本發(fā)明涉及基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體是進行mtrr基因a66g多態(tài)性位點的分型檢測方法。

背景技術(shù)：

葉酸屬于水溶性b族維生素，在核酸和蛋白質(zhì)的生物合成中起重要的作用，是細胞增殖和機體發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)。中國是新生兒出生缺陷的高發(fā)國家之一，其中葉酸缺乏是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因。機體葉酸缺乏主要有兩方面原因：一是葉酸攝入不足，二是基因缺陷導(dǎo)致機體對葉酸利用效率低，即葉酸代謝障礙。

mtrr全稱甲硫氨酸合成酶還原酶，它是維持甲硫氨酸合成酶活性的關(guān)鍵酶，甲硫氨酸合成酶在葉酸代謝與dna甲基化中起重要作用。甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲基氨酸合成酶。mtrr基因突變是造成葉酸/甲基維生素缺乏的主要原因，也是同型半胱氨酸、葉酸代謝異常的主要病因之一。其中，mtrr基因常見突變位點a66g突變，使甲硫氨酸被異亮氨酸替代，導(dǎo)致甲硫氨酸合成酶還原酶活性顯著降低。因而mtrr基因缺陷的孕婦人群尤其需要補充葉酸，檢測孕婦人群甲硫氨酸合成酶mtrr基因a66g突變位點，可為個體化補充葉酸，預(yù)防新生兒出生缺陷提供科學依據(jù)。

目前，基因多態(tài)性檢測的方法主要有最常用的基因多態(tài)性檢測方法為測序法，該方法優(yōu)勢是可以同時進行高通量多位點的檢測，但其操作復(fù)雜耗時長且靈敏度低，容易出現(xiàn)樣本間交叉污染且不能實現(xiàn)樣本的快速檢測；高分辨率溶解曲線法快速、簡便、經(jīng)濟實用，但是它對儀器要求高，需要具有安裝高分辨率軟件、溫度比較敏感的機器才能使用，臨床推廣存在困難。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種重復(fù)性好、靈敏度高的進行mtrr基因a66g多態(tài)性位點的分型檢測方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

進行mtrr基因a66g多態(tài)性位點的分型檢測方法，是采用mtrr基因特異性的引物seq1和seq2擴增mtrr基因片段，同時在mtrr基因特異性的引物界定的擴增區(qū)域內(nèi)設(shè)計mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位點為a則mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認位點為a；若位點為g則mtrr基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述mtrr基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-tgaggaggtttctgttacta-3′；

所述mtrr基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-ctgcagaaaatccatgta-3′；

所述mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ccatcgcagaagaaatatgt-3′；

所述mtrr基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-ccatcgcagaagaaatgt-3′。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型的方法，采用mtrr特異性的基因擴增和taqman探針，本發(fā)明基于taqman探針定量pcr方法進行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中人mthfr-rs1801394位點aa基因型特異性片段擴增曲線示意圖。

圖2為本發(fā)明實施例中人mthfr-rs1801394ag基因型特異性片段擴增曲線示意圖。

圖3為本發(fā)明實施例中人mthfr-rs1801394位點gg基因型特異性片段擴增曲線示意圖。

圖4為本發(fā)明實施例中人mthfr-rs1801394位點的檢測結(jié)果分布示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。

請參閱圖1-4，進行mtrr基因a66g多態(tài)性位點的分型檢測方法，是采用mtrr基因特異性的引物seq1和seq2擴增mtrr基因片段，同時在mtrr基因特異性的引物界定的擴增區(qū)域內(nèi)設(shè)計mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a和seq4-vic-g；若位點為a則mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a釋放fam熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認位點為a；若位點為g則mtrr基因特異性taqman探針seq4-vic-g釋放vic熒光信號而被定量pcr儀器檢測確認位點為g，最終通過fam/vic信號的比值來判斷位點基因型；

所述mtrr基因特異性的引物seq1的核苷酸序列號如下：

5′-tgaggaggtttctgttacta-3′；

所述mtrr基因特異性的引物seq2的核苷酸序列號如下：

5′-ctgcagaaaatccatgta-3′；

所述mtrr基因特異性taqman探針seq3-fam-a的核苷酸序列號如下：

fam-5′-ccatcgcagaagaaatatgt-3′；

所述mtrr基因特異性taqman探針seq4-vic-g的核苷酸序列號如下：

vic-5′-ccatcgcagaagaaatgt-3′。

實施例：

（1）測試用正常人基因組dna制備：

采取正常人口腔咽拭子，chlex100抽提制備，正常人基因組dna濃度稀釋到10ng/μl。

（2）pcr特異性引物和探針設(shè)計合成：

根據(jù)人mtrr基因序列設(shè)計合成基因特異性引物seq1，seq2和mtrr特異性taqman基因探針標記seq3-fam-a和seq4-vic-g。

（3）mtrr定量pcr檢測：

1）引物探針混合物配置：

2）反應(yīng)體系：引物探針混合物1.5μl，2倍tiantoughgenotypingqpcrpremix(probe)12.5μl，標準模板1.5μl，ddh2o9.5μl。

3）定量pcr儀：abi7500。

4）反應(yīng)條件：95℃、2min；95℃、15s——60℃、32s，42循環(huán)。

（4）基因驗證結(jié)果讀?。?/p>

參見圖1，圖1中橫坐標是以0-42的偶數(shù)標示的循環(huán)數(shù)，縱坐標是相應(yīng)的熒光信號，檢測到vic、fam信號確定為擴增成功。根據(jù)樣本fam/vic比值確定具體樣本的基因型。

本發(fā)明是基于基因特異性pcr結(jié)合taqman探針判斷基因snp位點分型的方法，采用mtrr特異性的基因擴增和taqman探針，本發(fā)明基于taqman探針定量pcr方法進行目的基因分型檢測具有簡便快捷，重復(fù)性高，靈敏度高，特異性好的特點。

上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下作出各種變化。