本發(fā)明屬于基因工程和遺傳工程領(lǐng)域，具體涉及一種葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase，god)是一種需氧脫氫酶，ec號(hào)為1.1.3.4。它能夠在有氧條件下高度專一的將β-d-葡萄糖氧化成葡萄糖酸內(nèi)酯和過氧化氫，因此又稱為β-d-葡萄糖氧化還原酶。目前市面上大多數(shù)的god都是由備受關(guān)注的畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)中異源表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。工業(yè)化生產(chǎn)god的菌株主要來源于黑曲霉和青霉。相對(duì)而言，黑曲霉產(chǎn)的god熱穩(wěn)定性較好，而青霉產(chǎn)的god酶活較高。god作為食品行業(yè)中一種重要的工業(yè)用酶，廣泛用于葡萄酒、啤酒、果汁、奶粉等食品脫氧、面粉改良、食品褐變預(yù)防等方面，在醫(yī)藥行業(yè)中人體生化指標(biāo)葡萄糖的定量測(cè)定以及飼料行業(yè)中為益生菌提供厭氧環(huán)境等方面也有大量的應(yīng)用。

為了滿足特點(diǎn)行業(yè)對(duì)god的應(yīng)用需求，即獲得具有穩(wěn)定性好、活力高等特點(diǎn)的god，目前的普遍手段是挖掘新穎的基因資源、蛋白質(zhì)工程和優(yōu)化應(yīng)用環(huán)境等。利用蛋白質(zhì)工程的手段對(duì)god進(jìn)行分子改良以提高其催化性能研究更是取得了快速發(fā)展。例如，經(jīng)過定點(diǎn)突變的手段研究了god的三個(gè)催化殘基，即第412位的谷氨酸、第516和559位的組氨酸。統(tǒng)計(jì)目前關(guān)于酶穩(wěn)定性改良研究方面的報(bào)道論文，關(guān)于蛋白表面靜電相互作用、b-factor值、輸水相互作用、氫鍵、鹽鍵、陽離子-π相互作用、二硫鍵等理性設(shè)計(jì)策略被廣泛應(yīng)用在對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性改良中。但是，以上提到的策略中，絕大多數(shù)都是以損失酶催化活力為代價(jià)來提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的。因此，探究一種既能提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定，又不損失酶活的蛋白質(zhì)改造策略是非常有意義的。本發(fā)明嘗試在不損失酶活的前提下改良god的熱穩(wěn)定性，具有重要的理論研究意義和應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種蛋白，以來源于黑曲霉(aspergillusniger)的葡萄糖氧化酶goda作為母本，經(jīng)三個(gè)點(diǎn)突變asn159asp/ala160pro/val418glu，而獲得的葡萄糖氧化酶god2突變體，本發(fā)明所述蛋白是如下1)、2)、或3)所述的蛋白：

1)具有序列表中的seqid№.2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中的seqid№.2的氨基酸殘基序列中的第159位天冬氨酸、第160位脯氨酸、和/或第418位谷氨酸保留不變且將序列表中的seqid№.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加由1)衍生的蛋白質(zhì)；

3)將序列表中的seqid№.2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且酶活和熱穩(wěn)定性均較野生型酶增強(qiáng)了的由1)和/或2)衍生的蛋白質(zhì)。

序列表中seqid№.2所示的氨基酸序列由581個(gè)氨基酸殘基組成。

上述1)、2)、或3)所述的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行重組異源表達(dá)得到。上述1)、2)、或3)所述的蛋白的編碼基因可通過將序列表中seqid№.1所示dna序列缺失一個(gè)或幾個(gè)編碼氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變后得到。

編碼所述蛋白的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供一種編碼基因。

所述編碼基因具有下述核苷酸序列之一：

1)編碼上述蛋白的多核苷酸序列；

2)序列表中seqid№：1所示核苷酸序列；

3)編碼序列表中seqid№：2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；

4)與序列表中seqid№：1中第475-480位、和/或第1252-1254位核苷酸序列一致且在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中seqid№：1限定的dna序列雜交的核苷酸序列；

5)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中seqid№：1限定的dna序列雜交的核苷酸序列；

6)與1)、2)、3)、4)或5)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的dna序列；具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。

上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

其中，序列表中的seqid№：1由1743個(gè)核苷酸組成，其開放閱讀框架(orf)為自5′末端第1-1743位核苷酸，編碼序列表中seqid№：2所示的蛋白質(zhì)，即本發(fā)明所述的god2蛋白。

含有上述核酸分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。

所述重組菌的出發(fā)菌株包括大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌、和/或乳酸桿菌。

所述酵母菌包括畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞、和/或多型遜酵母細(xì)胞。

所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mrna加工或基因表達(dá)的dna片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動(dòng)子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。為了便于對(duì)重組菌進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入在宿主菌中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(gus基因、gfp基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化菌株。

所述重組表達(dá)載體的出發(fā)載體具體為ppic9；所述重組菌的出發(fā)菌株具體為gs115；

所述重組表達(dá)載體具體為ppic9-god2；所述重組菌具體為gs115/god2。

擴(kuò)增本發(fā)明所述編碼基因全長或其任意片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種葡萄糖氧化酶突變體的制備方法，所述方法為1)或2)所述方法：

1)所述方法包括將野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列的第159位天冬酰胺、第160位丙氨酸、和/或第418位纈氨酸分別變?yōu)樘於彼?、脯氨酸、?或谷氨酸；

2)所述方法包括將與野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列同源的氨基酸序列的第159、160、和/或418位氨基酸分別變?yōu)樘於彼帷⒏彼?、?或谷氨酸；

所述方法中，所述野生型葡萄糖氧化酶的氨基酸序列為將序列表中的seqid№.2所示的氨基酸序列的第159、160、和/或418位氨基酸分別變?yōu)樘於０?、丙氨酸、纈氨酸后的氨基酸序列；所述與野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列同源的氨基酸序列具體為與所述與野生型葡萄糖氧化酶氨基酸序列具有90％以上同源性，且功能相同的蛋白質(zhì)的氨基酸序列；具體的，所述同源性為95％以上；再具體的為96％以上；再具體的為97％以上；再具體的為98％以上；再具體的為99％以上。

所述葡萄糖氧化酶突變體與所述野生型葡萄糖氧化酶相比，具有如下至少一種性狀：1)葡萄糖氧化酶酶活性增強(qiáng)；2)葡萄糖氧化酶熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。

本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種葡萄糖氧化酶突變體的制備方法，所述方法包括：

1)制備上述所述的編碼基因；

2)制備包含步驟1)所述編碼基因的重組表達(dá)載體；

3)使步驟2)所述表達(dá)載體表達(dá)以獲得目的蛋白葡萄糖氧化酶突變體。

具體的，上述所述的編碼基因具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列；再具體的，上述所述的編碼基因具有的序列表中seqid№：1第1-1743位的核苷酸序列。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述編碼基因、所述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌、所述引物對(duì)、和/或所述制備方法在如下1)-4)至少一種中的應(yīng)用：

1)制備葡萄糖氧化酶和/或含有葡萄糖氧化酶相關(guān)產(chǎn)品；

2)制備葡萄糖氧化酶突變體和/或含有葡萄糖氧化酶突變體的相關(guān)產(chǎn)品；

3)制備酶活性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體和/或含有酶活性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體的相關(guān)產(chǎn)品；

4)制備熱穩(wěn)定性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體和/或含有熱穩(wěn)定性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體的相關(guān)產(chǎn)品。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的編碼基因、所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌、所述引物對(duì)、和/或所述制備方法在制備應(yīng)用于包括食品、醫(yī)藥、動(dòng)物飼料和/或紡織行業(yè)領(lǐng)域中的添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的蛋白、所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌、和/或所述制備方法制備得到的葡萄糖氧化酶突變體在如下1)-4)至少一種中的應(yīng)用：

1)制備含有和/或本身直接作為葡萄糖氧化酶相關(guān)產(chǎn)品；

2)制備含有和/或本身直接作為葡萄糖氧化酶突變體相關(guān)產(chǎn)品；

3)制備含有和/或本身直接作為酶活性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體相關(guān)產(chǎn)品；

4)制備含有和/或本身直接作為熱穩(wěn)定性較野生型增強(qiáng)的葡萄糖氧化酶突變體相關(guān)產(chǎn)品。

本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供所述的蛋白、所述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌、和/或所述制備方法制備得到的葡萄糖氧化酶突變體在制備應(yīng)用于包括食品、醫(yī)藥、動(dòng)物飼料和/或紡織行業(yè)領(lǐng)域中的添加劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種高酶活力與優(yōu)熱穩(wěn)定性的、適合于在食品、醫(yī)藥、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的葡萄糖氧化酶。

本發(fā)明提供的突變酶酶活力由野生型的228.0u/mg提高到了273.7u/mg，提高幅度為20％；野生型goda在60℃下處理120min之后，酶活降到了89.2u/mg，剩余酶活相當(dāng)于處理前的37.6％；而突變體god2在60℃下處理120min之后，剩余酶活力為105.3u/mg，較野生型提高1.18倍。在60℃下處理30min后，goda的剩余酶活為130.8u/mg，god2的剩余酶活為180.5u/mg，提高幅度為40％；野生型goda在70℃下處理2min之后，酶活降到了116.9u/mg，剩余酶活相當(dāng)于處理前的50％；而突變體god2在70℃下處理2min之后，剩余酶活力為186.4u/mg，較野生型提高1.59倍。因此，本發(fā)明提供的葡萄糖氧化酶突變體god2能很好的滿足食品、醫(yī)藥、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為野生型goda和突變體god2的酶活性比較圖。

圖2為野生型goda和突變體god2在60℃下的穩(wěn)定性比較圖。

圖3為野生型goda和突變體god2在70℃下的穩(wěn)定性比較圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

試驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)材料和試劑

1、菌株及載體：表達(dá)宿主pichiapastorisgs115，表達(dá)質(zhì)粒載體ppic9(invitrogen)為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自fermentas公司，連接酶購自promaga公司。其它都為國產(chǎn)分析純?cè)噭?均可從普通生化試劑公司購買得到)。

3、培養(yǎng)基：

lb培養(yǎng)基：0.5％酵母提取物，1％蛋白胨，1％nacl，ph7.0

ypd培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖

md固體培養(yǎng)基：2％葡萄糖，1.5％瓊脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin

mm固體培養(yǎng)基：1.5％瓊脂糖，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇

bmgy培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1％甘油(v/v)，1.34％ynb，0.00004％biotin

bmmy培養(yǎng)基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％ynb，0.00004％biotin，0.5％甲醇(v/v)

4、本實(shí)施例中未做詳細(xì)具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

實(shí)施例1、葡萄糖氧化酶編碼基因的定點(diǎn)突變

對(duì)葡萄糖氧化酶goda進(jìn)行同源建模，并將突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)為第159位天冬酰胺、160位丙氨酸和418位纈氨酸分別突變?yōu)樘於彼?、脯氨酸和谷氨酸。通過over-lappcr的方法引入突變位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，獲得突變基因god2。over-lappcr所用引物如表1所示：

表1

測(cè)序結(jié)果表明，上述over-lappcr擴(kuò)增得到具有序列表中seqid№：1的核苷酸序列，共1743bp，其中編碼區(qū)長1743bp，該編碼區(qū)序列如序列表中seqid№：1中第1-1743位核苷酸所示，編碼序列表中seqid№：2所示的氨基酸序列，共581個(gè)氨基酸殘基。將該具有序列表中seqid№：1所示的核苷酸序列的片段命名為突變體基因god2；將具有序列表中seqid№：2所示氨基酸序列的蛋白命名為葡萄糖氧化酶突變體god2。

實(shí)施例2葡萄糖氧化酶突變體god2的制備

(一)重組質(zhì)粒ppic9-god2的制備

將表達(dá)載體ppic9進(jìn)行雙酶切(ecori+noti)；同時(shí)將上述實(shí)施例1制備得到的具有序列表中seqid№：1的核苷酸序列的核酸片段進(jìn)行雙酶切(ecori+noti)；將上述切好的兩個(gè)核酸片段進(jìn)行連接，獲得含有所述突變體基因god2的重組質(zhì)粒。

將上述所得重組質(zhì)粒送去測(cè)序，驗(yàn)證序列的正確性。將所得質(zhì)粒中插入的外源基因的序列為seqid№：1所示核苷酸的重組質(zhì)粒，命名為ppic9-god2。

(二)重組菌gs115/god2的制備

將重組質(zhì)粒ppic9-god2轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115細(xì)胞，獲得重組酵母菌株gs115/god2。提取重組菌的質(zhì)粒送去測(cè)序，將測(cè)序正確的含有質(zhì)粒ppic9-god2的重組菌命名為gs115/god2。

(三)葡萄糖氧化酶突變體god2的制備

取上述重組酵母菌株gs115/god2，接種于300mlbmgy培養(yǎng)基的1l三角瓶中，置于30℃，220rpm搖床培養(yǎng)48h；后將培養(yǎng)液3000g離心5min，棄上清，沉淀用100ml含有0.5％(0.5ml/100ml培養(yǎng)基)甲醇的bmmy培養(yǎng)基重懸，并再次置于30℃，220rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔12h補(bǔ)加0.5ml甲醇，使菌液中的甲醇體積濃度保持在0.5％，同時(shí)取上清回收和親和層析純化葡萄糖氧化酶突變體god2，用于酶活性檢測(cè)。

實(shí)施例3葡萄糖氧化酶突變體god2和野生型的性質(zhì)分析比較

(一)酶活分析比較

采用紫外分光光度計(jì)法對(duì)god酶活進(jìn)行測(cè)定。具體方法如下：在給定條件下進(jìn)行酶促反應(yīng)，酶促反應(yīng)體系為：200μl的反應(yīng)體系，包括50μl適當(dāng)?shù)南♂屆敢海?0μl10mm的abts溶液，20μl50u/ml的hrp溶液，90μl磷酸氫二鈉-檸檬酸buffer，和20μl1m的葡萄糖溶液。在420nm波長處測(cè)定3min內(nèi)光密度隨時(shí)間的增長曲線，每隔30s記錄一次，根據(jù)直線的斜率求得酶活力。1個(gè)酶活單位(u)定義為在給定的條件下，單位時(shí)間內(nèi)生成1μmol的氧化型abts所需的酶量。

將上述實(shí)施例2制備的葡萄糖氧化酶突變體god2純化后，與野生型葡萄糖氧化酶在ph6.5、30℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測(cè)定其酶活性。

酶活測(cè)定結(jié)果如圖1所示，野生型的酶goda活力為228.0u/mg，葡萄糖氧化酶突變體god2的酶活力為273.7u/mg，較野生酶提高了20％。

(二)熱穩(wěn)定性分析比較

將上述實(shí)施例2制備的葡萄糖氧化酶突變體god2純化后，與野生型葡萄糖氧化酶一同，測(cè)定在60℃或70℃下的熱穩(wěn)定性，測(cè)定方法如下:

所述突變體和野生型的熱穩(wěn)定性測(cè)定為在0.1mol/l檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(ph6.5)緩沖液體系不同溫度(60℃或70℃)下處理不同時(shí)間(60℃下分別處理2、5、10、20、30、60、90和120min；70℃下分別處理2、5、10、15和20min)，再在30℃下進(jìn)行剩余酶活性測(cè)定。

如圖2所示，野生型goda在60℃下處理120min之后，酶活降到了89.2u/mg，剩余酶活相當(dāng)于處理前的37.6％；而突變體god2在60℃下處理120min之后，剩余酶活力為105.3u/mg，較野生型提高1.18倍。在60℃下處理30min后，goda的剩余酶活為130.8u/mg，god2的剩余酶活為180.5u/mg，提高幅度為40％。能很好的滿足食品、醫(yī)藥、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。

如圖3所示，野生型goda在70℃下處理2min之后，酶活降到了116.9u/mg，剩余酶活相當(dāng)于處理前的50％；而突變體god2在70℃下處理2min之后，剩余酶活力為186.4u/mg，較野生型提高1.59倍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料所

<120>一種葡萄糖氧化酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用

<160>2

<210>1

<211>1743

<212>dna

<213>黑曲霉（aspergillusniger）

<400>1

ggtattgaggcttccttgttgactgacccaaaggaggtcgccggtagaactgttgactac60

atcattgctggtggtggattgactggtttgactaccgctgccagattgactgagaaccca120

gacatcaccgttttggtcattgagtccggttcttacgaatctgatagaggtcctatcatt180

gaagacttgaacgcttacggtgacatcttcggatcttccgttgaccacgcttacgagact240

gtcgaacttgccactaacaatcaaaccgctttgattagatccggtaacggtttgggtggt300

tctactttggttaacggaggtacttggaccagaccacacaaggctcaagttgactcttgg360

gagaccgtcttcggtaacgaaggttggaattgggattctgtcgcagcttactccttgcag420

gccgagagagcccgtgctccaaacgctaagcaaatcgccgcaggtcactacttcgaccca480

tcctgtcacggtattaacggaactgttcacgctggtccaagagacaccggtgacgattac540

tctcctatcgtcaaggccttgatgtccgctgttgaagacagaggtgtcccaactaagaag600

gacttgggttgcggagacccacatggtgtttctatgttccctaacaccttgcacgaggac660

caagtcagatccgatgctgcccgtgaatggttgcttccaaactaccaaagacctaacttg720

caggttttgaccggtcaatacgttggtaaggtccttttgtctcaaaacgccactacccca780

agagctgttggtgtcgagttcggaactcacaagggtaacacccacaatgtttacgctaaa840

cacgaagtccttttggcagctggttccgctgtttctccaactatcttggagtactctggt900

atcggaatgaagtccattttggaaccacttggtattgacaccgtcgttgacttgcctgtt960

ggtctgaacttgcaagaccagactacctctactgtcagatcccgtattacctccgccggt1020

gctggacagggtcaggctgcctggtttgctactttcaacgagaccttcggtgactacact1080

gagaaggctcacgaattgcttaacaccaaattggaacaatgggctgaggaagccgttgct1140

agaggtggtttccacaacactaccgctcttttgatccaatacgagaactacagagactgg1200

attgttaaggataacgtcgcttactctgaattgttcttggacactgccggtgaggcttcc1260

ttcgacgtctgggacttgctgccattcactagaggatacgttcacatcttggacaaggac1320

ccatacttgagacacttcgcttacgatcctcaatacttcttgaacgagttggacttgctt1380

ggtcaggctgccgctactcaattggctagaaacatctctaactccggtgccatgcaaact1440

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<213>黑曲霉（aspergillusniger）

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