BO肥MARROW ASPIRATE PR孤UCT)"，其內(nèi)容在此完整引入作為參 考。

【技術(shù)領域】
[0004] 本文描述的發(fā)明主題涉及用于活化干細胞的裝置和方法，包括使用體外刺激活化 骨髓抽吸物中的干細胞。發(fā)明主題還涉及包含該類活化干細胞的植入物。
[0005] 發(fā)明背景
[0006] 為了提供最多的骨形成，希望移植已經(jīng)顯示成骨細胞表型的細胞，因為該類細胞 可能顯示骨形成活性。但是，骨髓干細胞在體外分化為成骨細胞涉及在成骨培養(yǎng)基中的培 養(yǎng)Qaiswal et al. 1997. J Cell Biochem 64:295-312)，可能導致該類細胞體外增殖的降 低。此外，成骨培養(yǎng)基的使用包括向細胞中添加成分（例如，生長因子），如果該些成分與細 胞一起給患者施用可能具有非故意的副作用。
[0007] 因此，本領域需要從干細胞（例如，人骨髓干細胞）體外產(chǎn)生骨祖細胞，成骨細胞 或成骨細胞表型細胞的簡單和可靠的方法，其中可W方便的將將所需細胞與用于產(chǎn)生骨祖 細胞，成骨細胞或成骨細胞表型細胞的因子分離。
[000引發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明的一個方面是制備用于促進哺乳動物骨生長的植入組合物的方法，包括 (a)將干細胞與一種或更多種活化劑接觸24小時或更短時間W制備活化干細胞，化）從活 化干細胞分離活化劑W形成基本上不含活化劑的活化干細胞群，和（C)將基本上不含活化 劑的活化干細胞群與骨移植替代物混合從而制備用于促進哺乳動物骨生長的植入組合物， 其中至少一種活化劑促進干細胞分化為成骨細胞或成骨前體細胞。成骨細胞和/或成骨祖 細胞可W是骨祖細胞，成骨細胞或成骨細胞表型細胞。在一些實施方案中，將干細胞與一種 或更多種活化劑接觸5分鐘到1小時。在其他實施方案中，將干細胞與一種或更多種活化 劑接觸5分鐘到0. 5小時。干細胞可W，例如，獲得自或分離自骨髓，脂肪組織，肌肉組織， 廝血，胚胎卵黃囊，胎盤，廝帶，骨膜，胎兒皮膚，青少年皮膚，或血液。干細胞可W是胚胎干 細胞，出生后干細胞或成人干細胞。在一些實施方案中，干細胞是自體的（autologous),異 體的（allogeneic)或異種的（xenogeneic)。干細胞可W包括間充質(zhì)干細胞。該類間充質(zhì) 干細胞可W包括自體骨髓抽吸物。骨髓抽吸物可W在手術(shù)中吸出。獲得干細胞后，可W將 它們濃縮W去除不必要的液體?？蛇x的，干細胞可W從最初獲得它們的組織或液體分離。
[0010] 活化劑可W，例如，調(diào)節(jié)細胞生長和/或分化，并且可W選自小分子，膚，生 長因子，細胞因子，配體，激素及其組合?；罨瘎┑膶嵗ɑ罨瘎┲T如轉(zhuǎn)化生長因 子beta(TGF-目），成纖維細胞生長因子（FGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，骨形態(tài)發(fā) 生蛋白炬MP)，膜島素生長因子（IGF),白介素-I(IL-I),白介素-11(比-11)，斯伐他汀 (simvastatsin)，地塞米松，氧留麗，音酒因子（sonic hedgehog)，干擾素，腫瘤壞死因子， 神經(jīng)生長因子（NGF)，纖連蛋白，RGD膚，整合素，表皮生長因子巧GF)，肝細胞生長因子 (HGF)，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨蛋白，及其組合。在一些實施方案中，活化劑選自BMP-2 ，TGF-beta3, PSGF-AB, PDGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8,比-11，斯伐 他汀，地塞米松，氧留麗，音酒因子及其組合。在其他實施方案中，活化劑包括TGF-目和 FG訊，還可W包括PDGF?；罨瘎┛蒞來自于自體來源?；罨瘎┛捎糜诓捎萌芤旱姆椒?。當 活化劑用于采用溶液的方法時，通過包括過濾，凝膠過濾，切向流動過濾，免疫沉淀，免疫吸 附，柱層析或其組合的方法從活化劑按照步驟化）分離活化干細胞。在其他實施方案中，將 活化劑連接到固相支持物。例如，通過共價粘附，吸附，非共價相互作用和/或其組合，將至 少一些活化劑直接或間接連接到固相支持物。在一些實施方案中，至少一些活化劑通過膚， 抗體，化學交聯(lián)劑，焼撐鏈或其組合連接到固相支持物。
[0011] 骨移植替代物可W包括材料諸如巧鹽。該類巧鹽可W，例如，包括一水合磯酸一 巧，a-磯酸H巧，目-磯酸H巧，碳酸巧，或其組合。骨移植替代物還可W包括脫礦質(zhì)骨 (demineralized bone)，磯酸軸鹽，多聚體或其組合。該類多聚體可W是膠原，明膠，透明質(zhì) 酸，透明質(zhì)酸鹽，輕丙基纖維素（HPC)，駿甲基纖維素（CMC),輕丙基甲基纖維素（HPMC)，輕 己基纖維素（肥C)，黃原膠（xantham gum),瓜耳豆膠（guar gum),藻酸鹽或其組合。在一些 實施方案中，所述方法增加干細胞中堿性磯酸酶和/或骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬M巧受體亞單位 的表達。該類方法還可W包括將植入組合物植入患者。
[0012] 本發(fā)明的另一個方面是通過本文所述方法制備的植入組合物。
[0013] 本發(fā)明的另一個方面是治療受試者骨損傷、病癥或疾病的方法，包括給受試者的 骨損傷、病癥或疾病部位施用本文所述的植入組合物。該類骨損傷、病癥或疾病可W是斷裂 的骨，骨缺陷，骨移植物化one transplant),骨移植化one graft),骨癌，關節(jié)替換（joint replacement),關節(jié)修復（joint repair),骨融合，骨小平面修復化one facet repair),骨 退化，牙齒植入，牙齒修復，關節(jié)炎，骨重建，或其組合。
[0014] 本發(fā)明的另一個方面是用于活化干細胞的裝置，包括固相支持物和至少一種促進 干細胞分化為成骨細胞或成骨前體細胞的活化劑，其中所述裝置適于：（i)將干細胞與至 少一種活化劑溫育，和（ii)在溫育步驟（i)后將至少一種活化劑與干細胞分離。例如， 至少一種活化劑選自轉(zhuǎn)化生長因子beta(TGF)，成纖維細胞生長因子（FGF)，血小板衍生 生長因子（PDG巧，骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬MP)，膜島素生長因子（IG巧，白介素-I(IL-I),白介 素-11 (比-11)，斯伐他汀，地塞米松，氧留麗，音酒因子，干擾素，腫瘤壞死因子，神經(jīng)生長因 子（NGF)，纖連蛋白，RGD膚，整合素，表皮生長因子巧GF)，肝細胞生長因子（HGF)，角質(zhì)形成 細胞生長因子，成骨蛋白，及其組合。
[0015] 在一些實施方案中，至少一種活化劑選自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB, PDGF-BB, FG F-2，TGF-betal，BMP-4，BMP-7，BMP-6，F(xiàn)GF-8，IL-ll，斯伐他汀，地塞米松，氧留麗，音酒因 子及其組合。在其他實施方案中，至少一種活化劑包括TGF-目和FG訊，還可包括PDGF。至 少一種活化劑可W，例如，來自于自體來源?；罨瘎┛蒞位于固相支持物的溶液內(nèi)或連接到 固相支持物?；罨瘎┛蒞，例如，通過結(jié)合至少一種活化劑的抗體或膚連接到固相支持物。
[0016] 固相支持物可W包括柱基質(zhì)材料，濾器，培養(yǎng)板，管或平皿，微量滴定板，珠子，盤， 或其組合。固相支持物可W是容器。固相支持物可W包括塑料，纖維素，纖維素衍生物，磁 性顆粒，硝酸纖維素，玻璃，玻璃纖維，膠乳，或其組合。固相支持物還可W包括親和基質(zhì)W 去除至少一種活化劑。當濾器存在于固相支持物中時，濾器可W保留細胞和骨移植替代材 料但允許至少一種活化劑穿過?？蛇x的，濾器可W保留至少一種活化劑但允許干細胞穿過。 在一些實施方案中，固相支持物不結(jié)合干細胞或不與干細胞不利地相互作用。在其他實施 方案中，固相支持物可W結(jié)合干細胞但沒有與干細胞不利地相互作用。
[0017] 裝置還可W包括用于控制干細胞與至少一種活化劑溫育時間的計時器。例如，在 溫育步驟（i)后計時器可W觸發(fā)至少一種活化劑與干細胞的分離。在一些實施方案中，具 有計時器的裝置控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為24小時或更短。在其他實施 方案中，具有計時器的裝置控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分鐘到1小時。
[0018] 本發(fā)明的另一個方面是用于骨形成的裝置，包括用于處理干細胞源的第一部件； 和用于W有效刺激干細胞源中間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的方式將干細胞源暴露于活 化劑的第二部件，其中可W將成骨細胞慘入可用于骨修復和/或生成的植入組合物干細胞 源可W是骨髓抽吸物，包括自體骨髓抽吸物在內(nèi)，脂肪組織和/或純化的異體干細胞?；罨?劑可 W 包括，但不限于BMP-2，TGF-beta3，PSGF-AB，PDGF-BB，F(xiàn)GF-2，TGF-betal，BMP-4，BMP-7，BMP-6，F(xiàn)GF-8，IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧留麗和/或音酒因子。活化劑可W例如通 過接頭直接連接到裝置的固相支持物或栓系到固相支持物。在一個實施方案中，栓系選自 焼撐鏈，膚，抗體，化學交聯(lián)劑，及其組合。
[0019] 在一個實施方案中，活化劑位于溶液中，并且第二部件還包括用于從間充質(zhì)干細 胞去除活化劑的濾器部件或親和基質(zhì)（例如，含有膚或抗體）。
[0020] 一種實施方案包括用于活化骨髓抽吸物的裝置。該裝置包括用于將骨移植替代物 和從患者抽取的骨髓抽吸物混合W形成混合物的部件。該裝置還包括W有效觸發(fā)間充質(zhì)干 細胞W增強成骨細胞表型的方式將混合物短暫暴露于固定或栓系的活化劑的部件。
[0021] 另一個實施方案包括用于活化骨髓抽吸物的裝置，其包括用于處理從患者抽取的 骨髓抽吸物的部件。該裝置還包括W有效觸發(fā)間充質(zhì)干細胞W增強成骨細胞表型的方式將 骨髓抽吸物暴露于活化劑的部件。
[0022] 本文還描述了另一活化骨髓抽吸物的裝置，包括用于將骨移植替代物和從患者抽 取的骨髓抽吸物混合W形成混合物的部件。該裝置還包括W有效觸發(fā)間充質(zhì)干細胞W增強 成骨細胞表型的方式將混合物暴露于固定或栓系的活化劑的部件。暴露后，從栓系或固定 的活化劑分離BMA，并將其與骨移植替代物混合。
[0023] 在一個實施方案中，一種方法包括將干細胞源（例如，骨髓抽吸物，包括自體骨髓 抽吸物）暴露于活化劑，其中干細胞中的間充質(zhì)干細胞被刺激分化為成骨細胞。在一個實 施方案中，骨髓抽吸物在手術(shù)中抽取和/或使用從患者抽取的形式?？蛇x的，在從患者抽取 后可將骨髓抽吸物進一步濃縮。該方法還包括將刺激或活化的干細胞（例如，間充質(zhì)干細 胞）與合成的骨移植替代物混合W形成混合物，其中暴露包括W有效觸發(fā)間充質(zhì)干細胞增 強成骨細胞表型的方式將混合物短暫暴露于固定或栓系的活化劑。
[0024] 在一個實施方案中，活化劑與基質(zhì)鍵合形成鍵合基質(zhì)。在該實施方案中，將干細胞 源與鍵合活化劑溫育一段時間，諸如5分鐘到24小時，或5分鐘到1小時，或15分鐘到1 小時。在一個實施方案中，溫育引起骨中骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬M巧受體亞單位的上調(diào)。
[00巧]在一個實施方案中，干細胞源暴露于活化劑發(fā)生在干細胞溶液中，該方法還包括 從干細胞溶液去除活化劑，諸如利用親和基質(zhì)的形成和/或過濾。
[0026] 在另一個實施方案中，提供方法W形成能夠刺激骨形成的祖細胞。方法操作包括 將骨髓抽吸物炬MA)與活化劑混合，并使用活化劑W觸發(fā)間充質(zhì)干細胞（MSCs)來增強成骨 細胞表型。該類方法可W觸發(fā)間充質(zhì)干細胞來增強或發(fā)展成骨細胞表型。該方法還包括將 骨移植替代物于從患者抽取的骨髓抽吸物混合W形成混合物；并W有效觸發(fā)間充質(zhì)干細胞 增強或發(fā)展成骨細胞表型的方式將混合物短暫暴露于固定或栓系的活化劑。
[0027] 在一些實施方案中，所述方法還包括給患者植入刺激的間充質(zhì)干細胞，包括植入 活化劑W及干細胞源。
[002引更具體地，本發(fā)明
[0029] 1. 一種制備用于促進哺乳動物骨生長的植入組合物的方法，包括（a)將干細胞與 一種或更多種活化劑接觸24小時或更短時間W制備活化干細胞，化）從活化干細胞分離活 化劑W形成基本上不含活化劑的活化干細胞群，和（C)將基本上不含活化劑的活化干細胞 群與骨移植替代物混合從而制備用于促進哺乳動物骨生長的植入組合物，其中至少一種活 化劑促進干細胞分化為成骨細胞或成骨前體細胞。
[0030] 2.項1的方法，其中將干細胞與一種或更多種活化劑接觸5分鐘到1小時。
[0031] 3.項1或2的方法，其中將干細胞與一種或更多種活化劑接觸5分鐘到0. 5小時。
[0032] 4.項1-3中任一項的方法，其中所述干細胞來自于骨髓，脂肪組織，肌肉組織，廝 血，胚胎卵黃囊，胎盤，廝帶，骨膜，胎兒皮膚，青少年皮膚，或血液。
[003引 5.項1-4中任意一項的方法，其中所述干細胞是自體的，異體的或異種的。
[0034] 6.項1-5中任意一項的方法，其中所述干細胞是胚胎干細胞，出生后干細胞或成 人干細胞。
[003引7.項1-6中任意一項的方法，其中所述干細胞包括間充質(zhì)干細胞。
[0036] 8.項1-4中任意一項的方法，其中所述干細胞包括自體骨髓抽吸物。
[0037] 9.項8的方法，其中所述骨髓抽吸物是在手術(shù)中抽取的。
[0038] 10.項8的方法，其中分離或濃縮骨髓抽吸物中的細胞。
[0039] 11.項1-10中任意一項的方法，其中所述活化劑可W調(diào)節(jié)細胞生長和/或分化，并 選自小分子，化生長因子，細胞因子，配體，激素及其組合。
[0040] 12.項1-11中任意一項的方法，其中所述活化劑選自轉(zhuǎn)化生長因子 betaCTGF-目），成纖維細胞生長因子（FGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，骨形態(tài)發(fā)生蛋 白炬MP)，膜島素生長因子（IGF),白介素-U比-1)，白介素-Il(IL-Il),斯伐他汀，地塞 米松，氧留麗，音酒因子，干擾素，腫瘤壞死因子，神經(jīng)生長因子（NGF)，纖連蛋白，RGD 膚，整合素，表皮生長因子巧GF)，肝細胞生長因子（HGF)，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨 蛋白，及其組合。
[0041] 13.項1-12中任意一項的方法，其中所述活化劑選自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB ，PDGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧 留麗，音酒因子及其組合。
[0042] 14.項1-13中任意一項的方法，其中所述活化劑包括TGF-目和FG訊。
[0043] 15.項14的方法，其中所述活化劑包括PDGF。
[0044] 16.項1-15中任意一項的方法，其中所述活化劑位于溶液中。
[0045] 17.項1-15中任意一項的方法，其中將所述活化劑連接到固相支持物。
[0046] 18.項17的方法，其中通過膚，抗體，化學交聯(lián)劑或其組合將至少一些活化劑連接 到固相支持物。
[0047] 19.項1-18中任意一項的方法，其中通過包括過濾，凝膠過濾，切向流動過濾，免 疫沉淀，免疫吸附，親和層析，柱層析或其組合的方法將活化干細胞與活化劑分離。
[0048] 20.項1-19中任意一項的方法，其中所述骨移植替代物包括巧鹽。
[0049] 21.項20的方法，其中所述巧鹽包括一水合磯酸一巧，a -磯酸H巧，目-磯酸H 巧，碳酸巧，或其組合。
[0050] 22.項20或21的方法，其中所述骨移植替代物還包括脫礦質(zhì)骨，磯酸軸鹽，多聚體 或其組合。
[0051] 23.項22的方法，其中所述多聚體是膠原，明膠，透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸鹽，輕丙基纖 維素（HPC)，駿甲基纖維素（CMC)，輕丙基甲基纖維素（HPMC)，輕己基纖維素（肥C)，黃原膠， 瓜耳豆膠，藻酸鹽或其組合。
[0052] 24.項1-23中任意一項的方法，其中所述方法增加干細胞中堿性磯酸酶和/或骨 形態(tài)發(fā)生蛋白炬M巧受體亞單位的表達。
[0053] 25.項1-24中任意一項的方法，還包括將植入組合物植入患者。
[0054] 26.通過項1-25中任意一項的方法制備的植入組合物。
[0055] 27. -種治療受試者骨損傷、病癥或疾病的方法，包括給受試者的骨損傷、病癥或 疾病部位施用項26的植入組合物。
[005引 28.項27的方法，其中所述骨損傷、病癥或疾病包括斷裂的骨，骨缺陷，骨移植物， 骨移植，骨癌，關節(jié)替換，關節(jié)修復，骨融合，骨小平面修復，骨退化，牙齒植入，牙齒修復，關 節(jié)炎，骨重建，或其組合。
[0057] 29. -種用于活化干細胞的裝置，包括固相支持物和至少一種促進干細胞分化為 成骨細胞或成骨前體細胞的活化劑，其中所述裝置適于：（i)將干細胞與所述至少一種活 化劑溫育，和（ii)在溫育步驟（i)后將所述至少一種活化劑與干細胞分離。
[0058] 30.項29的裝置，其中至少一種活化劑選自轉(zhuǎn)化生長因子betaCTGF-目），成纖維 細胞生長因子（FGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬MP)，膜島素生長因 子（IGF),白介素-U比-1)，白介素-Il(IL-Il),斯伐他汀，地塞米松，氧留麗，音酒因 子，干擾素，腫瘤壞死因子，神經(jīng)生長因子（NGF)，纖連蛋白，RGD膚，整合素，表皮生長 因子巧GF)，肝細胞生長因子化GF)，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨蛋白，及其組合。
[0059] 31.項29或30的裝置，其中至少一種活化劑選自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB, P DGF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11,斯伐他汀，地塞米松，氧留 麗，音酒因子及其組合。
[0060] 32.項29, 30或31的裝置，其中至少一種活化劑包括TGF-目和FG訊。
[0061] 33.項32的裝置，其中至少一種活化劑還包括PDGF。
[0062] 34.項29-33中任意一項的裝置，其中至少一種活化劑位于溶液中。
[0063] 35.項29-33中任意一項的裝置，其中將至少一種活化劑連接到固相支持物。
[0064] 36.項29-35中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括柱基質(zhì)材料，濾器，培 養(yǎng)板，管或平皿，長頸瓶，微量滴定板，珠子，盤，或其組合。
[0065] 37.項29-36中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括塑料，纖維素，纖維素 衍生物，磁性顆粒，硝酸纖維素，玻璃，玻璃纖維，膠乳，或其組合。
[0066] 38.項29-37中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括親和基質(zhì)W去除至少 一種活化劑。
[0067] 39.項29-38中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括，與至少一種活化劑結(jié) 合的，鏈霉親和素，生物素，交聯(lián)劑，抗體或膚。
[0068] 40.項29-39中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括容器。
[0069] 41.項29-40中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括濾器。
[0070] 42.項41的裝置，其中所述濾器保留細胞和骨移植替代材料但允許至少一種活化 劑穿過。
[0071] 43.項41的裝置，其中所述濾器保留至少一種活化劑但允許干細胞穿過。
[0072] 44.項29-43中任意一項的裝置，其中所述固相支持物材料不結(jié)合干細胞或不會 與干細胞發(fā)生不利地相互作用。
[0073] 45.項29-44中任一項的裝置，其中所述干細胞來自于骨髓，脂肪組織，肌肉組織， 廝血，胚胎卵黃囊，胎盤，廝帶，骨膜，胎兒皮膚，青少年皮膚，或血液。
[0074] 46.項29-45中任意一項的裝置，其中所述干細胞包括間充質(zhì)干細胞。
[00巧]47.項29-46中任意一項的裝置，其中所述干細胞包括自體骨髓抽吸物。
[0076] 48.項29-47中任意一項的裝置，還包括用于控制干細胞與至少一種活化劑溫育 時間的計時器。
[0077] 49.項48的裝置，其中在溫育步驟（i)后計時器觸發(fā)至少一種活化劑與干細胞的 分離。
[007引 50.項48的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為24小時 或更短。
[0079] 51.項48的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分鐘 至Ij 1小時。
[0080] 52.項48的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分鐘 到0. 5小時。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0081] 圖1圖示說明本發(fā)明實施方案中原代人MSCs表達的堿性磯酸酶水平。在用成纖 維細胞生長因子（下文中稱為"FGF-2") (lOOng/ml)或TGF beta3(250ng/ml)處理1小時 后將細胞在分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后使用實施例1描述的測定法測量細胞表達的堿性磯酸 酶水平。
[0082] 圖2圖示說明在將細胞暴露于活化劑24小時后，原代人間充質(zhì)細胞（下文中稱 為"MSCs")中3類骨形態(tài)發(fā)生蛋白（下文中稱為"BMP")受體單位的相對mRNA拷貝數(shù)，即 81口3-14廣14")，81口1?-18廣18")和81口1?-11廣11")。使用的活化劑是濃度為1叫/1111，10叫/ ml和l(K)ng/ml的血小板衍生生長因子（下文中稱為"PDGF BB")，成纖維細胞生長因子（下 文中稱為"FGF b")，和轉(zhuǎn)化生長因子（下文中稱為"TGF beta3")，暴露24小時。收集細胞， 并針對實施例1描述的全部3種BMP受體單位（即-1A，-IB和II)進行定量聚合酶鏈式反 應（下文中稱為"PCR")。
[008引 圖3圖示說明在將原代MSCs暴露于PDGF BB，F(xiàn)GF b和TGF beta3 (使用Ing/ml， lOng/ml和lOOng/ml的濃度）一（1)小時后，3種BMP受體單位（即-1A，-IB和II)的相 對mRNA拷貝數(shù)。收集細胞，并針對實施例1描述的全部3種BMP受體單位（即-1A，-IB和 II)進行定量PCR。
[0084] 詳細說明
[0085] 在本領域的當前狀態(tài)，骨髓抽吸物（下文中稱為"BMA")在手術(shù)中從患者抽取，與 骨移植替代物混合并重新植入手術(shù)部位W促進骨治愈。但是，盡管骨髓抽吸物可能包含一 些能夠產(chǎn)生成骨細胞的結(jié)締組織祖細胞，但是在實際能夠促進骨形成的成骨細胞數(shù)目和類 型方面患者與患者之間存在巨大差異。
[0086] 本文描述了改善干細胞（例如，BMA)性能的方法，裝置和植入物，通過增加細胞數(shù) 目或通過增加BMA或干細胞混合物中祖細胞的成骨潛能。本文描述的實施方案包括方法 和裝置，簡單來說，手術(shù)中在體外將干細胞暴露于一種或更多種外源活化劑，從而產(chǎn)生能夠 刺激骨生長的祖細胞，然后從干細胞（即，通過活化劑活化的祖細胞）去除活化劑?；罨瘎?可W是，例如，小分子，膚，生長因子，細胞因子，配體或其他因子?；罨瘎┛蒞從自體來源捕 獲，獲自商品化來源或制備得到（例如，通過重組方法）。
[0087] 在一些實施方案中，活化劑能夠增加干細胞混合物的祖細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (下文中稱為BM巧受體亞單位的表達?；罨瘎┑脑摲N處理有助于，例如，在骨損傷或骨手術(shù) 部位增強祖細胞對內(nèi)源性BMPs產(chǎn)生應答的能力?；罨瘎┑脑摲N處理還可W驅(qū)使干細胞沿 著成骨細胞途徑分化。如本文所述，雖然通過用細胞因子處理較長時段（例如，幾天）已經(jīng) 活化干細胞，但是將干細胞暴露于活化劑所述較長時段不是必需的；在只暴露于活化劑約 15分鐘到約3小時后干細胞就可W被活化并顯示成骨潛能。
[0088] 此外，一些研究表明存在骨前體細胞體外生長必需的輔助細胞群。因此，即使在存 在成骨細胞因子混合物的條件下，高度純化的骨前體細胞也可能不能擴增。因此，干細胞的 延長培養(yǎng)不一定是有益的。本文描述的方法和裝置不涉及培養(yǎng)細胞的延長時段，它們是更 快的，從而避免了與延長的細胞培養(yǎng)有關的污染和花費的可能。
[0089] 因為本文描述的干細胞具有成骨潛能的增強、活化和/或分化可W通過將活化劑 栓系到裝置上或裝置內(nèi)實現(xiàn)，W便干細胞混合物內(nèi)包含的細胞可W被活化，并方便的與活 化劑分離，例如，通過從裝置去除細胞。在細胞移植前從細胞分離活化劑減輕了活化劑本身 不需要的副作用的可能（例如，刺激不想要的應答或誘導有害的免疫應答）。
[0090] 干細胸源
[0091] 本文描述的方法，裝置和植入物可W使用來自任何方便來源的干細胞。但是，優(yōu)選 的是具有成骨潛能或可W被處理（例如，分化）W產(chǎn)生具有成骨潛能的細胞的干細胞。
[0092] 可用于本文所述方法，裝置和植入物的干細胞源包括骨髓，脂肪組織，肌肉組織， 體外培養(yǎng)的自體間充質(zhì)干細胞，異體的制成（off-the-shelf)間充質(zhì)干細胞，廝血，胚胎卵 黃囊，胎盤，廝帶，骨膜，胎兒和青少年皮膚，和血液。在一些實施方案中，干細胞是間充質(zhì)干 細胞或包括間充質(zhì)干細胞的細胞混合物（例如，骨髓抽吸物）。干細胞可W是自體，異體或 異種來源。干細胞可W是胚胎來源，出生后來源或成人來源。
[0093] 骨髓抽吸物是可用于本文所述方法，裝置和植入物的一種干細胞源。該類骨髓抽 吸物可W是自體，異體或異種來源，在一些實施方案中，骨髓抽吸物是自體的。
[0094] 骨髓抽吸物包含W下細胞的復雜混合物：造血干細胞，紅細胞和白細胞及它們的 前體，間充質(zhì)干細胞和祖細胞，間質(zhì)細胞及它們的前體，W及形成稱為"基質(zhì)"的結(jié)締組織網(wǎng) 絡的包括成纖維細胞，網(wǎng)織紅細胞，脂肪細胞，和內(nèi)皮細胞的一組細胞?；|(zhì)細胞通過細胞 表面蛋白的直接相互作用和生長因子的分泌從形態(tài)上調(diào)節(jié)造血細胞分化，并涉及骨結(jié)構(gòu)的 建立和支持。研究顯示骨髓包含"前間質(zhì)（pre-stromal)"細胞，其具有分化為軟骨，骨和其 他結(jié)締組織細胞的能力。BeresforcTOsteogenic Stem Cells and the Stromal System of Bone and Marrow", Clin. Orthop. , 240:270, 1989。新近的證據(jù)顯示該些細胞（稱為多能性 間質(zhì)干細胞或間充質(zhì)干細胞）在活化時具有產(chǎn)生數(shù)種不同類型的細胞系（即，骨細胞，軟骨 細胞，脂肪細胞，等）的能力。但是，間充質(zhì)干細胞經(jīng)常W極少量與多種其他細胞（即，紅細 胞，血小板，中性粒細胞，淋己細胞，單核細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞，脂肪細胞，等） 存在于骨髓抽吸物中。此外，它們分化為結(jié)締組織組合的能力不僅取決于抽吸物中生物活 性因子的存在（其可W不同），但是在某種程度上還取決于供體的年齡。本文描述的方法和 裝置通過提高干細胞樣品中細胞的數(shù)目和干細胞分化為成骨細胞的潛能來解決該些問題。
[0095] 在一些實施方案中，干細胞包括間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞可W通過本領域技 術(shù)人員能夠得到的方法進行鑒定。例如，可W通過集落形成單位測定（C即-巧或利用間充 質(zhì)干細胞通常表達的標記物通過流式細胞術(shù)鑒定間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞通常表達諸 如CD27r，CD105+，CD73+的標記物，但顯示CD34-和CD45-表型。
[0096] 當使用骨髓細胞時，該些細胞可W獲自骼晴，股骨，腔骨，脊柱，肋骨或其他骨髓空 隙。在一些實施方案中，干細胞來自于自體液體（例如，骨髓抽吸物）。內(nèi)腔骨髓抽吸物是 間充質(zhì)干細胞的良好來源。
[0097] 在一些實施方案中，將干細胞用于分離步驟諸如離也，大小過濾，免疫磁性挑選 等，W便篩除"無關"細胞，并提高活化步驟的效率，或預選間充質(zhì)干細胞W有利于植入材料 中的骨形成。盡管不是必需分離細胞類型和/或純化間充質(zhì)干細胞，在一些實施方案中該 是所希望的。
[0098] 當需要分離細胞類型時，可W將例如包括骨髓的生物樣品進行離也W將樣品成分 基于密度分離為各種組分，包括富含結(jié)締組織生長促進成分的組分諸如間充質(zhì)干細胞。從 而分離富含結(jié)締組織生長促進成分的組分。此外，被離也的生物樣品可W不含細胞培養(yǎng)基 材料。在一些實施方案，被離也的生物樣品基本上由來自患者的組織材料（例如骨髓材 料任選的W及血液或其他組織材料）組成，隨后將給所述患者植入所獲分離和活化的干細 胞。
[0099] 活化劑
[0100] 在本文描述的方法和裝置中使用活化劑W促進干細胞形成和/或分化為成骨細 胞。該類活化劑可W是，例如，小分子，膚，生長因子，細胞因子，配體，激素，W及調(diào)節(jié)生長和 分化的其他分子?；罨瘎┛蒞從自體來源捕獲，獲自商品化來源或制備得到（例如，通過重 組方法）。
[0101] 可W使用的活化劑實例包括TGF，F(xiàn)GF，PDGF，BMP, IGF,白介素，比-1，比-11，TGF， NGF，EGF，HGF，斯伐他汀，地塞米松，氧留麗，音酒因子，干擾素，纖連蛋白，"RGD"或整合素膚 和/或蛋白，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨蛋白，MSX1，NF邸1，RUNX2, SMAD1，SMAD2, SMAD3, S MAD4, S0X9, TNF, TWIST1, VDR, AHSG, AMBN, AMELY, BGLAP, ENAM, MINPP1, STATH, TUFT1, BMPl, C OLl 1A1, S0X9, ALPL AMBN, AMELY, BGLAP, CALCR, CDHl 1，DMPl, DSPP, ENAM, MINPP1, P肥X，RUNX 2, STATH, TFIP11, TUFT1, BGLAP, BMP3, BMP5, BMP6, C0L10A1, C0L12A1, C0L1A1, C0L1A2, C0L2A 1，COMP, FGFR1, GDF10, IGFl, IGF2, MSXl, ANXA5, CALCR, CDHl 1，COMP, DMPl, EGF, MMP2, MMP8, C 0L10A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L3A1, C0L4A3, C0L5A1, EGFR, FGFl, FGF3, IGF1R, TGFB2, VEGFA, VEGFB, C0L4A3, CSF3, FLTl, IGFl, IGF1R, IGF2, PDGFA, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR2, V EGFA, VEGFB, BMPl, CS巧，CSF3, FGFR1, FGFR2, FLTl, GDF10, IGFl, IGF1R, IGF2, PDGFA, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TGFBR2, VEGFA, VEGFB, AHSG,沈RPINH1, CTSK, MMP10, MMP9, P肥X，AMBN ，AMELY, ENAM, STATH, TUFT1, BGN, COMP, DSPP, GDF10, CDHl 1，ICAM1, ITGB1, VCAM1, ITGA1, ITG A2, ITGA3, ITGAM, ITGB1, CD36, COMP, SCARB1, AMH, GDF2 炬MP9)，GDF3(Vgr-2)，GD巧（CDMP-I) ，GDF6, GD巧，IGFBP3, IL6, INHA (抑制素 a)，INHBA (抑制素 BA)，LEFTY 1，LTBP 1，LTBP2, LTB P4, N孤AL, ACVRl(ALK2)，ACVR2 A, ACV化1(ALKl)，AMHR2, BMPRlA(ALK3)，BMPRlB(ALK6)，BMP R2, 口GB5 (整合素 B5)，口GB7 (整合素 B7)，LTBP1, NR0B1, STAT1, TGFBlI 1，TGFBR1, (ALK5) TG FBR2, TGFBR3, TGFBRAP1, CDC25A, CDKNlA(p2 IWAFl/p2 ICIPl), CDKN2B(pl5LNK2B), FOS, GS C (goosecoid)，IGFBP3, ITGB5 (整合素 B5)，ITGB7 (整合素 B7)，JUN, JUNB, MYC, SERPI肥 I (P AI-I)，TGFBIII, TSC22D1 (TGFB1I4)，TGIFl, DLX2, IDl, ID2, JUNB, S0X4, STATl, BAMBI, BMP邸 ，CDKN2B(P15LNK2B)，CERl(Cerberus)，CH畑（chordin)，CST3, ENG巧vi-1)，EVIl, F邸PIB, HI PK2, NBLl 0AN)，NOG, PLAU (uPA)，RUNXl (AMLl)，SMURFl 和調(diào)節(jié)生長和分化的其他分子，W及 該些因子的組合。
[0102] 在一些實施方案中，活化劑包括轉(zhuǎn)化生長因子beta(TGF-目），成纖維細胞生長因 子（FGF，包括酸性或堿性成纖維細胞生長因子（FB化或FB訊)，和/或成纖維細胞生長因 子-S(FGF-S))，血小板衍生生長因子（PDGF)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬MP)家族（諸如BMP-1，B MP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6和/或BMP-7)，膜島素生長因子（IGF)家族的成員（例 女口，膜島素樣生長因子-I和/或II)，白介素-I(IL-I), IL-11，斯伐他汀，地塞米松，氧 留麗，音酒因子，干擾素，腫瘤壞死因子，神經(jīng)生長因子（NGF)，纖連蛋白，"RGD"或整合 素序列，表皮生長因子巧GF)，肝細胞生長因子化GF)，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨蛋白 (Ops ;諸如0P-1，0P-2, 0P-3)，和調(diào)節(jié)生長和分化的其他分子，W及該些因子的組合。
[0103] 還可W使用與完整蛋白一樣引發(fā)相同活化應答的膚活化劑。例如，可W使用與 TGF-目，F(xiàn)GFb和/或PDGF具有類似作用的蛋白的氨基酸片段或膚?？蒞使用來自本文所 述任意活化劑的或已知可用于活化干細胞的膚活化劑。在其他實施方案中，可W使用小分 子活化劑來活化干細胞。
[0104] 在許多實施方案中，在本文描述的方法和裝置中包括TGF-目家族作為活化劑。 TGF-目家族包括一組結(jié)構(gòu)相關蛋白，其在胚胎發(fā)育期間影響各種各樣的分化過程。包 括在TGF目家族中的是基于包括7個半脫氨酸殘基的保守性的初級氨基酸序列同源性。 該家族包括，例如，Mullerian抑制物（MIS),其是正常男性發(fā)育需要的炬e虹inger，et al.，化Uire, 345:167, 1990)，果禍decapentaplegic (DP巧基因產(chǎn)物，其是成蟲盤的背-腹 軸形成和形態(tài)發(fā)生需要的（Padgett, et al.，化Uire, 325:81-84, 1987)，非洲爪贍Vg-基 因產(chǎn)物，其位于卵的植物極（Weeks，et al.，Cell, 51:861-867, 1987)，活化素（Mason，et al. , Biochem, Biophys. Res. Commun. , 135:957-964, 1986)，其能夠誘導非洲爪贍胚胎的中 胚層和前部結(jié)構(gòu)的形成（Thomsen, et al.，Cell, 63:485, 1990)，和骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬MP' S， 諸如BMP-2到BMP-15)，其能夠誘導重新的軟骨和骨形成（Sampath，et al.，J. Biol. 化em.，265:13198, 1990)。TGF-目基因產(chǎn)物可W影響各種分化過程，包括脂肪形成，肌形成， 軟骨形成，造血作用，和上皮細胞分化（綜述參見Massague, Cell 49:437, 1987)，其在此完 整引入作為參考。
[0105] TGF-目家族的蛋白最初合成為大的前體蛋白，其隨后在C端的大約110-140個氨 基酸的一簇堿性殘基處經(jīng)歷蛋白水解切割。蛋白的C端區(qū)域都是結(jié)構(gòu)相關的，不同的家族 成員基于它們的同源性程度被劃分到不同的亞組。盡管特定亞組的同源性范圍是70%到 90 %氨基酸序列同一性，但亞組之間的同源性是顯著更低的，通常只有20 %到50 %。每種 情況下，活性物看起來是C端片段的二硫鍵連接的二聚體。對于已經(jīng)被研究的大多數(shù)家族 成員來說，發(fā)現(xiàn)同二聚體物是有生物活性的，而對其他家族成員來說，例如抑制素扣ng，et al.，化化re，321:779，1986)和TGF-目s(Cheifetz，etal.，Cell，48:409，1987)，，還檢測到 異二聚體，該些看起來比相應的同二聚體具有不同的生物學特性。
[010引 TGF-目基因超家族的成員包括TGF-目3, TGF-目2, TGF-目4 (雞），TGF-目1，TGF-目 5 (非洲爪贍），BMP-2, BMP-4,果禍 DPP, BMP-5, BMP-6, Vgrl, 0P-1/BMP-7,果禍 60A, GDF-1, 非洲爪贍Vgt BMP-3,抑制素-目A，抑制素-目B，抑制素-a,和MIS。該些基因描述于 Massague, Ann. Rev. Biochem. 67:753-791，1998,其在此完整引入作為參考。
[0107] 在一些實施方案中，本文所述裝置和方法中使用的TGF-目家族成員是TGF-目3。 。…引 成纖維細胸牛長巧子巧它們的彎體
[0109] 成纖維細胞生長因子（FGF巧包括進化上保守的多膚家族，涉及各種生物 過程包括形態(tài)發(fā)生，血管生成，和組織重建W及涉及許多疾病的發(fā)病機理（綜述于 化nitz，Bioessays 22:108, 2000,在此特別完整引入作為參考）。該家族的各種成員在體 外和體內(nèi)刺激較大范圍細胞的增殖，范圍從間充質(zhì)到上皮和神經(jīng)外胚層來源。FGFs在發(fā)育 期間W嚴格的時間和空間模式表達，在模式形成（patterning)和肢形成中具有重要作用 (Ornitz, Bioessays 22:108,2000)。
[0110] FGF家族的所有成員都具有約120個氨基酸的同源性核也結(jié)構(gòu)域，其中28個氨基 酸殘基是高度保守的，6個是相同的。對數(shù)種FGFs的結(jié)構(gòu)研究鑒定出12個反平行目鏈， 每個均鄰近包括核也區(qū)（在整個家族中都是保守的）的目-環(huán)。核也結(jié)構(gòu)域包括主要的 FGFR和肝素結(jié)合位點。受體結(jié)合區(qū)與肝素結(jié)合區(qū)不同（綜述于化nitz and Itoh, Gen. Biol. 2, 3005. 1，2001)。
[0111] 在一些實施方案中，本文描述的裝置和方法中使用的FGF家族成員是FGF-2。
[0112] 來自人血小板的血小板衍生生長因子（PDG巧包含兩條多膚序列-PDGF-B和 PDGF-A 多膚（Antoniades, H. N. and Hunkapiller, M. , Science220:963-965, 1983)。PDGF-B 由位于染色體7上的基因編碼炬etsholtz，C. et al.，化Uire 320:695-699)，PDGF-A由 位于染色體 22 上值alla-Favera, R.，Science218:686-688, 1982)的 sis 癌基因編碼 (Doolittle, R. et al.，Science 221:275-277,1983)。sis 基因編碼猿肉瘤病毒（SSV) 的轉(zhuǎn)化蛋白，其與PDGF-2多膚密切相關。人細胞C-SiS也編碼PDGF-A鏈（Rao, C. D. et al.，Proc.化tl. Acad. Sci. USA83:2392-2396, 1986)。因為 PDGF 的兩條多膚鏈由位于分離 染色體中的兩個不同基因編碼，人PDGF可W由二硫鍵連接的PDGF-B和PDGF-A異二聚體組 成，或由兩種同二聚體（PDGF-BB同二聚體和PDGF-AA同二聚體）的混合物組成，或由異二 聚體和兩種同二聚體的混合物組成。
[0113] PDGF可W商購獲得，或獲自人組織或細胞，例如，血小板，通過固相膚合成，或通 過重組DNA技術(shù)。培養(yǎng)的感染猿肉瘤病毒（其包含編碼PDGF-A鏈的基因）的哺乳動物細 胞可W合成PDGF-A多膚，并將其加工為二硫鍵連接的同二聚體（Ro化ins et al.，化化re 305:605-608, 1983)。此外，PDGF-A同二聚體與經(jīng)激發(fā)抗人PDGF的抗血清反應，分泌的 PDGF-A同二聚體的功能特性與血小板來源的PDGF類似?？蒞利用表達載體將C-Sis/ PDGF-B基因的CDNA克隆導入小鼠細胞，獲得重組PDGF-B同二聚體。用于所述表達的C-Sis/ PDGF-B克隆獲自培養(yǎng)的正常人內(nèi)皮細胞（Collins, T.，et al.，化Uire216:748-750, 1985)。
[0114] 盡管許多活化劑已經(jīng)用于活化成骨干細胞，本發(fā)明人產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明，在一些實 施方案中，TGF-目3, FGF-2和各種形式的PDGF是有用的。在其他實施方案中，用于活化干 細胞的裝置和方法包括至少TGF-目3和FGF-2作為活化劑。
[0115] 在一些實施方案中，活化劑能夠增加干細胞混合物的祖細胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白受 體亞單位的表達。利用該類活化劑的該種處理有助于，例如，在骨損傷或骨手術(shù)部位增強祖 細胞對內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白產(chǎn)生應答的能力?；罨瘎┑脑摲N處理還可W驅(qū)使干細胞沿著 成骨細胞途徑分化。
[0116] 骨形態(tài)發(fā)生蛋白炬MPs)不僅誘導骨和軟骨形成，而且是多功能性細胞因子，對許 多細胞類型具有各種各樣的作用化Ogan et al.，Genes Dev. 10:1580-1594(1996) ;Reddi et al.,切 tokine Growth Factor Rev. 8:11-20(1997))。BMPs 是 TGF 目超家族的成員。在 人類中存在15-20種BMPs基因，3種BMP受體，和大量的起B(yǎng)MP枯抗劑作用的BMP相關蛋 白（Yamashita et al. Bone 19:569-574(1996))。BMP 通過 3 種 BMP 受體炬MPR-IA，-IB 和 II)的Smad信號轉(zhuǎn)導途徑起作用。當BMP二聚體結(jié)合II型受體時，它形成復合體并磯酸化 I型受體，其激活Smad途徑。
[0117] 將原代成骨細胞暴露于外源生長因子可W調(diào)節(jié)該些受體的表達。Si^hatanadgit 等（J. Cell Physiol. 209(3) :912-22(2006))檢測了原代成骨細胞的 TGF-betal，F(xiàn)GF-2, PDGF-AB和BMP-2處理，W及該些生長因子對細胞表面的細胞內(nèi)受體的作用。Yeh等 (J. Cell. Physiol. 190 (3) : 322-31 (2002) J. Cell Wiysiol. 191 (3) : 298-309 (2002))觀察 到在暴露于OP-I后，胎兒大鼠頗蓋細胞中受體亞單位mRNA的差異調(diào)節(jié)模式。Xu等佑rowth Factors 24(4) :268-78(2006))檢測了 TG訊eta3 對 BMPR-IB 的作用。盡管已經(jīng)泛泛了解了 涉及BMPs結(jié)合它們的相應受體的信號轉(zhuǎn)導途徑的因子，它們受體亞單位的調(diào)節(jié)和表達模 式還沒有被完全闡明。此外，研究人員還未意識到，用生長因子處理干細胞（例如，骨髓） 較短時間，然后去除生長因子，可W刺激成骨細胞和/或成骨前體的形成。 陽11引 活化干細胸
[0119] 如本文所述，可W通過短暫暴露于活化劑將干細胞成骨活化。該類活化的干細胞 分化為骨祖細胞，成骨細胞和/或成骨細胞表型細胞。此外，從活化的干細胞去除活化劑產(chǎn) 生不包括生長因子和細胞因子（當移植入受試者時它們可能具有非故意的副作用）的細胞 混合物。因此，不需要在生物活性分子混合物中的數(shù)天干細胞培養(yǎng)，該導致等待治療患者的 進行中的疼痛和不能活動，骨損傷初次修復后用于插入植入物的額外手術(shù)，培養(yǎng)細胞的污 染，干細胞群或骨抽吸物中不想要的細胞類型的生長，W及維持培養(yǎng)和照顧受傷患者的額 外時間和花費。
[0120] 相反，可W通過與活化劑溫育較短時間將干細胞活化用于移植和骨生長的刺激。 因此，例如，當患者被允許接受骨損傷或疾病的治療時，可W活化自體或異體的干細胞（例 女口，骨髓抽吸物），當當患者進行手術(shù)時，立刻植入活化的干細胞（W及骨移植替代物，如果 所需的話）。
[0121] 本文使用的短語"活化的干細胞"表示干細胞被誘導分化為成骨前體細胞，能夠增 殖并隨后分化為骨形成細胞。該類骨形成細胞包括成骨細胞和成骨組細胞。骨形成細胞可 W通過它們的骨特異性標記物的表達來識別，諸如堿性磯酸酶，骨巧素，骨橋蛋白和BMP受 體。如本文所示，干細胞的活化可W只進行較短時間，例如，5分鐘到24小時的時間段。將 干細胞暴露于活化劑的其他最佳時段是10分鐘到2小時，或15分鐘到1小時。在一些實 施方案中，將干細胞與一種或更多種活化劑接觸5分鐘到1小時，或?qū)⒏杉毎c一種或更多 種活化劑接觸5分鐘到0. 5小時。如本文所述，將骨髓抽吸物暴露于活化劑僅僅1小時就 引起堿性磯酸酶和BMP受體亞單位的表達。
[0122] 因此，本發(fā)明的一個方面是制備用于促進哺乳動物骨生長的植入物的方法。該方 法包括將干細胞暴露于一種或更多種活化劑24小時或更短（例如，約5分鐘到24小時，或 約10分鐘到2小時，或約15分鐘到1小時）W形成活化的干細胞，將活化的干細胞與一種 或更多種活化劑分離W形成基本上不含活化劑的活化干細胞群，并將基本上不含活化劑的 活化干細胞群與骨移植替代物混合，從而制備用于促進哺乳動物骨生長的植入物。
[0123] 將干細胞暴露于足W活化干細胞為成骨或成骨前體表型的濃度的一種或多種活 化劑。本領域技術(shù)人員可W容易的確定該種濃度是什么樣的，例如，通過觀察何種濃度導致 堿性磯酸酶和BMP受體亞單位表達的增加或上調(diào)。合適活化劑濃度的實例包括使用濃度為 約0. Olng/ml到約1 y g/ml的活化劑。在一些實施方案中，活化劑使用的濃度為約0. Ing/ ml 到約 500ng/ml,或約 Ing/ml 到約 lOOng/ml。
[0124] 如本文所述，干細胞可W來自于任何方便的來源。但是，優(yōu)選的是具有成骨潛能或 可W被處理（例如，分化）W產(chǎn)生具有成骨潛能的細胞的干細胞?？捎糜诒疚乃龇椒?， 裝置和植入物的干細胞源包括骨髓，脂肪組織，肌肉組織，廝血，胚胎卵黃囊，胎盤，廝帶，骨 膜，胎兒和青少年皮膚，和血液。在一些實施方案中，干細胞是間充質(zhì)干細胞或包括間充質(zhì) 干細胞的細胞混合物。干細胞可W是自體，異體或異種來源。干細胞可W是自體，異體或異 種來源。干細胞可W是胚胎來源，出生后來源或成人來源。在一些實施方案中，干細胞是自 體或異體的骨髓抽吸物。
[0125] 通常，不需要將干細胞與非干細胞分離，或從其他細胞類型純化活化的（成骨的） 干細胞。但是，如果本領域技術(shù)人員希望從非干細胞純化干細胞，或從未活化的干細胞和其 他細胞類型純化活化的、成骨的干細胞，本領域技術(shù)人員可W通過任何方便的鶴方法該么 做。例如，可W離也骨髓W基于密度將抽吸物成分分離為各種組分，從而獲得富含間充質(zhì)干 細胞的組分。還可W使用識別并結(jié)合活化的成骨干細胞的細胞表面表達的因子（例如，BMP 受體）的抗體，將細胞進行免疫純化。
[0126] 如本文所示，本文所述活化干細胞的方法和裝置中使用的活化劑可W是能夠活化 干細胞成骨潛能的任何活化劑。實例將在本文敘述和說明。
[0127] 當干細胞被活化時，它們開始表達具有成骨祖細胞特征的因子。例如，如本文所 述，堿性磯酸酶（成骨細胞分化的早期標記物，由原代人間充質(zhì)干細胞表達）的水平增加。 參見，例如，圖1，其中與未處理的對照細胞相比，用TGF目3(H角形）或FGF-2(正方形）處 理間充質(zhì)干細胞僅僅1小時就觀察到堿性磯酸酶表達隨時間的增加，表明接受處理的細胞 顯示更有效的分化應答。
[012引在一些實施方案中，使用本文所述方法和裝置的干細胞活化還可W增加BMP受體 亞單位的水平。如本文所述，在暴露于活化劑（Ing/ml, lOng/ml和10化g/ml的PDGF BB, FGF b和TGF beta3)僅僅一（1)小時（圖3)或24小時（圖2)后，原代間充質(zhì)干細胞中3種 BMP受體單位（即BMPR-IA，BMPR-IB和BMPR-II)的mRNA拷貝數(shù)增加。因此，在植入手術(shù) 部位前用活化劑處理干細胞（例如，間充質(zhì)干細胞）僅僅較短時間就可W增強細胞在植入 后對內(nèi)源BMP的更有效應答。
[0129] 通過任何方便的方法將活化干細胞與它們已經(jīng)接觸的一種或多種活化劑分離，從 而形成基本上不含活化劑的活化干細胞群。當包含干細胞的組合物（例如，植入組合物）不 顯示活化劑的副作用（該將阻止干細胞組合物（或植入組合物）的施用）時，干細胞群是基 本上不含活化劑的。因此，少量的活化劑仍可W存在于活化干細胞群（或植入組合物）中， 只要活化劑的量是，例如，小于lOng/ml，或小于Ing/ml，或小于0. Ing/ml或小于0. Olng/ ml O
[0130] 將細胞與小分子和大分子分離的方法是本領域技術(shù)人員可W獲得的。例如，通過 將細胞息浮于培養(yǎng)基或鹽水并通過離也收集細胞來清洗干細胞。數(shù)種該類清洗產(chǎn)生基本上 不含活化劑的活化干細胞群。在另一個實例中，將細胞通過保留活化劑但允許細胞穿過的 柱來將細胞與活化劑分離。該類柱可W具有結(jié)合或保留活化劑的基質(zhì)；例如，所述柱可W是 凝膠過濾柱，親和純化柱，或離子交換柱。
[0131] 因此，可W將活化劑引入溶液中的干細胞源（即，骨髓抽吸物）。在指定溫育時間 后，通過包括過濾，凝膠過濾，免疫沉淀，免疫吸附，柱層析或其組合的方法將活化干細胞與 活化劑分離。例如，利用固定活化劑并允許活化劑從干細胞去除或分離的抗體或結(jié)合蛋白 或膚來去除活化劑。在一些實施方案中，可W通過手術(shù)中的過濾法（諸如切向流動過濾，利 用合適的分子量篩截W允許活化劑從溶液的手術(shù)中去除）從細胞去除溶液中的活化劑。
[0132] 在另一個實施方案中，將分離的干細胞慘入骨移植替代物，然后暴露于本文描述 的活化劑?？蒞利用任何方便的方法將從骨髓干細胞/骨移植替代物的復合物中去除活化 齊U，例如，通過數(shù)輪骨髓干細胞/骨移植替代物的復合物的沉淀W及去除包含活化劑的液 體上清洗涂液。
[0133] 在一些實施方案中，通過使用本文描述的裝置將活化的干細胞與它們已經(jīng)接觸的 一種或更多種活化劑分離。 陽134] 巧于活化干細胸的裝晉
[0135] 本發(fā)明的另一個方面是活化干細胞例如分化為可W刺激骨生長的細胞（例如，成 骨祖細胞，成骨細胞等等）的裝置。該裝置在本文所述方法中的使用允許將干細胞，干細胞 混合物和干細胞組合物（例如，植入組合物）與至少一種活化劑溫育足W活化干細胞的時 間，然后將活化干細胞與至少一種活化劑分離，W產(chǎn)生基本上不含活化劑的活化干細胞和/ 或活化的干細胞組合物。
[0136] 因此，例如，本發(fā)明的一個方面是包括固相支持物和連接到該固相支持物的一種 或更多種活化劑的裝置。活化劑可W直接連接到固相支持物（例如，通過吸附或通過共價 鍵）或活化劑可W間接連接到固相支持物（例如，通過接頭，抗體，膚，適體，焼撐鏈，生物 素-鏈霉親和素，等）。
[0137] 固相支持物可W是任何材料，活化劑可與其直接或間接連接，其中所述材料不結(jié) 合干細胞或不與干細胞不利地相互作用。因此，固相支持物可W是柱基質(zhì)材料，濾器，培養(yǎng) 板，管或平皿，微量滴定板（或微量滴定板的孔），珠子（例如，磁珠），盤，W及與干細胞相 容的其他材料。固相支持物可W從各種材料制備，諸如塑料，纖維素，纖維素衍生物，磁性顆 粒，硝酸纖維素，玻璃，玻璃纖維，膠乳，和其他基質(zhì)材料。如果需要，固相支持物可W用抑制 干細胞結(jié)合或降低固相支持物中材料反應性的物質(zhì)進行包被。
[0138] 可W使用本領域技術(shù)人員已知的各種技術(shù)（該在專利和科學文獻中進行了充分 描述）將活化劑連接到固相支持物。在本發(fā)明的背景下，術(shù)語"連接的"或"連接"表示非 共價結(jié)合，諸如吸附，共價連接（其可W通過活化劑和支持物上功能團之間的直接連接或 可W是通過間接連接）。
[0139] 可W通過將溶于合適緩沖液的活化劑與固相支持物接觸合適量的時間來實現(xiàn)一 些固相支持物材料（例如，塑料）上的吸附。接觸時間隨溫度而變，但通常在約1小時到 約1天。通常，例如，將塑料微量滴定板（諸如聚苯己帰或聚氯己帰）的孔與約IOng到約 10 y g(和優(yōu)選的約10化g到約1 y g)的活化劑量接觸足W固定足夠量的活化劑。
[0140] 活化劑與固相支持物的共價連接通常通過首先將支持物與雙功能試劑反應來實 現(xiàn)，所述雙功能試劑將與支持物與活化劑上的功能團（諸如輕基或氨基）兩者均發(fā)生反 應。例如，利用苯釀或者通過支持物上的酵基與結(jié)合伴侶的胺W及活性氨的縮合，活化劑可 W被共價連接到具有合適聚合物涂層的支持物（參見，例如，Pierce Immunotechnology Catalog and Han化ook, 1991, A12-A13)。雙功能試劑可W是交聯(lián)劑，具有雙功能團的接頭， 膚，焼撐鏈，適體，或其他雙功能分子。
[0141] 活化劑可W通過結(jié)合劑諸如抗體非共價連接到固相支持物，其中抗體連接或吸附 到固相支持物并非共價結(jié)合活化劑?？蛇x的，活化劑可W通過生物素-鏈霉親和素非共價 連接到固相支持物，其中生物素或鏈霉親和素連接到固相支持物。當鏈霉親和素連接到固 相支持物時，生物素連接到活化劑。連接到活化劑的生物素將結(jié)合鏈霉親和素，從而將活化 劑固定到固相支持物上。
[0142] 在一個實例中，包括柱基質(zhì)或過濾材料，活化劑與其共價結(jié)合。然后將干細胞（例 女口，骨髓抽吸物）通過該基質(zhì)一段時間或在該基質(zhì)中溫育一段時間，例如5分鐘到24小時 的時間段，最佳時間段是15分鐘到1小時。
[0143] 對活化劑的該種暴露已經(jīng)顯示增加BMP受體亞單位和堿性磯酸酶表達。例如，圖2 和3說明3種活化劑（PDGF BB，F(xiàn)GF b和TGF-目3)上調(diào)BMPR-IB亞單位，并且在特定濃度， BMPR-IA和BMPR-II亞單位相對于背景增加。對該類活化劑的暴露用于活化或觸發(fā)間充質(zhì) 干細胞W增強成骨細胞表型。
[0144] 因此活化劑可W是FGF b，TGF-目3和/或PDGF BB。在其他實施方案中，固相支 持物上的活化劑包括BMP多膚。其他活化劑可W同樣連接到固相支持物上，例如，本文所列 活化劑的任意一種。活化劑可W來自自體來源，和異體來源，或通過制備得到（例如通過重 組技術(shù)）。
[0145] 數(shù)種或許多活化劑可W連接到相同固相支持物上。例如，普遍接受的是BMPs在異 二聚體（即BMP-2/BMP-7組合）中比在同二聚體制劑（它們目前是商品化供應的）中更有 效。因此，對于本文描述的裝置和方法實施方案來說，活化劑可W連接到固相支持物，隨后 在再植入術(shù)之前分離。因此，在本文描述的現(xiàn)有設備和方法的使用中，對于使用多種活化劑 的可能性具有增加的靈活性。
[0146] 在一些實施方案中，裝置適于將植入組合物暴露于一種或更多種活化劑選定的時 間（例如，24小時或更少，和/或本文描述的其他時間），W便活化植入組合物中的干細胞。 該類裝置適于將植入組合物與本文描述的至少一種活化劑溫育，然后允許活化劑與植入組 合物的分離。因此，植入材料（例如，骨移植替代物）和植入組合物內(nèi)的干細胞保留在裝置 中，而活化劑被去除。裝置的使用產(chǎn)生基本上不含活化劑的植入組合物。
[0147] 該裝置因此包括將干細胞和/或骨移植替代物與活化劑分離的工具。例如，該裝 置可W包括濾器，其排除較大的材料諸如干細胞和/或骨移植替代物，但允許溶液中的活 化劑穿過過濾材料，從而將干細胞和/或骨移植替代物與活化劑分離。在將植入組合物與 活化劑溫育后，將容納植入組合物和活化劑的溫育室引流并用合適的介質(zhì)（例如，緩沖液， 鹽水，緩沖鹽水，培養(yǎng)基）清洗。因此，該裝置可W產(chǎn)生包含活化干細胞并且基本上不含活 化劑的干細胞組合物（例如，植入組合物）。
[0148] 本文描述的裝置還可W包括用于控制干細胞與至少一種活化劑溫育時間的計時 器。例如，在溫育步驟（i)后計時器可W觸發(fā)至少一種活化劑與干細胞的分離。因此，例如， 計時器可W起始包含至少一種活化劑的溶液的引流或去除。此外，或可選的，計時器可W起 始溶液的添加W清洗干細胞和/或骨移植替代材料。在一些實施方案中，具有計時器的裝 置控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為24小時或更短。在其他實施方案中，具有計 時器的裝置控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分鐘到1小時。
[014引 枯入物
[0150] 在一個實施方案中，將如本文所述制備的活化干細胞（例如，骨髓抽吸物）與合成 骨移植替代物（諸如beta磯酸H巧化eta-TCP)) W形成植入組合物。在一個實例中，在組 織移植處使用活化干細胞（例如，活化的骨髓抽吸物）和合成骨移植替代物的混合物?？?W在通過暴露于活化劑將干細胞活化之前或之后，將干細胞與合成骨移植替代物組合。但 是，在移植前，將干細胞暴露于活化劑或接觸活化劑W便植入組合物中的干細胞是活化干 細胞。
[0151] 骨移植替代物可W是固體材料，當在合適條件下將其放置于活性骨中或其附近 時，固體材料可W作為通過骨形成活化干細胞形成新骨的支架?？蒞使用的骨移植替代物 的實例描述于美國專利號5, 383, 931 ;6, 461，632 ;7, 044, 972 ;7, 494, 950 ;和美國申請公開 號20060008504,其中每篇均在此完整具體引入作為參考。
[0152] 骨移植替代物可W包括含巧鹽的成分。例如，骨移植替代物可W包括一水合磯酸 一巧，a-磯酸H巧，碳酸巧，脫礦質(zhì)骨，磯酸軸鹽和，任選的，多聚體。多聚體可W是可吸收 的多聚體。在一些實施方案中，多聚體包括同聚體或共聚纖維，它們具有不超過約15mm的 纖維長度，約50:1到約1000:1的長寬比，或兩者（和任選的還包括連續(xù)的強化纖維）。
[015引多聚體可W是膠原，明膠，透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸鹽，輕丙基纖維素她C)，駿甲基纖 維素（CMC)，輕丙基甲基纖維素（HPMC)，輕己基纖維素她C)，黃原膠，瓜耳豆膠，和/或藻酸 丈h ITTT. O
[0154] 可W使用的骨移植替代物的實例包括，但不限于，beta-TCP(例如，Synthes制備 的ChronO巧，膠原，生物玻璃（例如，45S5生物玻璃），Bio化S (基于磯酸巧的骨移植替代 物），P巧gen P-15(結(jié)合天然形式的輕磯灰石的合成P-15膚）和AlloGraft (脫礦質(zhì)骨基 質(zhì)，基于異源移植的骨移植替代物）。
[0巧5] 通常，將活化干細胞與骨移植替代物溫育或混合W形成植入組合物。在一些實施 方案中，植入組合物是漿（putty);在其他實施方案中，植入組合物是足W流過注射器針頭 的液體。例如，植入組合物可W具有約0. 3到約0. 0或約0. 41到約0. 55的液體成分與固 體成分的比例。
[0156] 另一個實施方案包括在體外使用活化劑W及干細胞源炬MA)較短時間（即，5分鐘 到60分鐘）W便刺激干細胞進入成骨細胞途徑。在體外溫育后，將干細胞和活化劑的組合 一起植入。 。157] 治巧方法
[015引包含活化干細胞和骨移植替代物的植入組合物可用于修復和治療骨損傷，病癥或 疾病。該類骨損傷，病癥或疾病的特征在于骨丟失（骨量減少或骨質(zhì)溶解）或骨破壞或損 傷。該類骨損傷、病癥或疾病包括但不限于斷裂的骨，骨缺陷，骨移植物，骨移植，骨癌，關節(jié) 替換，關節(jié)修復，融合，小平面修復，骨退化，牙齒植入和修復，源于疾病的骨缺陷（例如，關 節(jié)炎），源于重建手術(shù)的骨缺陷，和與骨和骨組織有關的其他疾病。骨缺陷的實例包括但不 限于骨的間隙，變形或不結(jié)合的骨折。骨退化的實例包括但不限于骨量減少或骨質(zhì)疏松癥。 在一個實施方案中，骨缺陷源于誅儒癥。組合物還可用于關節(jié)替換或修復，其中所述關節(jié)是 脊椎，膝，臀部，酣骨，指骨，肘，踩，紙骼的關節(jié)或其他關節(jié)聯(lián)接/非關節(jié)聯(lián)接的關節(jié)。
[0159] 可W通過將組合物壓入或慘入骨部位，或注射植入組合物，來施用所述植入組合 物。當通過注射施用時，注射器可W具有約12到約ISgauge的針頭，其中使用的最大注射 壓力不超過約40磅。在一個實施方案中，所述組合物還包括連續(xù)的強化纖維。
[0160] 下列非限制性的實施例進一步說明本發(fā)明的一些方面。
[0161] 實施例1 :材料和方法
[0162] 使用下列材料和方法實施本發(fā)明的一些方面。 陽16引 細胸的分仆^
[0164] 將傳代3次的人間充質(zhì)干細胞（Lonza，Wa化ersville，MD)按照6X104細胞/35mm 孔的密度種于基礎培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies, Vancouver,Canada),并在 37°C 溫 育2天。將細胞用PBS清洗，并用溶于新鮮基礎培養(yǎng)基的l(K)ng/ml生長因子（FGF-2或 TGF目3, R&D Systems, Minneapolis, MN)活化1小時，用PBS清洗，然后在新鮮基礎培養(yǎng)基或 成骨分化培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada)中 37°C溫育 7-14 天。 陽1巧]連時PCR
[016引 利用 RNeasy Plus Mini Kit 和 QIA S虹edder Mini Spin 柱（Qiagen)從用各種 活化劑處理的細胞中制備總RNA。還從未處理的細胞制備總RNA作為對照。通過化qMan Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems)使用隨機六聚物和 Oligo dT 產(chǎn)生 cDNA。用于實時的引物和探針組如下：
[0167] huBMPRlA_2 fwd (沈Q ID N0:1) :5'-TAACCAGTATTTGCAACCCACACT-3'.
[016引 huBMPRlA_2 rev (沈Q ID N0:2) :5'-GAGC AAAACC AGCC ATCGAA-3'.
[0169] huBMPRlA_2 探針（SEQ ID N0:3) :5'-CCC CCT GTT GTC ATA GGT CCG TTT TTT GAT-3' （FAM/TAMRA).
[0170] huBMPRlB_l fwd (沈Q ID N0:4) :5'-CCA AAG GTC TTG CGT TGT AAATG-3'.
[017。 huBMPRlB_l rev (沈Q ID N0:5) :5'-CAT CGT GAA ACAATA TCC GTCTGT-3'.
[0172] HuBMPRIB_l 探針（SEQ ID NO :6) : 5'-CCA CCA TTG TCC AGA AGA CTC AGT CAA CAA-3' （F AM/TAMRA).
[0173] huBMPR2_2 fwd (沈Q ID NO: 7) : 5' -TGC CCT GGC TAC CAT GGA-3'
[0174] huBMPR2_2 rev (沈Q ID N0:8) :5'-CGC ACA TAG CCGTTCTTGATT-3'
[01 巧]huBMPR2_2 探針（SEQ ID NO :9) : 5'-TCA GCA CTG CGG CTG CTT COGS'（F AM/ TAMRA)
[0176]在Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System中進行樣品的多重反 應，利用 beta 2 小球蛋白內(nèi)源對照（VIC/T AMRA) (Applied Biosystems)。 陽177] 堿巧磯酸酶測定
[0178] 將傳代3次的人間充質(zhì)干細胞（Lonza，Wa化ersville，MD)按照6X104細胞/35mm 孔的密度種于基礎培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies, Vancouver,Canada),并在 37°C 溫 育2天。將細胞用PBS清洗，并用溶于新鮮基礎培養(yǎng)基的l(K)ng/ml生長因子（FGF-2或 TGF目3, R&D Systems, Minneapolis, MN)活化1小時，用PBS清洗，然后在新鮮基礎培養(yǎng)基或 成骨分化培養(yǎng)基（StemCell Technologies, Vancouver, Canada)中 37°C溫育 7-14 天。測定 時，將細胞用PBS清洗兩次，收集于100 y l/35mm孔裂解緩沖液，并在液氮中凍融兩次。通 過將20 y 1裂解物與20 y 1 lmg/ml/7-硝基苯基磯酸鹽溫育3分鐘并測量405皿產(chǎn)生的發(fā) 光來確定堿性磯酸酶活性。根據(jù)切如ant (Invitrogen, Carlsbad, CA) DNA定量確定的細胞 濃度將堿性磯酸酶活性歸一化。
[0179]
[0180] 對于初步研究，如下將活化劑（例如生長因子）固定到微量滴定孔上。
[0181] 將生物素化的抗生長因子抗體巧00 ng) (R&D Systems, Minneapolis, MN)在包 被鏈霉親和素的96孔板的200 y 1 PBS/孔中溫育30分鐘，用PBS清洗3次，然后與溶于 200 y IPBS的量不斷增加的生長因子結(jié)合30分鐘。用PBS清洗3次后，通過與溶于200 y 1 PBS (含0. 1 % BSA) 1 y g未標記的抗生長因子二抗溫育30分鐘來檢測生長因子的存在?？?用PBS清洗3次，與溶于200 y 1 PBS (含0. 1 % BSA)的1 y g偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗溫 育30分鐘，再用PBS清洗3次。然后將固定的抗體-生長因子-二抗與200 y 1增強的化 學發(fā)光底物溫育1分鐘。通過測量可見光波長的化學發(fā)光發(fā)射來定量固定的偶聯(lián)辣根過氧 化物酶的二抗的量。 陽18引 活巧測定
[0183] 為了在干細胞活化步驟前確定栓系活化劑的生物活性，進行下列測定。對于包括 FGF-2 的研究，將 Swiss A化ino 3T3 細胞（ATCC, Manassas, VA)按照 4X 105/35mm 孔的密 度種于10%血清基礎培養(yǎng)基，37C溫育1天，用PBS清洗3次，然后在37C 0. 5%血清基礎 培養(yǎng)基中同步化1天。將FGF2 (R&D Systems, Minneapolis, MN)和50倍過量的生物素化抗 FGF2抗體（R&D Systems, Minneapolis, MN)在0. 5%血清基礎培養(yǎng)基中復合15分鐘。將同 步化細胞用PBS清洗3次，然后用FGF2/生物素化的抗FGF2抗體復合物在37C處理30分 鐘。在測定的終點，將細胞用PBS清洗3次，收集到SDS樣品緩沖液，并在9(TC加熱10分 鐘。通過SDS-PAGE分離所獲裂解物，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用抗磯酸E服抗體（Cell Signaling Technology, Beverly, MA)的1:10000稀釋物，繼之W偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗（Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)的1:10000稀釋物順序檢測。通過暴露于增強的化 學發(fā)光底物1分鐘，CCD照相機顯像和利用ImageJ分析程序進行密度測量定量來確定辣根 過氧化物酶活性。
[0184] 對于TGF目3活性測J定，將MvlLu貂肺細胞（ATCC，Manassas，VA)按 照96孔板4X 1〇3細胞/孔的密度種于基礎培養(yǎng)基，并在37 C溫育1天。將 TGF目3 (R&D Systems, Minneapolis, MN)和50倍過量的生物素化抗TGF目3抗體（R&D Systems, Minneapolis, MN)在0. 5%血清基礎培養(yǎng)基中復合15分鐘。用PBS清洗3次后，將 細胞用TGF目3/生物素化的抗TGF目3抗體復合物在37C處理3天。在測定時，向TGF目3 處理培養(yǎng)基中添加CellTiter-Glo ATP檢測試劑（Promega，Madison, WI)，溫育5分鐘，通過 測量可見光波長的化學發(fā)光發(fā)射來定量細胞數(shù)目。
[0185] 實施例2 :結(jié)果
[0186] 原代人間充質(zhì)干細胞能夠沿著成骨細胞系分化。該通過在成骨混合物（包含，但 不限于，地塞米松，抗壞血酸和目-甘油磯酸鹽）中培養(yǎng)細胞在體外得到證明。在該種培養(yǎng) 條件下細胞顯示成骨細胞分化標記物（其最常見的是早期標記物堿性磯酸酶）的上調(diào)。
[0187] 圖1顯示從第10到12天，未處理的間充質(zhì)干細胞（圓）中堿性磯酸酶活性的輕微 上調(diào)，與預期一致。但是，當間充質(zhì)干細胞用TGF目3 ( H角形）或FGF-2(正方形）預處理 1小時，然后除去分化培養(yǎng)基中的試劑和培養(yǎng)基，堿性磯酸酶活性的水平顯著增加2-3倍。
[0188] 該些數(shù)據(jù)表明在第0天用TGF目3或FGF-2處理間充質(zhì)干細胞僅僅1小時就能夠 影響成骨細胞分化，該樣的話成骨細胞形成的標記物在處理后10+天被上調(diào)。
[0189] 間充質(zhì)干細胞在體外和體內(nèi)均對骨形態(tài)發(fā)生蛋白產(chǎn)生應答W誘導成骨細胞表型。 BMPs通過由3個亞單位炬MPR-IA，BMPR-IB和BMPR-II)組成的受體復合物起作用。當用 挑選的活化劑（PDGF-BB，TG訊eta3和FGF-2)處理MSCs 24小時時，BMPR-EB基因的相對拷 貝數(shù)相對于未處理的細胞顯著增加。但是，圖3顯示在處理后僅僅1小時觀察到類似的應 答。
[0190] 該些數(shù)據(jù)表明僅僅1小時的手術(shù)間隙足W用活化劑處理MSCs,該樣的話BMP配體 的受體水平相對未處理的細胞將增加。間充質(zhì)干細胞上BMP受體增加水平的存在增強了該 些細胞的體內(nèi)BMP-2成骨應答，從而導致更有效的骨治愈。
[0191] 本文參考或提及的所有專利和出版物顯示本發(fā)明相關領域技術(shù)人員的技術(shù)水平， 因此將各種該類參考專利或出版物特別引入按照相同程度進行參考，就像它是分別單獨完 整引入作為參考或在本文完整闡述一樣。 申請人:保留將來自任何引用的該類專利或出版物 的任意和全部材料和信息實際整合入本說明書的權(quán)利。
[0192] 本文描述的具體方法和組合物代表優(yōu)選的實施方案，只是示例性的，而非旨在限 制本發(fā)明的范圍。在考慮本說明書后本領域技術(shù)人員將清楚其他目的，方面和實施方案，該 也包括在權(quán)利要求范圍限定的本發(fā)明精神之內(nèi)。本領域技術(shù)人員顯而易見的是，在不脫離 本發(fā)明范圍和精神的情況下可W對本文公開的發(fā)明進行各種不同的取代和改變。本文說明 性描述的發(fā)明可W在沒有任何元件或限制（其沒有被本文具體公開是重要的）的條件下合 適的實施。本文說明性描述的方法和過程可W按照不同的步驟順序?qū)嵤?，而且它們無需局 限于本文或權(quán)利要求所述的步驟順序。當在本文和所附權(quán)利要求中使用時，單數(shù)形式"一個 (a)"、"一個（an)"和"the"包括復數(shù)含義，除非上下文明確另外規(guī)定。因此，例如，"一種抗 體"的含義包括多種（例如，抗體溶液或一系列抗體制品）該類抗體，等等。在任何情況下 該專利都不能被解釋為限于本文具體公開的特定實施例或?qū)嵤┓桨富蚍椒?。在任何情況下 該專利都不能被解釋為受到專利與商標局（Patent and Trademark 0巧Ce)的任何審查員 或任何其他公務員或雇員的任何聲明的限制，除非該類聲明是具體和無條件的或在 申請人: 的回復文字中明確采用的保留意見。
[0193] 使用的術(shù)語和表述被用做說明書的術(shù)語而非限制，使用該類術(shù)語和表述沒有意圖 來排除顯示和描述的特征的任何等同物或其部分，但是應承認各種改變也可能在要求的本 發(fā)明范圍內(nèi)。因此，應理解盡管本發(fā)明已經(jīng)被優(yōu)選的實施方案和可選的特征具體公開，但是 本領域技術(shù)人員可W使用本文公開概念的改變和變化，而且該類改變和變化被認為屬于所 附權(quán)利要求和本發(fā)明聲明所限定的本發(fā)明范圍。
[0194] 本文已經(jīng)大致和一般性的描述了發(fā)明。屬于一般性內(nèi)容內(nèi)的更小的各個種類和亞 屬群組也形成本發(fā)明的一部分。該包括從所述種類排除任何主題的限制（proviso)或負限 制的本發(fā)明種類描述，不管排除的材料是否在本文具體敘述。
[0195] 其他實施方案在下列權(quán)利要求范圍內(nèi)。此外，當按照Markush組描述本發(fā)明的特 征或方面時，本領域技術(shù)人員應意識到還按照Markush組成員的任何單獨成員或亞組來描 述本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1. 一種用于活化干細胞的裝置，包括固相支持物和至少一種促進干細胞分化為成骨細 胞或成骨前體細胞的活化劑，其中所述裝置適于：（i)將干細胞與所述至少一種活化劑溫 育，和（ii)在溫育步驟（i)后將所述至少一種活化劑與干細胞分離。
2. 權(quán)利要求1的裝置，其中至少一種活化劑選自轉(zhuǎn)化生長因子beta(TGF-P)，成纖維 細胞生長因子（FGF)，血小板衍生生長因子（PDGF)，骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)，胰島素生長因 子（IGF)，白介素-l(IL-l)，白介素-ll(IL-ll)，斯伐他汀，地塞米松，氧甾酮，音猬因 子，干擾素，腫瘤壞死因子，神經(jīng)生長因子（NGF)，纖連蛋白，RGD肽，整合素，表皮生長 因子（EGF)，肝細胞生長因子（HGF)，角質(zhì)形成細胞生長因子，成骨蛋白，及其組合。
3. 權(quán)利要求1或2的裝置，其中至少一種活化劑選自BMP-2, TGF-beta3, PSGF-AB，PD GF-BB, FGF-2, TGF-betal, BMP-4, BMP-7, BMP-6, FGF-8, IL-11,斯伐他汀，地塞米松，氧甾 酮，音猬因子及其組合。
4. 權(quán)利要求1，2或3的裝置，其中至少一種活化劑包括TGF- 0和FGFb。
5. 權(quán)利要求4的裝置，其中至少一種活化劑還包括TOGF。
6. 權(quán)利要求1-5中任意一項的裝置，其中至少一種活化劑位于溶液中。
7. 權(quán)利要求1-5中任意一項的裝置，其中將至少一種活化劑連接到固相支持物。
8. 權(quán)利要求1-7中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括柱基質(zhì)材料，濾器，培養(yǎng) 板，管或平皿，長頸瓶，微量滴定板，珠子，盤，或其組合。
9. 權(quán)利要求1-8中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括塑料，纖維素，纖維素衍 生物，磁性顆粒，硝酸纖維素，玻璃，玻璃纖維，膠乳，或其組合。
10. 權(quán)利要求1-9中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括親和基質(zhì)以去除至少 一種活化劑。
11. 權(quán)利要求1-10中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括，與至少一種活化劑 結(jié)合的，鏈霉親和素，生物素，交聯(lián)劑，抗體或肽。
12. 權(quán)利要求1-11中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括容器。
13. 權(quán)利要求1-12中任意一項的裝置，其中所述固相支持物包括濾器。
14. 權(quán)利要求13的裝置，其中所述濾器保留細胞和骨移植替代材料但允許至少一種活 化劑穿過。
15. 權(quán)利要求13的裝置，其中所述濾器保留至少一種活化劑但允許干細胞穿過。
16. 權(quán)利要求1-15中任意一項的裝置，其中所述固相支持物材料不結(jié)合干細胞或不會 與干細胞發(fā)生不利地相互作用。
17. 權(quán)利要求1-16中任一項的裝置，其中所述干細胞是出生后干細胞或成人干細胞， 其中所述干細胞來自于骨髓，脂肪組織，肌肉組織，臍血，胚胎卵黃囊，胎盤，臍帶，骨膜，胎 兒皮膚，青少年皮膚，或血液。
18. 權(quán)利要求1-17中任意一項的裝置，其中所述干細胞包括間充質(zhì)干細胞。
19. 權(quán)利要求1-18中任意一項的裝置，其中所述干細胞包括自體骨髓抽吸物。
20. 權(quán)利要求1-19中任意一項的裝置，還包括用于控制干細胞與至少一種活化劑溫育 時間的計時器。
21. 權(quán)利要求20的裝置，其中在溫育步驟（i)后計時器觸發(fā)至少一種活化劑與干細胞 的分離。
22. 權(quán)利要求20的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為24小 時或更短。
23. 權(quán)利要求20的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分 鐘到1小時。
24. 權(quán)利要求20的裝置，其中計時器控制干細胞與至少一種活化劑的溫育時間為5分 鐘到0. 5小時。
25. 權(quán)利要求1的裝置，其中至少一種活化劑通過共價粘附，吸附，非共價相互作用和/ 或其組合而連接到固相支持物。
26. 權(quán)利要求1的裝置，其中至少一種活化劑通過接頭，抗體，肽，適體，烷撐鏈，生物 素-鏈霉親和素或其組合而連接到固相支持物。
27. 用于骨形成的裝置，包括用于處理干細胞源的第一部件；和用于以有效刺激干細 胞源中間充質(zhì)干細胞分化為成骨細胞的方式將干細胞源暴露于活化劑的第二部件。
28. 權(quán)利要求27的裝置，其中所述干細胞源是從患者抽取的骨髓抽吸物。
29. 權(quán)利要求27的裝置，還包括至少一種活化劑。
30. 權(quán)利要求28的裝置，還包括將骨移植替代物和從患者抽取的骨髓抽吸物混合以形 成混合物的部件。
31. 權(quán)利要求27的裝置，其中骨髓抽吸物在暴露于至少一種活化劑之后與所述活化劑 分開。
【文檔編號】C12N5/077GK104357381SQ201410589910
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2009年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2008年10月31日
【發(fā)明者】梅里迪斯.漢斯, 道格.比克特, 埃里奧特.格魯斯金, 斯蒂芬.豪恩斯比, 梅里薩.布朗 申請人:辛西斯有限責任公司