本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法。
背景技術(shù)：
：糖蜜含有少量粗蛋白質(zhì)，一般為3%-6%，多屬于非蛋白氮類，如氨、酰胺及硝酸鹽等，而氨基酸態(tài)氮僅占38%-50%，且非必需氨基酸如天門(mén)冬氨酸、谷氨酸含量較多，因此蛋白質(zhì)生物學(xué)價(jià)值較低，但天門(mén)冬氨酸和谷氨酸均為呈味氨基酸，故用于動(dòng)物飼料中可大大刺激動(dòng)物食欲。糖蜜的主要成分為糖類，甘蔗糖蜜含蔗糖約24%-36%，其他糖約12%-24%；甜菜糖蜜所含糖類幾乎全為蔗糖，約47%之多。此外還含有3%-4%的可溶性膠體，主要為木糖膠、阿拉伯糖膠和果膠等。糖蜜的礦物質(zhì)含量較高，約8%-10%，但鈣、磷含量不高，甘蔗糖蜜又高于甜菜糖蜜。礦物元素中鉀、氯、鈉、鎂含量高，因此糖蜜具有輕瀉性。一般糖蜜維生素含量低，但甘蔗糖蜜中泛酸含量較高，達(dá)37mg/kg，此外生物素含量也很可觀。將提純的甘蔗汁或甜菜汁蒸濃至帶有晶體的糖膏，用離心機(jī)分出結(jié)晶糖后所余的母液，叫“蜜糖”。這種第一糖蜜中還含有多量蔗糖，可重復(fù)上法而得是第二、第三糖蜜等。最后得到一種母液，無(wú)法再蒸濃結(jié)晶，稱廢糖蜜（wastemolasses）。一般單稱糖蜜指的就是廢糖蜜，可用作食物或飼料，也可用于發(fā)酵工業(yè)的原料。但是糖蜜中存在一定量的銅鐵鋅等金屬離子，會(huì)影響黃曲霉的發(fā)酵，“蔗糖糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的研究，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)”對(duì)糖蜜進(jìn)行了處理，降低了金屬離子的含量。l-蘋(píng)果酸的生產(chǎn)最初是在培養(yǎng)黃曲霉時(shí)有少量蘋(píng)果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產(chǎn)生。后來(lái)，由糖類物質(zhì)發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸，但是傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、培養(yǎng)基成本高、能耗大、產(chǎn)酸率低，糖的利用率不高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。隨著氨基酸行業(yè)逐步發(fā)展，發(fā)酵法生產(chǎn)技術(shù)l-蘋(píng)果酸也有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。中國(guó)專利技術(shù)“cn2012101350639”公開(kāi)了一種利用蔗糖糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法，該方法使用了甘蔗糖蜜作為發(fā)酵培養(yǎng)基原料，節(jié)省了培養(yǎng)基成本，但是產(chǎn)酸量達(dá)不到規(guī)模化生產(chǎn)的需求。申請(qǐng)人之前的專利技術(shù)“一種制備l-蘋(píng)果酸的方法”采用米曲霉發(fā)酵來(lái)制備蘋(píng)果酸，其取得了較好的蘋(píng)果酸產(chǎn)率，本發(fā)明在該專利技術(shù)的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)進(jìn)行了改進(jìn)，旨在于進(jìn)一步提高蘋(píng)果酸的產(chǎn)率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)施的：一種利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法，其包括如下步驟：步驟1）糖蜜預(yù)處理，步驟2）制備發(fā)酵培養(yǎng)基，步驟3）發(fā)酵產(chǎn)酸。進(jìn)一步地，所述方法包括如下步驟：步驟1）糖蜜預(yù)處理：往糖蜜中添加兩倍質(zhì)量的純化水，1000rpm攪拌3min，然后添加占糖蜜質(zhì)量2%的活性炭，200rpm攪拌30min，過(guò)濾，收集濾液；步驟2）制備發(fā)酵培養(yǎng)基：按照1l培養(yǎng)基計(jì)，將70g碳酸鈣、20g葡萄糖、10g玉米漿、8g尿素、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸二氫鉀以及0.1g磷酸氫二鉀依次添加到步驟1）所得濾液中，定容1l，控制ph值6.2；步驟3）發(fā)酵產(chǎn)酸：按照米曲霉種子液∶發(fā)酵培養(yǎng)基為1∶10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度33℃，培養(yǎng)48h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨，繼續(xù)發(fā)酵36h，然后控制溫度為39-40℃，壓強(qiáng)為2-3個(gè)大氣壓，保溫保壓發(fā)酵12h，停止發(fā)酵，得到l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液；發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制ph在6.2；并通過(guò)流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％；優(yōu)選地，所述碳酸鈣的添加量為70-90g/l。優(yōu)選地，所述十六烷基三甲基溴化銨的添加量為30-40mg/l。優(yōu)選地，所述米曲霉種子液的濃度為1×109cfu/ml。優(yōu)選地，所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。優(yōu)選地，所述糖蜜為甘蔗糖蜜。本發(fā)明的有益效果主要包括但是并不限于幾個(gè)方面：本發(fā)明對(duì)糖蜜處理工藝簡(jiǎn)單，避免使用酸處理以及氰化處理，節(jié)約了成本，并且減少了培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)礦物質(zhì)的添加量；本發(fā)明對(duì)現(xiàn)有菌株進(jìn)行通透化處理，提高了蘋(píng)果酸的產(chǎn)率；本發(fā)明通過(guò)適當(dāng)提高培養(yǎng)溫度，可增加分子擴(kuò)散的速度；增加壓力對(duì)細(xì)胞的擠壓作用增強(qiáng),細(xì)胞表面發(fā)生輕微變形,細(xì)胞膜的通透性增加；培養(yǎng)過(guò)程后期加入合適劑量的ctab，干擾細(xì)胞壁的合成，改善菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)催化反應(yīng)中底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，同時(shí)調(diào)整合適的濃度，避免終濃度過(guò)低，達(dá)不到透性化改造的目的，終濃度過(guò)高則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)停滯；本發(fā)明通過(guò)添加ctab結(jié)合溫度壓強(qiáng)的改變，實(shí)現(xiàn)菌株培養(yǎng)與透性化處理的耦合，可以在不需要對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)透性化處理的情況下減小菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，避免后續(xù)透性化處理細(xì)胞的步驟及相關(guān)設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)的投入，為提高l-蘋(píng)果酸產(chǎn)量提供了一個(gè)簡(jiǎn)便方法；本發(fā)明發(fā)酵工藝中添加碳酸鈣來(lái)維持碳酸鈣的濃度，提高了米曲霉的發(fā)酵效率。具體實(shí)施方式為了使本
技術(shù)領(lǐng)域：
的人員更好地理解本申請(qǐng)中的技術(shù)方案，下面將結(jié)合本申請(qǐng)具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本申請(qǐng)一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒旧暾?qǐng)中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例1一種利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法，其包括如下步驟：糖蜜預(yù)處理：往甘蔗糖蜜中添加兩倍質(zhì)量的純化水，1000rpm攪拌3min，然后添加占糖蜜質(zhì)量2%的活性炭，200rpm攪拌30min，過(guò)濾，收集濾液；制備發(fā)酵培養(yǎng)基：按照1l培養(yǎng)基計(jì)，將70g碳酸鈣、20g葡萄糖、10g玉米漿、8g尿素、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸二氫鉀以及0.1g磷酸氫二鉀依次添加到步驟1）所得濾液中，定容1l，控制ph值6.2；發(fā)酵產(chǎn)酸：按照米曲霉種子液∶發(fā)酵培養(yǎng)基為1∶10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度33℃，培養(yǎng)48h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，碳酸鈣的添加量為70g/l，ctab的添加量為30mg/l，繼續(xù)發(fā)酵36h，然后控制溫度為39℃，壓強(qiáng)為3個(gè)大氣壓，保溫保壓發(fā)酵12h，停止發(fā)酵，得到l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液；發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制ph在6.2；并通過(guò)流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％；米曲霉種子液的濃度為1×109cfu/ml；所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。實(shí)施例2一種利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)l-蘋(píng)果酸的方法，其包括如下步驟：糖蜜預(yù)處理：往甘蔗糖蜜中添加兩倍質(zhì)量的純化水，1000rpm攪拌3min，然后添加占糖蜜質(zhì)量2%的活性炭，200rpm攪拌30min，過(guò)濾，收集濾液；制備發(fā)酵培養(yǎng)基：按照1l培養(yǎng)基計(jì)，將70g碳酸鈣、20g葡萄糖、10g玉米漿、8g尿素、0.1g硫酸鎂、0.1g磷酸二氫鉀以及0.1g磷酸氫二鉀依次添加到步驟1）所得濾液中，定容1l，控制ph值6.2；發(fā)酵產(chǎn)酸：按照米曲霉種子液∶發(fā)酵培養(yǎng)基為1∶10的體積比例轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中培養(yǎng)，溫度33℃，培養(yǎng)48h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，碳酸鈣的添加量為90g/l，ctab的添加量為40mg/l，繼續(xù)發(fā)酵36h，然后控制溫度為40℃，壓強(qiáng)為2個(gè)大氣壓，保溫保壓發(fā)酵12h，停止發(fā)酵，得到l-蘋(píng)果酸發(fā)酵液；發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)自動(dòng)流加氨水控制ph在6.2；并通過(guò)流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘?zhí)强刂圃诓坏陀?.0％；米曲霉種子液的濃度為1×109cfu/ml；所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。實(shí)施例3各因素對(duì)米曲霉發(fā)酵蘋(píng)果酸產(chǎn)量的影響：l-蘋(píng)果酸的測(cè)定：采用2,7—萘二酚顯色法，取樣品溶液1.0ml，加入6.0ml分析純的濃硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接著在100℃水浴中加熱20min，取出待冷卻至室溫后，于385nm下進(jìn)行比色測(cè)定，以蒸餾水作對(duì)照校正儀器零點(diǎn)。用標(biāo)準(zhǔn)樣品先作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘋(píng)果酸含量為橫坐標(biāo)，385nm處吸收值即od385為縱坐標(biāo)，通過(guò)未知樣品在385nm處的od值，則可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的蘋(píng)果酸含量。設(shè)置對(duì)照組，其中，對(duì)照組1：不提高溫度和壓強(qiáng)，其余同實(shí)施例1；對(duì)照組2：不添加ctab，其余同實(shí)施例1；試驗(yàn)組為實(shí)施例1。各組別發(fā)酵液中蘋(píng)果酸的產(chǎn)量見(jiàn)表1：表1組別對(duì)照組1對(duì)照組2實(shí)施例1蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）87.691.8131.3實(shí)施例4一、ctab梯度試驗(yàn)：以實(shí)施例1為例，檢測(cè)了ctab濃度對(duì)產(chǎn)酸量的影響，具體見(jiàn)表2：表2濃度mg/l515304050蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）108.9115.4131.3128.7120.6二、壓強(qiáng)梯度試驗(yàn)：針對(duì)發(fā)酵后期12小時(shí)內(nèi)，選擇1-5大氣壓進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)流程同實(shí)施例2，具體發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表3：表3大氣壓強(qiáng)度12345蘋(píng)果酸產(chǎn)量（g/l）112.6129.1126.5116.8103.5三、溫度梯度試驗(yàn)：針對(duì)發(fā)酵后期12小時(shí)內(nèi)，選擇33-43℃進(jìn)行測(cè)試，其余實(shí)驗(yàn)流程同實(shí)施例1，具體發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表4：表4溫度℃333537394143酸產(chǎn)量（g/l）98.4109.7120.9131.3117.8104.5結(jié)論：適當(dāng)提高溫度和壓強(qiáng)可以增加米曲霉細(xì)胞壁的透過(guò)性，從而提高蘋(píng)果酸產(chǎn)量，但是壓強(qiáng)或溫度過(guò)高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致菌株活力降低或者死亡，從而導(dǎo)致蘋(píng)果酸量下降。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方式對(duì)本案作了詳盡的說(shuō)明，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所作的修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12