本發(fā)明涉及一種重組慢病毒載體及其應(yīng)用，尤其涉及一種含有β珠蛋白基因及相關(guān)調(diào)控元件的重組慢病毒載體及其應(yīng)用；屬分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β珠蛋白基因位于第11號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶，總長(zhǎng)度為60kb，包括ε、δ和β及兩個(gè)假基因ψβ2和ψβ1，它們緊密連鎖，其邊接順序?yàn)?imgfile="bda0001286289290000012.gif"wi="586"he="59"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>每個(gè)β基因有兩個(gè)非編碼區(qū)(內(nèi)含子)ivs-1和ivs-2，其長(zhǎng)分別為130bp和850bp，它們分別插入到編碼區(qū)(外顯子)的相應(yīng)于第30與31和104與105密碼子的dna序列之間，而編碼區(qū)可編碼β珠蛋白的146個(gè)氨基酸。

基因座控制區(qū)(locuscontrolregion，lcr)是β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控中一個(gè)重要的順式元件，長(zhǎng)約20kb，具有增強(qiáng)子及開(kāi)放染色質(zhì)結(jié)構(gòu)活性。當(dāng)lcr與β-珠蛋白相連時(shí)，能介導(dǎo)與整合位點(diǎn)無(wú)關(guān)的紅系組織特異性高效表達(dá)，而表達(dá)量?jī)H與拷貝數(shù)有關(guān)。人β-lcr由6個(gè)dna酶i高敏的位點(diǎn)(hs)組成，其中位于β-珠蛋白基因的5’端的為hs1～5，近端的4個(gè)具有紅系特異性，其中hs2、hs3具有較強(qiáng)的增強(qiáng)子功能，是lcr活性的重要組成部分。對(duì)lcr的hss結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其位點(diǎn)中均含有g(shù)ata-1、ap-1/nf-e2以及caccc等結(jié)合基序，每個(gè)hs中結(jié)合基序數(shù)目及空間排列并不完全相同。用重組dna及轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)檢測(cè)大片段140kb，單個(gè)5'-hss位點(diǎn)缺失如5'-hs3缺失可使ε基因的表達(dá)減少，而γ表達(dá)增加；缺失5'-hs2則影響較小。lcr復(fù)合物的形成也不需要所有5'-hss位點(diǎn)，5'-hs5和5'-hs1在短暫表達(dá)系統(tǒng)、穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中均無(wú)增強(qiáng)子活性；而整個(gè)lcr以及5'-hs2～4則具有增強(qiáng)子活性。另外珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控不僅需要lcr的作用，還需要如啟動(dòng)子、內(nèi)含子及3’端增強(qiáng)子等近側(cè)順式元件的參與。

典型的β-珠蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)含有三個(gè)保守盒的基序，它們是位于帽位上游約-30bp處的tata盒，又稱hogness-goldberg序列；位于-70～-90bp處的ccaat盒以及-95～-120bp處的caccc盒對(duì)β-珠蛋白基因的時(shí)空表達(dá)具有重要作用，這些保守盒序列中若發(fā)生突變將影響基因的正常轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致β-地中海貧血(β-地貧)。因此，最短的β-啟動(dòng)子必須達(dá)到103bp，才可在lcr的誘導(dǎo)下發(fā)揮啟動(dòng)子的作用，但在病毒載體構(gòu)建時(shí)想要得到β-珠蛋白基因的高表達(dá)一般會(huì)選擇盡量長(zhǎng)的啟動(dòng)子，這是因?yàn)樵谶h(yuǎn)側(cè)啟動(dòng)子中有許多公共轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，他們通過(guò)蛋白間或蛋白與dna之間的互作關(guān)系，調(diào)控β-珠蛋白基因的表達(dá)。關(guān)于β-珠蛋白基因的增強(qiáng)子，研究者已發(fā)現(xiàn)并確定了2個(gè)增強(qiáng)子，一個(gè)是β-珠蛋白基因內(nèi)含子ivs-2中富含at基序的372bp的片段，該片段屬于基質(zhì)結(jié)合區(qū)域；另一個(gè)是位于β-珠蛋白基因3’側(cè)翼序列1.5kb內(nèi)，距離β-珠蛋白基因ploya位點(diǎn)下游550-800bp處。通過(guò)復(fù)雜的酶切序列分析發(fā)現(xiàn)，在δ和β珠蛋白基因間的冗長(zhǎng)序列中也存在有復(fù)雜的順式作用元件調(diào)控區(qū)或網(wǎng)絡(luò)。

由于特定基因的順式作用元件結(jié)構(gòu)在機(jī)體不同細(xì)胞內(nèi)幾乎完全相同，單純用順式作用元件不能解釋基因表達(dá)的組織特異性和發(fā)育階段特異性等特征，即順式作用元件本身單獨(dú)并不能調(diào)控基因的表達(dá)，它需要與反式作用因子等相互作用，并與其它順式作用元件協(xié)同配合才可能發(fā)揮其調(diào)控基因表達(dá)的作用。

研究表明，完整的反式作用因子一般包含兩個(gè)重要的功能結(jié)構(gòu)域：dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，它們是其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的必需結(jié)構(gòu)。按照作用機(jī)制可將β-珠蛋白的反式作用因子分為3類：通用轉(zhuǎn)錄因子、紅系特異性反式作用因子及發(fā)育階段特異性反式作用因子。通用轉(zhuǎn)錄因子可與啟動(dòng)子的保守域相結(jié)合；紅系特異性反式作用因子不僅能反式激活攜帶其結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因，還與其他蛋白因子協(xié)同作用，介導(dǎo)lcr與單個(gè)基因發(fā)生聯(lián)系，有研究證明紅系核因子2(nuclearfactor-erythroid2，nfe2)能與lcr中的hs2位點(diǎn)結(jié)合，從而介導(dǎo)hs2的增強(qiáng)子活性；發(fā)育階段特異性因子可以在不同階段與特定的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控基因在不同階段進(jìn)行表達(dá)。

隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)理論和技術(shù)的迅速發(fā)展，β-珠蛋白基因簇的表達(dá)調(diào)控機(jī)制已基本清楚，如何建立高效的β-珠蛋白表達(dá)體系是目前研究的熱點(diǎn)。通過(guò)檢索發(fā)現(xiàn)：目前還未見(jiàn)有關(guān)利用psin慢病毒載體裝載β-珠蛋白及其相關(guān)的調(diào)控元件并在體外高效穩(wěn)定表達(dá)的重組慢病毒載體的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種β-珠蛋白重組慢病毒載體及其應(yīng)用。

本發(fā)明所述的β-珠蛋白重組慢病毒載體，其特征在于：所述載體的基因序列由修飾后的β-珠蛋白基因全長(zhǎng)、β-珠蛋白基因調(diào)控區(qū)hs2-hs3、β-珠蛋白基因5’啟動(dòng)子、β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子、染色質(zhì)絕緣體ctcf和psin4-cmv-k2m質(zhì)粒構(gòu)成，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述修飾后β-珠蛋白基因全長(zhǎng)是一段2.9kb的β-珠蛋白基因序列，該β-珠蛋白基因序列5’-3’分別包含一段1671kb的啟動(dòng)子，三段β-珠蛋白基因外顯子(ⅰ、ⅱ、ⅲ)、兩段β-珠蛋白基因內(nèi)含子(ivs-1，130bp和ivs-2，476bp)和一段132bp的3’尾隨序列。上述的hs2-hs3基因序列為β-珠蛋白基因座控制區(qū)，長(zhǎng)度為2.1kb。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述β-珠蛋白基因5’啟動(dòng)子優(yōu)選是選擇包含ataaaa序列的tata盒、ggccaatct序列的ccaat元件、caccc元件和遠(yuǎn)端多種公共轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，其堿基長(zhǎng)度1671kb，核苷酸序列如seqidno.2所示；其中，β-珠蛋白基因5’啟動(dòng)子上游特異性引物是5’-gggtaccccgctccagatagccatagaag-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為kpni；β-珠蛋白基因5’啟動(dòng)子下游特異性引物是5’-ctgcagaagcaatagatggctctgccc-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為psti。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述修飾后β-珠蛋白基因全長(zhǎng)優(yōu)選是選擇內(nèi)含子ivs-2刪除一段374bp的rsai/rsai(gt^ac，ca^tg)片段，該片段含有a/t豐富區(qū)和3個(gè)反向的polya信號(hào)區(qū)，其核苷酸序列如seqidno.3所示；其中，內(nèi)含子ivs-2上游特異性引物是5’-aagcttgtgagtctatgggacgctt-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為hindiii；內(nèi)含子ivs-2下游特異性引物是5’-cccgggctgtgggaggaagataagag-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為avai。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子優(yōu)選是選擇β-珠蛋白基因ploya位點(diǎn)下游，堿基長(zhǎng)度為418bp的序列，其核苷酸序列如seqidno.4所示；其中，β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子上游特異性引物是5’-gatatcaatgatgtatttaaattatttctg-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為ecorv；β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子下游特異性引物是5’-ccatgggaaaccatctcgccgta-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為ncoi。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述染色質(zhì)絕緣體ctcf為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域，阻斷增強(qiáng)子活性，可被病毒載體有效容納，并且不影響病毒滴度，其優(yōu)選是選擇堿基長(zhǎng)度為266bp的序列，核苷酸序列如seqidno.5所示；其中，染色質(zhì)絕緣體ctcf上游特異性引物是5’-ccatggagagcgagattccgtctcaa-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為ncoi；染色質(zhì)絕緣體ctcf下游特異性引物是5’-actagtacaatggctggcccatagta-3’，其特異性酶切位點(diǎn)為spei。

上述的β-珠蛋白重組慢病毒載體中：所述的psin4-cmv-k2m的質(zhì)粒的構(gòu)建方法參見(jiàn)nethercotthe,brickdj,schwartzph.derivationofinducedpluripotentstemcellsbylentiviraltransduction[j].humanpluripotentstemcells:methodsandprotocols,2011:67-85，長(zhǎng)度為8945bp。

本發(fā)明所述的β-珠蛋白重組慢病毒載體在轉(zhuǎn)染造血干/祖細(xì)胞獲得正常功能β-珠蛋白中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的β-珠蛋白重組慢病毒載體在與特定的包裝質(zhì)粒和包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞獲得較高滴度的假病毒顆粒中的應(yīng)用。

本發(fā)明公開(kāi)了一種含有β珠蛋白基因及相關(guān)調(diào)控元件的重組慢病毒載體，利用其可方便的得到病毒滴度較高的假病毒顆粒，并在人造血干/祖細(xì)胞中正常表達(dá)。

具體的，上述載體的使用方法是：

(1)提取正常人外周血標(biāo)本5ml置含有acd抗凝劑的離心管中，設(shè)計(jì)特異性引物，使用chelex-100法提取總dna，使用特異引物進(jìn)行l(wèi)a-pcr擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分離后，回收純化dna片段，得到所需序列。

(2)將得到的dna序列按照一定的順序，使用酶切位點(diǎn)連接，構(gòu)建得到重組慢病毒載體。將重組慢病毒載體與pspax2包裝質(zhì)粒和pmd2g包裝質(zhì)粒按照比例混合，共轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞，得到較高的慢病毒滴度的假病毒顆粒。

本發(fā)明提供的β-珠蛋白重組慢病毒載體，是以慢病毒質(zhì)粒psin4-cmv-k2m為基礎(chǔ)，通過(guò)插入β-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因的啟動(dòng)子、β-珠蛋白基因座控制區(qū)hs2和hs3，β-珠蛋白增強(qiáng)子，染色體絕緣子等作用元件構(gòu)建紅系細(xì)胞中特異高效穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)；利用該表達(dá)系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)慢病毒載體在紅系細(xì)胞中特異高效穩(wěn)定的表達(dá)，得到病毒滴度較高的假病毒顆粒，且在轉(zhuǎn)染人造血干/祖細(xì)胞后得到正常功能的β-珠蛋白。

附圖說(shuō)明

圖1為慢病毒表達(dá)質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒圖譜。

其中：

a.psin4-cmv-hbb慢病毒表達(dá)質(zhì)粒圖譜；

b.psin4-cmv-gfp慢病毒表達(dá)質(zhì)粒圖譜；

c.pspax2包裝質(zhì)粒圖譜；

d.pmd2g包裝質(zhì)粒圖譜。

圖2為慢病毒顆粒感染造血干細(xì)胞后提取hbb基因瓊脂糖凝膠電泳。

其中：

1泳道為hbb基因；

m泳道為marker。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但列舉內(nèi)容并不限制本發(fā)明。

下述實(shí)施例所涉及的各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)買于newenglandbiolab公司；血液dna提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒、rna提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，操作完全按照相應(yīng)說(shuō)明書進(jìn)行；la-pcr試劑盒為takara公司產(chǎn)品；大腸桿菌(e.coli)dh5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；gfp綠色熒光蛋白表達(dá)質(zhì)粒pegfp-n3來(lái)源于atcc(美國(guó)典型菌種保藏中心)；質(zhì)粒構(gòu)建中基因測(cè)序和引物合成由華大基因公司完成。實(shí)施例中的其他實(shí)驗(yàn)方法及試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法與市售試劑。

實(shí)施例中所采用的分子生物學(xué)技術(shù)可參見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

實(shí)施例中所述lb液體培養(yǎng)基成分為：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl5g/l。滅菌后使用。

實(shí)施例1：特異性β-珠蛋白基因啟動(dòng)子序列的獲取

1.使用含抗凝劑的抗凝管采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.根據(jù)現(xiàn)有的使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-gggtaccccgctccagatagccatagaag-3’

kpni

下游引物5’-ctgcagaagcaatagatggctctgccc-3’

psti

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

表1

4.使用lightcycler96pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性10s，63℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體(購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如seqidno.2所示。

實(shí)施例2：β-珠蛋白基因外顯子ⅰ，內(nèi)含子ivs-1和外顯子ⅱ序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-ctgcagacatttgcttctgacaca-3’

psti

下游引物5’-aagcttcctgaagttctcaggatc-3’

hindiii

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例3：β-珠蛋白基因內(nèi)含子ivs-2序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-aagcttgtgagtctatgggacgctt-3’

hindiii

下游引物5’-cccgggctgtgggaggaagataagag-3’

avai

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.使用rsai/rsai(gt^ac，ca^tg)酶切，得到三段dna片段，分別為86bp，374bp和390bp。

7.使用1％瓊脂糖凝膠電泳分別將86bp和390bp的片段切下，并重新連接。

8.將連接產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如seqidno.3所示。

實(shí)施例4：β-珠蛋白基因外顯子ⅲ和3’端尾隨序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-cccgggctcctgggcaacgtgct-3’

avai

下游引物5’-gatatcgcaatgaaaataaatgtttttt-3’

ecorv

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例5：β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-gatatcaatgatgtatttaaattatttctg-3’

ecorv

下游引物5’-ccatgggaaaccatctcgccgta-3’

ncoi

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，53℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果如seqidno.4所示。

實(shí)施例6：β-珠蛋白基因座控制區(qū)hs2-hs3基因序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-gctgccctgttagagttctggcact-3’

nhei

下游引物5’-ggggtaccccagctggttagaaggttcta-3’

kpni

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，68℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序。

實(shí)施例7：染色質(zhì)絕緣體ctcf基因序列的獲取

1.采集正常人外周血，使用chelex-100法提取總dna(參見(jiàn)血液dna提取試劑盒說(shuō)明書)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)特異性引物如下：

上游引物5’-ccatggagagcgagattccgtctcaa-3’

ncoi

下游引物5’-actagtacaatggctggcccatagta-3’

spei

3.按照表1的反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

4.bio-radc1000pcr儀(bio-rad，美國(guó))進(jìn)行pcr反應(yīng)，反應(yīng)體系為94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，60℃退火10min，72℃延伸15s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃復(fù)性10min，4℃結(jié)束反應(yīng)。

5.使用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物并回收(參見(jiàn)瓊脂糖凝膠回收dna片段試劑盒說(shuō)明書)。

6.將pcr產(chǎn)物連接到pgem-t載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果如seqidno.5所示。

實(shí)施例8：psin4-cmv-hbb慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.經(jīng)nheli和spei雙酶切psin4-cmv-k2m，切除klf4、ires2和myc三個(gè)基因，回收慢病毒表達(dá)質(zhì)粒并使其線性，按照下表進(jìn)行37℃酶切反應(yīng)2h，酶切反應(yīng)體系如下：純化的dna質(zhì)粒(1μg/μl)2μl，10×buffer5μl，100×bsa0.5μl，spei(10u/μl)1μl，nheli(10u/μl)1μl，ddh2o40.5μl。

2.將含有nheli、kpnⅰ、pstⅰ、hindⅲ、avaⅰ、ecorv、ncoⅰ和spei等酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)mcs與線性慢病毒載體進(jìn)行連接，反應(yīng)體系如下：線性化的慢病毒載體psin100ng/μl1μl，t4dnaligasebuffer(2×)5μl，多克隆位點(diǎn)mcs片段100ng/μl1μl，10×t4噬菌體dna連接酶1μl，ddh2o2μl；4℃連接過(guò)夜。

3.轉(zhuǎn)化，取200μl轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中，加2μl連接液，混勻，冰上放置30min；42℃恒溫水浴加熱90s，然后迅速置于冰上冷激2min；將連接轉(zhuǎn)化的混合物加入到500μl無(wú)抗生素lb液體培養(yǎng)基中，180rpm，37℃孵育50min，使細(xì)菌恢復(fù)活力；取200μl菌液均勻地涂抹在含amp的lb固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

4.陽(yáng)性克隆的鑒定及dna測(cè)序

(1)陽(yáng)性克隆篩選用槍頭挑取平板上的白色單克隆菌落，分別接種到含amp的lb液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)5-10小時(shí)。

(2)菌液pcr鑒定以菌液為模板，hbb基因全長(zhǎng)克隆引物進(jìn)行10μl體系進(jìn)行普通pcr鑒定，10μl反應(yīng)體系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×pcrbuffer(mg²⁺plus)1μl，dntpmixture(各2.5mm)0.5μl，takaralataq0.1μl，ddh2o6.4μl。

(3)pcr反應(yīng)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；pcr產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選出陽(yáng)性克隆。

(4)挑選陽(yáng)性克隆菌落，使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒(參見(jiàn)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書)，進(jìn)行dna測(cè)序；獲得psin4-cmv-mcs慢病毒質(zhì)粒。

5.使用nheli和kpnⅰ雙酶切將psin4-cmv-mcs線性化，插入基因片段hs2-hs3，并連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3慢病毒質(zhì)粒。

6.使用kpnⅰ和psti雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3質(zhì)粒使其線性化，將β-珠蛋白基因啟動(dòng)子序列與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter慢病毒質(zhì)粒。

7.使用psti和hindⅲ雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter質(zhì)粒使其線性化，將β-珠蛋白基因外顯子ⅰ，內(nèi)含子ivs-1和外顯子ⅱ序列與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi慢病毒質(zhì)粒。

8.使用hindⅲ和avai雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi質(zhì)粒使其線性化，將β-珠蛋白基因內(nèi)含子ivs-2序列與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2慢病毒質(zhì)粒。

9.使用avai和ecorv雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2質(zhì)粒使其線性化，將β-珠蛋白基因外顯子ⅲ和3’端尾隨序列與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2-hbbⅲ慢病毒質(zhì)粒。

10.使用ecorv和ncoi雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2-hbbⅲ質(zhì)粒使其線性化，將β-珠蛋白基因增強(qiáng)子序列與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2-hbbⅲ-3’enhancer慢病毒質(zhì)粒。

11.使用ncoi和spei雙酶切psin4-cmv-hs2-hs3-βpromoter-hbbi-ivs2-hbbⅲ-3’enhancer質(zhì)粒使其線性化，將染色質(zhì)絕緣子ctcf與之連接轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆得到psin4-cmv-hs2-hs3-hbb-ctcf慢病毒質(zhì)粒，即本發(fā)明所述β-珠蛋白重組慢病毒載體，其核苷酸序列如seqidno.1所示。

實(shí)施例9：對(duì)照質(zhì)粒psin4-cmv-gfp慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.獲取根據(jù)ncbi檢索的gfp基因序列，檢索序列號(hào)為nc_011521.1，設(shè)計(jì)特異性引物獲取gfp基因全長(zhǎng)。

2.使用primerpremier5軟件設(shè)計(jì)gfp基因特異性引物如下：

gfp基因上游引物：5’-gctagcggactagttgagtaaagg-3’

nhei

gfp基因下游引物：5’-actagtttgcggccgcttatttgta-3’

spei

3.以質(zhì)粒pegfp-n3為模板，克隆gfp基因全長(zhǎng)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收gfp基因片段。

4.使用nhei和spei對(duì)gfp基因片段進(jìn)行酶切，37℃酶切2h，酶切反應(yīng)體系如下：gfp基因片段15μl，10×buffer5μl，nhei(10u/μl)限制性內(nèi)切酶1μl，spei(10u/μl)限制性內(nèi)切酶1μl，ddh2o28μl。

5.經(jīng)nhei和spei雙酶切回收psin4-cmv慢病毒表達(dá)質(zhì)粒并使其線性，按照下表進(jìn)行37℃酶切反應(yīng)2h，酶切反應(yīng)體系如下：純化的dna質(zhì)粒(1μg/μl)2μl，10×buffer5μl，100×bsa0.5μl，spei(10u/μl)1μl，nhei(10u/μl)1μl，ddh2o40.5μl。

6.獲得重組質(zhì)粒

(1)連接，反應(yīng)體系為：線性化的慢病毒載體psin4100ng/μl1μl，雙酶切得到gfp基因片段100ng/μl1μl，10×t4噬菌體dna連接酶2μl，ddh2o16μl，4℃連接過(guò)夜。

(2)轉(zhuǎn)化，取200μl轉(zhuǎn)移至離心管中，加2μl連接液，混勻，冰上放置30min；42℃恒溫水浴加熱90s，然后迅速置于冰上冷激2min；將連接轉(zhuǎn)化的混合物加入到500μl無(wú)抗生素lb液體培養(yǎng)基中，180rpm，37℃孵育50min，使細(xì)菌恢復(fù)活力；取200μl菌液均勻地涂抹在含amp的lb固體培養(yǎng)基平板上，37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜。

7.陽(yáng)性克隆的鑒定及dna測(cè)序

(1)陽(yáng)性克隆篩選用槍頭挑取平板上的白色單克隆菌落，分別接種到含amp的lb液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)5-10小時(shí)。

(2)菌液pcr鑒定以菌液為模板，gfp基因全長(zhǎng)克隆引物進(jìn)行10μl體系進(jìn)行普通pcr鑒定，10μl反應(yīng)體系：菌液1μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，10×pcrbuffer(mg²⁺plus)1μl，dntpmixture(各2.5mm)0.5μl，takaralataq0.1μl，ddh2o6.4μl。

(3)pcr反應(yīng)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min；pcr產(chǎn)物經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，選出陽(yáng)性克隆。

(4)挑選陽(yáng)性克隆菌落，使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒(參見(jiàn)質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書)。

獲得psin4-cmv-gfp慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。

實(shí)施例10：β-珠蛋白基因重組慢病毒的包裝

將psin4-cmv-hbb或psin4-cmv-gfp與特定的pspax2包裝質(zhì)粒、pmd2g包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞，得到假病毒顆粒。

1.hek293t細(xì)胞的預(yù)培養(yǎng)：計(jì)數(shù)8×10⁶個(gè)hek293t細(xì)胞(購(gòu)自美國(guó)atcc公司)接種到10cm細(xì)胞培養(yǎng)盤中，加入10ml新鮮的1640培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)hyclone公司)，放入37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，進(jìn)行全換液，加入5ml1640培養(yǎng)基，待用。

2.轉(zhuǎn)染

(1)按照以下試劑的順序和體積分別添加到50ml離心管中，滅菌水3.6ml，psin4-cmv-hbb慢病毒表達(dá)質(zhì)粒或psin4-cmv-gfp慢病毒表達(dá)質(zhì)粒12μl，pspax2包裝質(zhì)粒9μl，pmd2g包裝質(zhì)粒3μl；cacl2溶液147μl，快速搖勻，約10s；

(2)分別加入2×hbs1250μl，快速搖勻30s，靜置2min30s；

(3)加入1640培養(yǎng)基2.5ml，充分吹打混勻；

(4)將混合液逐滴均勻地分別加入已換液的hek293t細(xì)胞中，混勻，在37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

3.培養(yǎng)12-15h后細(xì)胞全換液，放回37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

4.繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞36h后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與轉(zhuǎn)染情況，沿培養(yǎng)皿側(cè)壁將病毒上清液吸出至50ml離心管中；

5.使用0.45μm的過(guò)濾注射器將收集的病毒上清過(guò)濾至病毒收集管中；

6.向病毒收集管中加滿1640培養(yǎng)基至病毒管口；

7.50000rpm/min，4℃，離心2.5h；

8.去上清，使用100μl4℃預(yù)冷的pbs重懸病毒，分裝，-80℃保存。

實(shí)施例11：慢病毒滴度的測(cè)定

1.準(zhǔn)備96孔板一個(gè)，每孔接種2×10⁴個(gè)細(xì)胞。

2.準(zhǔn)備8個(gè)1.5ml離心管，編號(hào)1～8，每管加入297μl1640完全培養(yǎng)液，向1號(hào)離心管中加入33μl病毒原液，混勻后，吸取30μl加入2號(hào)管中混勻，以此類推進(jìn)行梯度稀釋，共做8個(gè)梯度濃度，分別是10，1，10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6。

3.棄去96孔板中原有的培養(yǎng)液，加入不同濃度的病毒液，每個(gè)濃度重復(fù)三個(gè)孔，每孔加入病毒液100μl，同時(shí)每孔加入2μl濃度為0.5mg/ml聚凝胺(polybrene)。

7.5d后，吸上清，收集細(xì)胞，流式檢測(cè)gfp％。

8.以流式檢測(cè)gfp％最接近1的稀釋倍數(shù)進(jìn)行計(jì)算，用下列公式計(jì)算病毒感染滴度：

病毒感染滴度(tu/ml)＝[(2×10⁴細(xì)胞/孔)×gfp％]/(病毒液體積×稀釋倍數(shù))。

9.測(cè)得的慢病毒顆粒的滴度為5.6×10⁸tu/ml，屬于病毒滴度的較高水平。

實(shí)施例12：β-珠蛋白重組慢病毒在造血干細(xì)胞中的表達(dá)

1.復(fù)蘇凍存的重癥β-地中海貧血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，37℃迅速融化，將細(xì)胞從凍存管中轉(zhuǎn)移到15ml離心管中，加f12培養(yǎng)基定容至8ml。離心，300g，3min。

3.棄掉上清液，加入1mlfacs沖洗液，重懸細(xì)胞，混勻后用70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾到新15ml離心管中。

4.細(xì)胞計(jì)數(shù)。再次離心，500g，10min。棄上清，按照計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)，每1×10⁸個(gè)細(xì)胞用300μl培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行cd34細(xì)胞免疫磁珠分選(按照美天旎免疫磁珠分選試劑盒說(shuō)明書操作)。

5.吸100μl細(xì)胞，避光加入1μlcd34抗體，4℃，30min。流式檢測(cè)cd34+細(xì)胞的百分比。

10.棄上清，加入x-vivo20培養(yǎng)基(購(gòu)自瑞士lonza公司)重懸細(xì)胞，加入scf，flt-3l，il-3，tpo，ps等因子，充分混勻后將細(xì)胞接種到12孔培養(yǎng)板中每孔2ml。

11.細(xì)胞全換液后，每孔添加32μlpolybrene(聚凝胺)，混勻后靜置1～3min。

12.向細(xì)胞中每孔加入18μl實(shí)施例10中的病毒液，混合均勻。

13.37℃條件下，培養(yǎng)24h后換液。

14.培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，離心，并用新鮮的x-vivo20培養(yǎng)基重懸收獲。

15.去上清，加入200μltrizol裂解細(xì)胞。

16.提取dna并通過(guò)凝膠電泳鑒定(參見(jiàn)dna提取試劑盒說(shuō)明書)(如圖2)。

序列表

<110>廣東銥科基因生物科技有限公司

<120>一種β-珠蛋白重組慢病毒載體及其應(yīng)用

<141>2017-5-2

<160>5

<210>1

<211>11183

<212>dna

<213>人工序列

<221>β-珠蛋白重組慢病毒載體

<222>（1）…（11183）

<400>1

cggaccgccactgccaattacctgtggtttcatttactctaaacctgtgattcctctgaa60

ttattttcattttaaagaaattgtatttgttaaatatgtactacaaacttagtagttgga120

agggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacaca180

aggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgac240

ctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataa300

aggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagag360

agaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagct420

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aaagagttacccatgcagaggccctcctagcatccagagactagtgcttagattcctact3720

ttcagcgttggacaacctggatccacttgcccagtgttcttccttagttcctaccttcga3780

ccttgatcctcctttatcttcctgaaccctgctgagatgatctatgtggggagaatggct3840

tctttgagaaacatcttcttcgttagtggcctgcccctcattcccactttaatatccaga3900

atcactataagaagaatataataagaggaataactcttattataggtaagggaaaattaa3960

gaggcatacgtgatgggatgagtaagagaggagagggaaggattaatggacgataaaatc4020

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cagaagagtcaagcatttgcctaaggtcggacatgtcagaggcagtgccagacctatgtg4200

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gactgtaaatttgggagcaggagtctctaaggacttggatttcaaggaattttgactcag4380

caaacacaagaccctcacggtgactttgcgagctggtgtgccagatgtgtctatcagagg4440

ttccagggagggtggggtggggtcagggctggccaccagctatcagggcccagatgggtt4500

ataggctggcaggctcagataggtggttaggtcaggttggtggtgctgggtggagtccat4560

gactcccaggagccaggagagatagaccatgagtagagggcagacatgggaaaggtgggg4620

gaggcacagcatagcagcatttttcattctactactacatgggactgctcccctataccc4680

ccagctaggggcaagtgccttgactcctatgttttcaggatcatcatctataaagtaaga4740

gtaataattgtgtctatctcatagggttattatgaggatcaaaggagatgcacactctct4800

ggaccagtggcctaacagttcaggacagagctatgggcttcctatgtatgggtcagtggt4860

ctcaatgtagcaggcaagttccagaagatagcatcaaccactgttagagatatactgcca4920

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cggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccag11040

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<210>2

<211>1671

<212>dna

<213>人工序列

<221>β-珠蛋白基因5’啟動(dòng)子

<222>（1）…（1671）

<400>2

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ctttgggttgtaagtgactttttatttatttgtatttttgactgcattaagaggtctcta960

gttttttatctcttgtttcccaaaacctaataagtaactaatgcacagagcacattgatt1020

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tagtgcatcaacttcttatttgtgtaataagaaaattgggaaaacgatcttcaatatgct1380

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gcaatttgtactgatggtatggggccaagagatatatcttagagggagggctgagggttt1500

gaagtccaactcctaagccagtgccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcactt1560

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ggcaggagccagggctgggcataaaagtcagggcagagccatctattgctt1671

<210>3

<211>476

<212>dna

<213>人工序列

<221>β-珠蛋白基因內(nèi)含子ivs-2

<222>（1）…（476）

<400>3

gtgagtctatgggacgcttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgt60

cataggaaggggataagtaacagggtacacatattgaccaaatcagggtaattttgcatt120

tgtaattttaaaaaatgctttcttcttttaatatacttttttgtttatcttatttctaat180

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gtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacctcttatcttcctcccacag476

<210>4

<211>418

<212>dna

<213>人工序列

<221>β-珠蛋白基因3’增強(qiáng)子

<222>（1）…（418）

<400>4

aatgatgtatttaaattatttctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtg60

catttaaaacataaagaaatgaagagctagttcaaaccttgggaaaatacactatatctt120

aaactccatgaaagaaggtgaggctgcaaacagctaatgcacattggcaacagcccctga180

tgcatatgccttattcatccctcagaaaaggattcaagtagaggcttgatttggaggtta240

aagttttgctatgctgtattttacattacttattgttttagctgtcctcatgaatgtctt300

ttcactacccatttgcttatcctgcatctctcagccttgactccactcagttctcttgct360

tagagataccacctttcccctgaagtgttccttccatgttttacggcgagatggtttc418

<210>5

<211>266

<212>dna

<213>人工序列

<221>染色質(zhì)絕緣體ctcf

<222>（1）…（266）

<400>5

agagcgagattccgtctcaaagaaaaaaaaagtaatgaaatgaataaaatgagtcctaga60

gccagtaaatgtcgtaaatgtctcagctagtcaggtagtaaaaggtctcaactaggcagt120

ggcagagcaggattcaaattcagggctgttgtgatgcctccgcagactctgagcgccacc180

tggtggtaatttgtctgtgcctcttctgacgtggaagaacagcaactaacacactaacac240

ggcatttactatgggccagccattgt266