本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種花楸樹est-ssr標(biāo)記、其引物對及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

簡單重復(fù)序列(simplesequencerepeat，ssr)又稱微衛(wèi)星標(biāo)記，是由1～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單元組成的一類dna序列。ssr標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，是目前最具應(yīng)用價(jià)值的分子標(biāo)記之一，廣泛應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)、動(dòng)物、植物及微生物的學(xué)科領(lǐng)域。然而，ssr標(biāo)記物種特異性一定程度上限制了其引物的通用性，對基因序列未知的物種而言，ssr標(biāo)記的開發(fā)較為困難。傳統(tǒng)ssr標(biāo)記開發(fā)以基因文庫構(gòu)建法(包括ssr富集文庫)為主，其實(shí)驗(yàn)過程繁雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、效率較低。ssr標(biāo)記還可以利用公共基因數(shù)據(jù)庫(ncbi，embl，ddbj)中的共享序列來設(shè)計(jì)開發(fā)，但對于非模式生物或新物種來說，有限的基因序列資源依然是ssr標(biāo)記開發(fā)的瓶頸。2005年以來，第二代高通量測序技術(shù)的發(fā)展為規(guī)?；z傳變異檢測和標(biāo)記位點(diǎn)開發(fā)帶來了新機(jī)遇。如何利用高通量測序數(shù)據(jù)高效、快速地開發(fā)ssr標(biāo)記位點(diǎn)，成為當(dāng)前分子遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

ssr根據(jù)來源不同可分為基因組ssr(genomicsssr,gssr)和表達(dá)序列標(biāo)簽ssr(expressedsequencetagssr,est-ssr)。est數(shù)據(jù)來源于基因的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，其多態(tài)性可能與基因功能直接相關(guān)，因此，est-ssr比gssr標(biāo)記具有更高通用性。目前，基于轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行ssr標(biāo)記引物開發(fā)在穗花杉(amentotaxusspp.)、金錢槭(dipteroniaspp.)、落羽杉(taxodium‘zhongshansa’)、杜仲(eucommiaulmoides)、紅松(pinuskoraiensis)、杉木(cunninghamialanceolata)、以及南方紅豆杉(taxuschinensisvar.mairei)等林木上得到有效應(yīng)用。此外，基于dna測序儀為平臺的熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳技術(shù)為ssr標(biāo)記提供了高效自動(dòng)化檢測方法，研究表明該技術(shù)檢測效率，結(jié)果更為精確靈敏，已在楊樹(populusspp.)、桃樹(prunuspersica)、薔薇屬(rosal.)等樹種上得到證實(shí)。

花楸樹(sorbuspohuashanensis)為薔薇科(rosaceae)蘋果亞科(maloideae)花楸屬(sorbus)落葉小喬木，又名百花花楸，其果實(shí)稱“花楸果”，是一種重要的觀葉、觀花、觀果樹種，具有極高的園林及生態(tài)價(jià)值。早在《中華本草》就有記載：花楸果具有止咳化痰，健脾利水的功效。現(xiàn)代研究表明，花楸樹中含有較豐富的黃酮、花青素、生氰苷、醌等成分，具有強(qiáng)抗氧化、抗癌、抗輻射和止咳平喘等藥理作用。近年來，花楸樹因其獨(dú)具魅力的觀賞價(jià)值日益受到人們的喜愛，市場上對其新品種的需求也十分迫切。然而，目前關(guān)于花楸樹的研究大多集中在種群天然更新、群體交配系統(tǒng)、苗期形狀地理種源變異、人工繁育技術(shù)以及引種馴化等方面，對于該物種的遺傳多樣性研究主要局限于同工酶等生化標(biāo)記技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及est-ssr標(biāo)記和用于擴(kuò)增est-ssr標(biāo)記的引物。本發(fā)明的est-ssr標(biāo)記可用于分子基因分型和/或遺傳指紋圖譜構(gòu)建。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定植物樣品基因型的方法，包括：

1)、提取所述植物樣品的dna；

2)、用選自下列的至少一個(gè)引物對擴(kuò)增至少一種est-ssr標(biāo)記：seqidno:1和2；seqidno:3和4；seqidno:5和6；seqidno:7和8；seqidno:9和10；seqidno:11和12；seqidno:13和14；seqidno:15和16；seqidno:17和18；seqidno:19和20；seqidno:21和22；seqidno:23和24；seqidno:25和26；seqidno:27和28；seqidno:29和30；

或擴(kuò)增各引物對對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的片段或變體；及

3)、鑒定所述植物樣品中的至少一種多態(tài)等位基因。

在一些實(shí)施方式中，所述植物樣品的dna的提取方法包括飽和苯酚-氯仿法、樹脂提取法或磁珠提取法提取。

優(yōu)選的，如上所述的方法，其中步驟2)包括用對應(yīng)引物對擴(kuò)增2種或更多est-ssr標(biāo)記；

更優(yōu)選的，其中步驟2)包括用對應(yīng)引物對擴(kuò)增3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15種est-ssr標(biāo)記。根據(jù)特定實(shí)施方式，分析全部15種標(biāo)記的多態(tài)性。各擴(kuò)增反應(yīng)可獨(dú)立地實(shí)施，或2種或更多ssr標(biāo)記的擴(kuò)增可在單個(gè)反應(yīng)中一起實(shí)施(多重pcr)。

優(yōu)選的，如上所述的方法，在步驟2)中，用所述引物對擴(kuò)增至少一種est-ssr標(biāo)記時(shí)，除seqidno:21和22的退火溫度為56℃～60℃外，其余引物對的退火溫度均為50℃～64℃。

具體的，所述方法包括：

用對應(yīng)引物對擴(kuò)增15種est-ssr標(biāo)記中的每一種；及自15種擴(kuò)增產(chǎn)物中的每一種鑒定樣品中的至少一種多態(tài)等位基因。

本發(fā)明的分子基因分型和/或遺傳指紋方法可用于：

(i)鑒定植物種群中的相同或相關(guān)基因型；

(ii)鑒定植物等位基因多態(tài)性和區(qū)分植物種群中的植物變體；或者

(iii)研究植物種群中的遺傳多樣性。

例如，可對相關(guān)的植物基因型進(jìn)行分類。鑒定相關(guān)的植物基因型也包括親子關(guān)系鑒定。

盡管本發(fā)明的est-ssr標(biāo)記從花楸樹(sorbuspohuashanensis)得到，但它們可應(yīng)用于花楸屬(sorbus)植物的分子基因分型；優(yōu)選的，前述任一項(xiàng)所述的方法及應(yīng)用，所述植物包括但不僅限于水榆花楸s.alnifolia、黃山花楸s.amabilis、銳齒花楸s.arguta、毛背花楸s.aronioides、多變花楸s.astateria、美脈花楸s.caloneura、冠萼花楸s.coronata、白葉花楸s.cuspidata、北京花楸s.discolor、棕脈花楸s.dunnii、附生花楸s.epidendron、麻葉花楸s.esserteauiana、銹色花楸s.ferruginea、纖細(xì)花楸s.filipes、石灰花楸s.folgneri、圓果花楸s.globosa、球穗花楸s.glomerulata、疣果花楸s.granulosa、巨葉花楸s.harrowiana、鈍齒花楸s.helenae、江南花楸s.hemsleyi、湖北花楸s.hupehensis、卷邊花楸s.insignis、毛序花楸s.keissleri、俅江花楸s.kiukiangensis、陜甘花楸s.koehneana、大果花楸s.megalocarpa、泡吹葉花楸s.meliosmifolia、維西花楸s.monbeigii、多對花楸s.multijuga、賓川花楸s.obsoletidentata、褐毛花楸s.ochracea、少齒花楸s.oligodonta、灰葉花楸s.pallescens、花楸樹s.pohuashanensis、侏儒花楸s.poteriifolia、西康花楸s.prattii、蕨葉花楸s.pteridophylla、臺灣花楸s.randaiensis、鋪地花楸s.reducta、西南花楸s.rehderiana、鼠李葉花楸s.rhamnoides、紅毛花楸s.rufopilosa、晚繡花楸s.sargentiana、梯葉花楸s.scalaris、四川花楸s.setschwanensis、太白花楸s.tapashana、康藏花楸s.thibetica、滇緬花楸s.thomsonii、天山花楸s.tianschanica、川滇花楸s.vilmorinii、尼泊爾花楸s.wallichii、華西花楸s.wilsoniana、黃脈花楸s.xanthoneura、長果花楸s.zahlbruckneri。

用于擴(kuò)增至少一種est-ssr標(biāo)記的分離的寡核苷酸引物，其包含選自下列的序列：seqidno:1～30所示核苷酸序列或其片段或變體。優(yōu)選的，所寡核苷酸引物可組成15對引物對，分別對應(yīng)seqidno:1和2；seqidno:3和4；seqidno:5和6；seqidno:7和8；seqidno:9和10；seqidno:11和12；seqidno:13和14；seqidno:15和16；seqidno:17和18；seqidno:19和20；seqidno:21和22；seqidno:23和24；seqidno:25和26；seqidno:27和28；seqidno:29和30。

寡核苷酸引物片段可包含部分seqidno:1～30，長度可以為5～25bp不等。

變體寡核苷酸引物不需要與seqidno:1～30共享任何重疊，但僅需能擴(kuò)增本發(fā)明的est-ssr標(biāo)記。變體寡核苷酸引物也包括與側(cè)接本發(fā)明的est-ssr標(biāo)記的區(qū)互補(bǔ)的任何寡核苷酸引物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員明晰，用于pcr的變體寡核苷酸引物的3’端可不與ssr標(biāo)記或側(cè)接ssr標(biāo)記的區(qū)具有任何錯(cuò)配，而5’端可具有錯(cuò)配。

由如上所述的引物擴(kuò)增得到的分離的est-ssr標(biāo)記，或所述est-ssr標(biāo)記的片段或變體。本發(fā)明的est-ssr標(biāo)記即以花楸樹(sorbuspohuashanensis)的基因組為模板，seqidno:1～30所示的引物擴(kuò)增得到的序列，該序列應(yīng)當(dāng)具有對應(yīng)的重復(fù)單元，如(aag)n，(ctt)n，(tc)n等(具體如表2所示)。

本發(fā)明也提供一種試劑盒，其包含來自seqidno:1～30的至少一種寡核苷酸引物或其片段或變體。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的引物對能在植物樣本中擴(kuò)增出條帶清晰、多態(tài)性高的est-ssr標(biāo)記條帶，使得本發(fā)明提供的引物能夠應(yīng)用于植物，尤其是花楸屬植物的種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平等方面的研究，采用est-ssr標(biāo)記可以對花楸屬植物的種群遺傳學(xué)研究提供較為豐富的遺傳基礎(chǔ)信息。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為花楸樹ssr位點(diǎn)重復(fù)長度分布；

圖2為花楸樹ssr位點(diǎn)重復(fù)次數(shù)分布；

圖3為花楸樹ssr不同重復(fù)單元類型；

圖4為二核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)單元的比例。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

1.材料與方法

1.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

花楸樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源于發(fā)明人課題組2014年對花楸樹葉片進(jìn)行illumina高通量測序的結(jié)果。測序時(shí)采取3株5年生花楸樹的葉片，提取rna后委托上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行rna-seq轉(zhuǎn)錄組測序，并通過denovo方法組裝得到96213條unigene，作為分析背景數(shù)據(jù)。

1.2植物材料及其dna提取

實(shí)驗(yàn)中用于引物篩選所用的植物材料為國家林木種質(zhì)資源共享服務(wù)平臺資源保存單位-北京農(nóng)學(xué)院林木種質(zhì)資源圃收集保存的山東嶗山種源8個(gè)2年生花楸樹實(shí)生苗。

試驗(yàn)材料基因組dna提取方法為ctab法。

1.3轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)鑒別及ssr引物設(shè)計(jì)

對花楸樹葉片轉(zhuǎn)錄組測序獲得的96213條unigene，采用misa程序(http：//pgrc.ikp-gatersleben.de/misa)進(jìn)行ssr位點(diǎn)搜索，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為6、4、3、3和3次。

利用primer3.0在線引物批量設(shè)計(jì)程序(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)對含有ssr位點(diǎn)的unigene序列設(shè)計(jì)引物。

1.4est-ssr引物篩選與pcr擴(kuò)增

按照ssr引物設(shè)計(jì)原則，隨機(jī)選取并合成140對est-ssr引物(北京睿博興科生物技術(shù)有限公司)，ssr位點(diǎn)包括2～3個(gè)核苷酸重復(fù)單元，引物序列及其相關(guān)信息見附表1。pcr反應(yīng)體系為20μl：模板dna(50ng)1μl，taq(+day)聚合酶10μl，dd水8.2μl，引物各0.4μl。pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，94℃變形30s，最佳退火溫度30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

首先選用一個(gè)dna模板對140對引物進(jìn)行擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行初步檢驗(yàn)，選出只有一個(gè)擴(kuò)增條帶且條帶清晰的引物；之后用四個(gè)dna模板對上述初篩出的引物進(jìn)行擴(kuò)增，篩選出條帶清晰且擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定的引物。選擇上述擴(kuò)增反應(yīng)穩(wěn)定、條帶清晰的引物，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成熒光(fam)標(biāo)記引物，采用8個(gè)dna模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增后，取1μlpcr產(chǎn)物，加入8.5μl去離子甲酰胺、0.5μlrox-500分子量內(nèi)標(biāo)，95℃變性5min，于4℃保溫10min，3000r·min-1離心1min，1×buffer緩沖液，于abi3730dna分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳，并收集數(shù)據(jù)，驗(yàn)證多態(tài)性。

1.5數(shù)據(jù)分析

用genemarker2.2.0軟件對收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，系統(tǒng)將各峰值的位置與其泳道中的rox-500分子質(zhì)量內(nèi)標(biāo)予以比較，讀取ssr標(biāo)記片段大小，記錄等位基因。

2結(jié)果與分析

2.1花楸樹轉(zhuǎn)錄組中ssr位點(diǎn)的數(shù)量與分布特點(diǎn)

在花楸樹轉(zhuǎn)錄組的96213條unigene序列中發(fā)現(xiàn)7473個(gè)ssr位點(diǎn)，分布在6604個(gè)unigene中，發(fā)生頻率(含有ssr的unigene數(shù)量與總unigene數(shù)量之比)為6.87％，其中，含2個(gè)及2個(gè)以上的ssr位點(diǎn)的unigene序列有764條，5840條序列含1個(gè)ssr位點(diǎn)，ssr的分布頻率(ssr的個(gè)數(shù)與總unigene的數(shù)量比)為7.77％，花楸樹轉(zhuǎn)錄組序列中平均9.1kb發(fā)現(xiàn)1個(gè)ssr位點(diǎn)(表1)。

表1花楸樹轉(zhuǎn)錄組中ssr重復(fù)單元的分布特點(diǎn)

對花楸樹轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)的序列長度分布分析發(fā)現(xiàn)，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)的平均長度分別為17、15、21、24、29bp，平均長度21bp(表2)。ssr位點(diǎn)的重復(fù)序列長度分布從12～84個(gè)堿基不等，重復(fù)序列長度12～21bp的最多，占79.97％；其次是長度22～30bp的序列重復(fù)，占12.98％,；而大于40bp的重復(fù)序列僅占2.40％(圖1)。

花楸樹轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5～42次之間。其中5～10次重復(fù)的數(shù)量最多，有6212個(gè)ssr位點(diǎn)；其次是11～15次重復(fù)，有762個(gè)ssr位點(diǎn)；大于20次重復(fù)的數(shù)量最少，僅有136個(gè)ssr位點(diǎn)(圖2)。

2.2花楸樹轉(zhuǎn)錄組ssr位點(diǎn)的重復(fù)類型與頻率

對花楸樹轉(zhuǎn)錄組中ssr位點(diǎn)深入分析發(fā)現(xiàn)，7473個(gè)ssr位點(diǎn)中共包含139種重復(fù)單元，其中，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)單元分別有8、30、52、31、18種。ssr位點(diǎn)的主要重復(fù)類型是二核苷酸重復(fù)(占ssr總數(shù)的66.49％)；其次是三核苷酸重復(fù)(占ssr總數(shù)的31.02％)；四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量很少，總計(jì)2.49％(圖3)。從出現(xiàn)頻率來看，頻率最高的重復(fù)單元為ag/ct，共有1957個(gè)ssr位點(diǎn)，占總ssr位點(diǎn)的25.19％；其次是ga/tc，有1571個(gè)ssr位點(diǎn)，占總ssr位點(diǎn)的21.02％(圖4)。分析還發(fā)現(xiàn)，ag/ct、ga/tc兩類重復(fù)基元在二核苷酸中出現(xiàn)次數(shù)最多，占所有二核苷酸ssrs的71％；同時(shí)在二核苷酸重復(fù)中還發(fā)現(xiàn)了少量的cg、gc重復(fù)，各占二核苷酸ssrs的0.10％(圖4)。

2.3est-ssr引物篩選與驗(yàn)證

參試的140對ssr引物，分別通過1個(gè)dna模板、4個(gè)dna模板pcr擴(kuò)增、檢測，共篩選出擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰的引物24對，占參試引物數(shù)的17.14％。然后對這篩選出的24對引物利用abi3700dna分析儀進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)共有15對引物具有多態(tài)性(表2)。

表2ssr引物序列與重復(fù)類型

3結(jié)論

通過花楸樹96213條轉(zhuǎn)錄組unigene序列中共查找到ssr位點(diǎn)7473個(gè)，這些ssr位點(diǎn)共包含139種重復(fù)單元，其中最主要的重復(fù)類型為二核苷酸重復(fù)；在二核苷酸ssrs中，ag/ct、ga/tc兩類重復(fù)單元元出現(xiàn)次數(shù)最多，所占比例高達(dá)71％；在參試的140對ssr引物中，檢測到15對ssrs具有多態(tài)性。這些基于花楸樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫開發(fā)獲得的ssr標(biāo)記，對于研究花楸樹不同種群的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性分析十分必要，為花楸樹的合理保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，也為后期的遺傳資源評價(jià)分子標(biāo)記輔助育種、功能基因挖掘和遺傳圖譜構(gòu)建等提供了理論依據(jù)；同時(shí)，這些標(biāo)記也將為同屬其它物種的遺傳多樣研究提供了有效標(biāo)記。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。

sequencelisting

<110>北京農(nóng)學(xué)院

<120>花楸樹est-ssr標(biāo)志物、其引物對及應(yīng)用

<160>30

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aaggcaacttgttgggtacg20

<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gccttggactttagagcttgc21

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

actccagcctttctcggatt20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

cgggattatcttcccaacaa20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

tgtcggaaacaggattgtca20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

tatggttgatcggctttggt20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

tccttcttggttgcacttga20

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

tctctcactcctctccccaat21

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

ggatctgaacccattgaagc20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

cagcagatctctcggctctc20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

tcatcactcgcgactacctg20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tccgaatgcagtgaagaaga20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

atggatgacggattgctctc20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gcggaaacttcttccgtgta20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

tggcgttacaaatggtttga20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

tctctccgcattctccttgt20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

ggggaaaagagagagggcta20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

tttgaggccattgagtgttg20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

tggtgtttgcgagttttctg20