本發(fā)明涉及細菌檢測的裝置和方法領(lǐng)域，具體涉及一種b族鏈球菌熒光定量pcr檢測的引物、探針、試劑盒和方法。
背景技術(shù)：
：b族鏈球菌(groupbstreptococcus,gbs)是一種寄生于人類泌尿生殖道及下消化道的條件致病菌，健康人群帶菌率可達35％。早在20世紀70年代gbs就已經(jīng)被證實為圍產(chǎn)期母嬰感染的重要致病菌之一。定植于產(chǎn)婦生殖道的b族鏈球菌，可在分娩時垂直傳播給新生兒，而新生兒gbs感染所引起的新生兒敗血癥、腦膜炎和肺炎等癥致死率極高，并可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。2010年美國疾病預(yù)防中心制定了《圍產(chǎn)期gbs預(yù)防指南》，建議孕婦于妊娠35-37周進行g(shù)bs篩查。目前國內(nèi)對gbs的篩查有三種方法：(1)細菌培養(yǎng)法：采用標準細菌培養(yǎng)方法來檢測b族鏈球菌的存在，取樣后大約需要18-48小時得到檢測結(jié)果，比較費時，不能夠有效、快速地檢測出b族鏈球菌的存在，且陽性率受到多種因素影響，弊端明顯。(2)免疫學(xué)診斷方法：血清學(xué)方法不能高通量處理樣本。由于窗口期的存在，血清學(xué)的診斷存在滯后性，不能準確反映當(dāng)前是否感染。該方法費時、費力，無法滿足快速、早期診斷的要求。(3)熒光pcr法檢測法：熒光pcr法檢測不僅耗時短，在靈敏度和特異性上也優(yōu)于培養(yǎng)法，因此研制出一種使用簡單、結(jié)果準確的b族鏈球菌pcr檢測試劑具有重要的臨床意義。但是該方法與培養(yǎng)法存在一個共同問題，即檢測結(jié)果受取樣誤差影響較大，陰道及直腸樣本取樣操作難度大，取樣結(jié)果影響到后續(xù)的檢測結(jié)果。取樣失敗將會引起假陰性的診斷。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種b族鏈球菌熒光定量pcr檢測的引物、探針、試劑盒和方法，用以解決現(xiàn)有取樣誤差或取樣失敗而引起檢測假陰性結(jié)果的問題。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在基于熒光定量pcr檢測gbs的同時，增加了人保守基因作為內(nèi)對照目的基因，設(shè)計了β-actin內(nèi)標，該內(nèi)標可以從樣本采集、到核酸提取以及gbs基因擴增全過程監(jiān)控實驗操作各個環(huán)節(jié)，使得檢測結(jié)果更加可靠、穩(wěn)定。具體地，b族鏈球菌熒光定量pcr檢測引物及對應(yīng)探針，包括：擴增b族鏈球菌的引物對gbs-f和gbs-r及檢測b族鏈球菌的探針gbs-p，所述gbs-f、gbs-r和gbs-p的核苷酸序列分別依次如seqidno:1～seqidno:3所示；以及擴增人β-actin的引物對β-actin-f和β-actin-r及檢測人β-actin的探針β-actin-p，所述β-actin-f、β-actin-r和β-actin-p的核苷酸序列分別依次如seqidno:4～seqidno:6所示。上述seqidno:1～seqidno:6核苷酸序列具體參見表1。表1檢測b族鏈球菌和人β-actin的引物和探針名稱核苷酸序列seqidno：gbs-f5’-gaggctattactagcgttgaa-3’1gbs-r5’-ggcttctacacgactaccaat-3’2gbs-p5’-cttcattgcgtgccaaccctgagaca-3’3β-actin-f5’-tggcaagaaagtgctcggtg-3’4β-actin-r5’-cagcttgtcacagtgcagctca-3’5β-actin-p5’-atggcctggctcacctggacaac-3’6所述gbs-p和β-actin-p的核苷酸序列5’端分別標記不同的熒光報告集團，所述熒光報告集團選自fam、hex、cy3、cy5、joe、tet或lcred640中；所述gbs-p和β-actin-p的核苷酸序列的3’端分別標記熒光淬滅集團，所述熒光淬滅集團選自bhq1、bhq2、bhq3或dabcy1。優(yōu)選的，所述gbs-p核苷酸序列5’端標記fam熒光報告集團，3’端標記bhq1熒光淬滅集團；所述探針β-actin-p核苷酸序列5’端標記hex熒光報告集團，3’標記bhq1熒光淬滅集團。本發(fā)明還提供了針對上述引物和探針的試劑盒，包括pcr擴增反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照和陰性對照，所述pcr擴增反應(yīng)液中含有上述擴增b族鏈球菌的引物對gbs-f和gbs-r及檢測b族鏈球菌的探針gbs-p，以及擴增人β-actin的引物對β-actin-f和β-actin-r及檢測人β-actin的探針β-actin-p。所述pcr擴增反應(yīng)液中還含有進行pcr擴增的其他常規(guī)試劑，如pcr反應(yīng)緩沖液、mgcl2、dntps等；上述試劑為常規(guī)組分，可自行配置或購買，也可以全部裝配入試劑盒。所述所述酶混合液包括熱啟動taq酶和尿嘧啶-n-糖基化酶。所述陽性對照含有b族鏈球菌保守序列，可為含有b族鏈球菌保守序列的質(zhì)?；蛘邽闇缁畹腷族鏈球菌培養(yǎng)液。所述陰性對照為不含b族鏈球菌的純化水或生理鹽水。本發(fā)明還提供了一種采用上述試劑盒，進行熒光定量pcr的檢測方法，包括以下步驟：a、提取樣本dna，制備dna模板；b、加樣：將樣本dna、陽性對照或陰性對照分別對應(yīng)加入裝有pcr擴增反應(yīng)液和酶混合液的pcr管中，得對應(yīng)的樣本pcr反應(yīng)體系、陽性pcr反應(yīng)體系或陰性pcr反應(yīng)體系；c、pcr擴增：將步驟b所得樣本pcr反應(yīng)體系、陽性pcr反應(yīng)體系或陰性pcr反應(yīng)體系分別反應(yīng)管置于熒光定量pcr儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進行pcr擴增；d、pcr反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線判斷是否感染b族鏈球菌。上述技術(shù)方案中由于在pcr擴增反應(yīng)液中增加了人保守基因β-actin(即肌動蛋白)作為內(nèi)對照目的基因，與b族鏈球菌基因同時復(fù)合擴增。若檢測結(jié)果中沒有任何dna的存在，則檢測不到任何熒光，可能是取樣失敗或其他操作環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題；若只有人β-actin基因擴增，則為b族鏈球菌陰性；若有兩種熒光同時出現(xiàn)，才是b族鏈球菌陽性。因此，可以排除b族鏈球菌假陰性的情況。本發(fā)明的試劑盒和方法具有如下優(yōu)點：(1)本發(fā)明采用熒光定量pcr檢測方法，與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法相比，大幅度縮短了檢測時間；與血清學(xué)方法比較，排除了既往感染igg陽性患者帶來的假陽性結(jié)果；(2)本發(fā)明采用的引物對和探針，能特異性同時復(fù)合擴增b族鏈球菌基因和人類β-actin基因，由于增加了樣本采集監(jiān)控的常染色體內(nèi)標系統(tǒng)，結(jié)果更可靠、準確。附圖說明圖1是本發(fā)明實施例2的樣本擴增曲線，其中橫坐標表示循環(huán)數(shù)，縱坐標表示熒光強度。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1b族鏈球菌熒光定量pcr檢測試劑盒。本實施例的b族鏈球菌熒光pcr檢測試劑盒，包括pcr擴增反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照和陰性對照。其中所述pcr擴增反應(yīng)液主要包括：①pcr緩沖溶液(pcrbuffer)，由tris-hcl、kcl和純化水組成提供反應(yīng)所需的ph值和鹽離子環(huán)境；②mgcl2，提供反應(yīng)酶的催化劑；③dntps，提供反應(yīng)過程中dna鏈形成所需原料；④檢測b族鏈球菌和人β-actin的引物對及對應(yīng)的探針。如表1所述的引物對gbs-f、gbs-r及探針gbs-p是源于b族鏈球菌的保守區(qū)域的引物和探針；引物對β-actin-f、β-actin-r及β-actin-p是源于人β-actin的保守區(qū)域的引物和探針。在gbs-p的5’端標記fam熒光報告集團，3’端標記bhq1熒光淬滅集團，在β-actin-p5’端標記hex熒光報告集團，3’標記bhq1熒光淬滅集團。上述引物對和探針能特異性同時復(fù)合擴增b族鏈球菌基因和人β-actin基因。其中所述酶混合液為taq酶和ung酶，所述taq酶為熱啟動taq酶，所述ung酶為尿嘧啶-n-糖基化酶。所述陽性對照為含有b族鏈球菌保守序列的質(zhì)?；驕缁畹腷族鏈球菌培養(yǎng)液，其濃度為1000～10000cfu/ml，所述陰性對照為為不含有b族鏈球菌的純化水或生理鹽水。實施例2b族鏈球菌的檢測。步驟a、提取樣本dna，制備dna模板。將來自醫(yī)院的12例培養(yǎng)檢測為陰性，10例培養(yǎng)檢測為陽性的肛拭子及陰道拭子樣本，按照試劑盒說明書提取核酸，制備dna模板，本實施例采用的是由濟凡生物科技(北京)有限公司提供的finepure病毒dna/rna柱式提取試劑盒，按照試劑盒的說明書進行操作，還可以采用現(xiàn)有技術(shù)中其他的dna提取方法。步驟b、加樣：將步驟a中制備的22個樣本dna以及試劑盒中的陽性對照和陰性對照分別對應(yīng)加入裝有pcr擴增反應(yīng)液的pcr管中，得對應(yīng)的樣本pcr反應(yīng)體系、陽性pcr反應(yīng)體系和陰性pcr反應(yīng)體系。本實施例中pcr反應(yīng)體系的組成參見表2。表2pcr反應(yīng)體系的組成步驟c、pcr擴增：將步驟b中所得的pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)管置于熒光定量pcr儀上，設(shè)置循環(huán)參數(shù)，進行pcr擴增，擴增反應(yīng)程序如表3所述。表3擴增反應(yīng)程序步驟d、pcr反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熒光曲線判斷是否感染b族鏈球菌，參見圖1。結(jié)果判定：若只有人β-actin基因擴增，則為b族鏈球菌陰性；若有兩種熒光同時出現(xiàn)或者只有fam熒光出現(xiàn)擴增，則是b族鏈球菌陽性；若兩種熒光都沒有擴增，則檢測結(jié)果無效。最終的檢測結(jié)果如表4所示。表4樣本1～22的檢測結(jié)果與培養(yǎng)檢測結(jié)果的比對結(jié)果分析：通過細菌培養(yǎng)法和熒光定量pcr方法的比較可見，熒光定量pcr方法陽性率更高。采用本發(fā)明的試劑盒和方法，可以對生殖道分泌物和直腸分泌物等未知樣本中的b族鏈球菌-dna進行快速檢測，為診斷b族鏈球菌感染提供可靠的實驗依據(jù)。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施例對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。sequencelisting<110>濟凡生物科技（北京）有限公司<120>b族鏈球菌熒光定量pcr檢測的引物、探針、試劑盒和方法<130>2010<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>21<212>dna<213>artificalsequence<400>1gaggctattactagcgttgaa21<210>2<211>21<212>dna<213>artificalsequence<400>2ggcttctacacgactaccaat21<210>3<211>26<212>dna<213>artificalsequence<400>3cttcattgcgtgccaaccctgagaca26<210>4<211>20<212>dna<213>artificalsequence<400>4tggcaagaaagtgctcggtg20<210>5<211>22<212>dna<213>artificalsequence<400>5cagcttgtcacagtgcagctca22<210>6<211>23<212>dna<213>artificalsequence<400>6atggcctggctcacctggacaac23當(dāng)前第1頁12