本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種杜梨原生質(zhì)體的制備方法。
背景技術(shù)：
：原生質(zhì)體由于沒有細(xì)胞壁等特點(diǎn)，相對(duì)于組織、器官或個(gè)體水平有其自身獨(dú)有的特點(diǎn)：首先它可以排除細(xì)胞之間的相互影響，單獨(dú)考察一個(gè)細(xì)胞的全能性；其次，原生質(zhì)體是一個(gè)均一性程度很好的群體，在短時(shí)間內(nèi)就可能獲得大量的原生質(zhì)體。研究表明，原生質(zhì)體不僅可作為一個(gè)單細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)研究細(xì)胞壁再生、細(xì)胞分裂與分化、攝入細(xì)胞器、病毒侵染機(jī)理、膜透性及離子轉(zhuǎn)運(yùn)等基礎(chǔ)理論研究的理想材料；同時(shí)還是原生質(zhì)體培養(yǎng)和原生質(zhì)體融合的基礎(chǔ)。近年來(lái)，植物原生質(zhì)體技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，主要表現(xiàn)在通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株和建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的植物種類不斷增加，包括糧食作物、蔬菜、花卉、藥用植物、果樹等。杜梨(pyrusbetulaefoliabunge.)是薔薇科(rosaceae)梨亞科(pomoideae)梨屬(pyrus)植物，其根、葉、果實(shí)均可入藥，有健胃、消食、止痢、止咳作用。杜梨由于其適應(yīng)性強(qiáng)，耐旱，根深、發(fā)達(dá)、耐瘠薄，抗鹽堿能力強(qiáng)，是我國(guó)主要梨砧木，在生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。杜梨作為栽培梨的主要砧木，具有綜合抗性。利用生物技術(shù)建立杜梨高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系是充分發(fā)揮和利用其優(yōu)良抗性性狀的有效手段之一。由于杜梨的異花授粉和生產(chǎn)上都采用杜梨實(shí)生苗，后代群體基因雜合度高，基因型多樣，因而導(dǎo)致建立杜梨高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系一直是其生物學(xué)研究的瓶頸。由于游離的原生質(zhì)體無(wú)植物細(xì)胞壁的阻隔，其質(zhì)膜經(jīng)處理可直接攝取外源物質(zhì)(如細(xì)胞器、病毒、dna等)，常作為遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體系統(tǒng)，在植物生物學(xué)研究中已被廣泛采用，而獲得研究材料的大量原生質(zhì)體則是開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)的前提條件。目前關(guān)于杜梨原生質(zhì)體分離研究尚未有報(bào)道，而本發(fā)明嘗試建立的一種簡(jiǎn)易高效的杜梨原生質(zhì)體的分離和制備方法，將為杜梨細(xì)胞生物學(xué)研究及杜梨單細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立創(chuàng)造基礎(chǔ)條件。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種簡(jiǎn)單、高效的杜梨原生質(zhì)體制備方法，為突破杜梨遺傳轉(zhuǎn)化瓶頸，建立杜梨細(xì)胞工程技術(shù)體系，為杜梨原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體融合等提供技術(shù)依據(jù)。為解決以上問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種杜梨原生質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟：(1)材料的選?。哼x取杜梨苗的幼葉片作為處理材料，用水沖洗，消毒，并用無(wú)菌水沖洗干凈待用；(2)材料的前處理：將步驟(1)得到的材料，在室溫黑暗環(huán)境下進(jìn)行前處理，處理后將葉片切成細(xì)葉絲；(3)質(zhì)壁分離處理：將步驟(2)得到的細(xì)葉絲浸入質(zhì)壁分離處理液中，在室溫黑暗環(huán)境下，避光處理；(4)酶解處理：將經(jīng)步驟(3)質(zhì)壁分離處理的細(xì)葉絲加入酶解液中，靜置，避光酶解；當(dāng)酶解液變綠時(shí)置于恒溫?fù)u床上震蕩，促使原生質(zhì)體釋放出來(lái)；(5)原生質(zhì)體收集：將經(jīng)步驟(4)酶解的細(xì)葉絲溶液，加入等體積的等滲液，用細(xì)胞篩過(guò)濾，除去未解離組織；將濾液離心，棄上清液收集原生質(zhì)體沉淀。優(yōu)選地，所述的步驟(1)中選取的葉片為苗齡60～90d的杜梨苗頂端前3片幼葉，更優(yōu)選地，來(lái)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梨樹種質(zhì)圃苗齡75d的杜梨苗。優(yōu)選地，所述的步驟(2)中前處理的時(shí)間為0.5～1h，細(xì)葉絲的寬度為0.5～1mm。優(yōu)選地，所述的步驟(3)中質(zhì)壁分離處理液配方如下：cpw溶液+130g/l甘露醇+0.6g/lmes，調(diào)節(jié)ph5.6～6.0。cpw溶液的的配比：kh2po427.2mg/l；kno3101.0mg/l；cacl2·2h2o1480.0mg/l；mgso4·7h2o246.0mg/l；cuso4·5h2o0.025mg/l，余量為ddh2o，ph5.6-6.0。優(yōu)選地，所述的步驟(3)中細(xì)葉絲與質(zhì)壁分離處理液的比例為1g:20ml，避光處理時(shí)間1～3h。優(yōu)選地，所述的步驟(4)中酶解液配方如下：cpw溶液+90g/l甘露醇+25g/l纖維素酶r-10+2g/l離析酶r-10+6g/l果膠酶y-23+20mmmes(嗎啉乙磺酸)，調(diào)節(jié)ph為5.6～6.0。其中，所用纖維素酶、離析酶和果膠酶均來(lái)自日本yakult公司生產(chǎn)的原裝產(chǎn)品。優(yōu)選地，所述的步驟(4)中細(xì)葉絲與酶解液的比例為1g：10ml，酶解溫度25～28℃，酶解時(shí)間8～13h，更優(yōu)選地，酶解時(shí)間為10h；恒溫?fù)u床的溫度為25～28℃，轉(zhuǎn)速為30～50rpm，震蕩時(shí)間為20～30min。優(yōu)選地，所述的步驟(5)中等滲液配方如下：cpw溶液+90g/l甘露醇+0.6g/lmes，調(diào)節(jié)ph5.6～6.0。優(yōu)選地，所述的步驟(5)中細(xì)胞篩為200目，離心轉(zhuǎn)速為4℃、500rpm，離心時(shí)間為3～5min其中，所述離心均是將加速(accel)與減速(decel)均調(diào)至0檔。有益效果：本發(fā)明通過(guò)杜梨材料的前處理和質(zhì)壁分離處理，利用纖維素酶、離析酶和果膠酶組合酶解杜梨葉肉組織，有效實(shí)現(xiàn)了杜梨原生質(zhì)體的游離，克服了木本植物原生質(zhì)體難以分離的問(wèn)題，有效建立了杜梨葉肉原生質(zhì)體的制備方法。在此基礎(chǔ)上可以進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)、目標(biāo)基因瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)及原生質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化等，對(duì)杜梨目的基因功能研究及杜梨品種改良和培育新品種有重要意義。附圖說(shuō)明圖1杜梨原生質(zhì)體的制備過(guò)程，a.選取的苗齡75d杜梨頂端第三片葉的狀態(tài)；b.a中所取杜梨葉片切絲放入質(zhì)壁分離液中的狀態(tài)；c.b中的杜梨葉絲經(jīng)3h避光處理和10h酶解處理獲得的杜梨原生質(zhì)體(bar＝10μm)。具體實(shí)施方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。cpw溶液的的配比：kh2po427.2mg/l；kno3101.0mg/l；cacl2·2h2o1480.0mg/l；mgso4·7h2o246.0mg/l；cuso4·5h2o0.025mg/l，余量為ddh2o，ph為5.6～6.0。質(zhì)壁分離處理液的配比：cpw溶液+130g/l甘露醇+0.6g/lmes，ph為5.6～6.0；質(zhì)壁分離處理液的配制：稱取2.6g甘露醇和0.012gmes溶于20mlcpw溶液中配制質(zhì)壁分離處理液，ph為5.6～6.0，用0.22μl的濾頭過(guò)濾，取濾液4℃低溫保存?zhèn)溆?。等滲液的配比：cpw溶液+90g/l甘露醇+0.6g/lmes，ph5.6～6.0；等滲液的配制：稱取4.5g甘露醇和0.03gmes溶于50mlcpw溶液中配制等滲液，ph為5.6～6.0，用0.22μl的濾頭過(guò)濾，取濾液4℃低溫保存?zhèn)溆?。酶解液的配制：將纖維素酶r-10(cellulaser10)、離析酶r-10(mecerozymer10)、果膠酶y-23(pectolyasey-23)、甘露醇(mannitol)和mes加入ph為5.6～6.0的cpw溶液中混合，55℃水浴加熱10min；冷卻至室溫后用0.22μl的濾頭過(guò)濾，取濾液4℃低溫保存?zhèn)溆?。各組分在酶解液中的濃度如下：甘露醇為90g/l，纖維素酶r-10為25g/l，離析酶r-10為2g/l，果膠酶y-23為6g/l，mes為20mm。其中，所用纖維素酶、離析酶和果膠酶均來(lái)自日本yakult公司生產(chǎn)的原裝產(chǎn)品。實(shí)施例1(1)選取生長(zhǎng)健壯苗齡60、75、90d的杜梨苗的幼葉作為處理材料，用自來(lái)水沖洗后放入超凈工作臺(tái)，70％無(wú)水乙醇消毒，無(wú)菌水沖洗干凈待用；(2)將步驟(1)處理后的材料在室溫黑暗環(huán)境下處理0.5h，處理后用刀片沿葉脈方向，切成0.5～1mm寬的細(xì)葉絲；(3)將切好的細(xì)葉絲，稱取1g放入20ml質(zhì)壁分離處理液中，然后室溫置于黑暗環(huán)境，避光處理1h；(4)分別取上述經(jīng)過(guò)質(zhì)壁分離處理的細(xì)葉絲1g，放入預(yù)先配好的裝有10ml酶解液的培養(yǎng)皿中，然后靜置于25～28℃環(huán)境中，避光酶解8h，當(dāng)酶解液變綠時(shí)置于25～28℃恒溫?fù)u床上30～50rpm震蕩20～30min，促使原生質(zhì)體釋放出來(lái)；(5)將上述經(jīng)過(guò)酶解的細(xì)葉絲溶液，加入等體積的等滲液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，去除未解離組織，然后將濾液4℃、500rpm離心3～5min，去上清液，用等體積的等滲液重懸原生質(zhì)體沉淀。取少量原生質(zhì)體重懸液，用顯微鏡觀察原生質(zhì)體形態(tài)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(見表1)，4℃低溫保存?zhèn)溆?。上述所述離心是將加速(accel)與減速(decel)均調(diào)至0檔。表1不同苗齡杜梨幼葉分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量苗齡前處理時(shí)間質(zhì)壁分離時(shí)間酶解時(shí)間原生質(zhì)體產(chǎn)量(×106個(gè)/g)60d0.5h1h8h4.3275d0.5h1h8h6.2790d0.5h1h8h2.21實(shí)施例2(1)選取生長(zhǎng)健壯苗齡60、75、90d的杜梨苗的幼葉作為處理材料，用自來(lái)水沖洗后放入超凈工作臺(tái)，70％無(wú)水乙醇消毒，無(wú)菌水沖洗干凈待用；(2)將步驟(1)處理后的材料在室溫黑暗環(huán)境下處理1h，處理后用刀片沿葉脈方向，切成0.5～1mm寬的細(xì)葉絲；(3)將切好的細(xì)葉絲，稱取1g放入20ml質(zhì)壁分離處理液中，然后室溫置于黑暗環(huán)境，避光處理3h；(4)分別取上述經(jīng)過(guò)質(zhì)壁分離處理的細(xì)葉絲1g，放入預(yù)先配好的裝有10ml酶解液的培養(yǎng)皿中，然后靜置于25～28℃環(huán)境中，對(duì)應(yīng)分別避光酶解8、10、13h，當(dāng)酶解液變綠時(shí)置于25～28℃恒溫?fù)u床上30～50rpm震蕩20～30min，促使原生質(zhì)體釋放出來(lái)；(5)將上述經(jīng)過(guò)酶解的細(xì)葉絲溶液，加入等體積的等滲液，用200目細(xì)胞篩過(guò)濾，去除未解離組織，然后將濾液4℃、500rpm離心3～5min，去上清液，用等體積的等滲液重懸原生質(zhì)體沉淀。取少量原生質(zhì)體重懸液，用顯微鏡觀察原生質(zhì)體形態(tài)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)(見表2)，4℃低溫保存?zhèn)溆?。上述所述離心是將加速(accel)與減速(decel)均調(diào)至0檔。表2不同苗齡不同酶解時(shí)間杜梨幼葉分離原生質(zhì)的產(chǎn)量苗齡前處理時(shí)間質(zhì)壁分離時(shí)間酶解時(shí)間原生質(zhì)體產(chǎn)量(×106個(gè)/g)60d1h3h8h5.1275d1h3h10h8.0190d1h3h13h4.16據(jù)優(yōu)選方案實(shí)施，可見獲得的杜梨葉肉原生質(zhì)體懸浮液中，原生質(zhì)體形態(tài)飽滿，且原生質(zhì)體碎片少(見圖1c)，說(shuō)明此條件下分離的原生體能具有較高活力，表明本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)易高效的制備杜梨葉肉原生質(zhì)體的方法。當(dāng)前第1頁(yè)12