本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種從臍帶組織中提取復(fù)合細(xì)胞因子的方法，本發(fā)明還涉及本發(fā)明提取的復(fù)合細(xì)胞因子的保存方法及其用途。
背景技術(shù)：
細(xì)胞因子是一類通過與特異的、高親和的細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長并參與細(xì)胞功能等多效應(yīng)的多肽類物質(zhì)，對不同種類細(xì)胞具有一定的專一性，由多種維生素、氨基酸、多醣類成分、復(fù)雜蛋白質(zhì)體、醣蛋白等組成。細(xì)胞因子由正常細(xì)胞分泌，分泌方式主要包括自分泌(autocrine)和旁分泌(paracrine)，具有多效性、重疊性、協(xié)同性、拮抗性和雙重性等特點，該特點是其具有非常重要實驗研究價值，有助于闡明分子水平的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理，有助于疾病的預(yù)防、診斷和治療，特別是利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的重組細(xì)胞因子已用于治療腫瘤、感染、炎癥、造血功能障礙等。目前實驗研究結(jié)果表明其可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)和3d打印的生物材料，具有抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等作用，未來具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells)是一類具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，源于發(fā)育早期的中胚層，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，可以從骨髓、外周血、脂肪及皮膚等多種組織中獲得。間充質(zhì)干細(xì)胞屬于非終末分化細(xì)胞，它既有間質(zhì)細(xì)胞的特征，又有內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞的特征；作為一類多能干細(xì)胞，它在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可以向骨、軟骨、肌肉、肌腱、肝、脂肪、神經(jīng)、內(nèi)皮及胰島樣細(xì)胞等方向增殖分化。目前已知對心肌梗死、糖尿病、骨質(zhì)疏松、骨壞死、狼瘡性腎炎、肝硬化、肝衰竭、多發(fā)性肝硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、帕金森病、脊髓損傷等都有一定治療效果。
近來有學(xué)者從分娩后的廢棄物-臍帶中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)、分化功能和表面標(biāo)志物等生物學(xué)表型鑒定，確定了這種新型間充質(zhì)干細(xì)胞的開發(fā)潛質(zhì)。這種新型間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有明顯的優(yōu)勢：(1)來源充足，取材方便，無倫理學(xué)爭議；(2)含量豐富，可在體外進(jìn)行分離、培養(yǎng)，且生物學(xué)性狀穩(wěn)定，多次傳代擴(kuò)增仍能保持旺盛功能；(3)免疫原性極低；(4)分泌能力強(qiáng)，在增殖生長過程中會產(chǎn)生大量細(xì)胞因子等。
目前，從臍帶中獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞除應(yīng)用于臨床研究與治療外，干細(xì)胞分泌產(chǎn)生的各種多肽類細(xì)胞因子也越來越被關(guān)注。在干細(xì)胞的培養(yǎng)液中含有多種干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，如干細(xì)胞因子(scf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、神經(jīng)生長因子(ngf)、基質(zhì)細(xì)胞源性生長因子(sdf)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vegf)、血小板源性生長因子(pdgf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)、胰島素樣生長因(igf)、表皮生長因子(egf)、白細(xì)胞介素(il)、巨核細(xì)胞集落刺激因子(m-csf)、腫瘤壞死因子(tnf)、干擾素(ifn)等，通過多種因子的協(xié)同作用可有效調(diào)控機(jī)體細(xì)胞信號傳導(dǎo)、活化人體干細(xì)胞，進(jìn)而生理性修復(fù)或替代機(jī)體損傷、病變及衰老的細(xì)胞等。
美國科學(xué)家levi博士就發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子具有除皺作用，將多種細(xì)胞因子組成的生物活性復(fù)合蛋白作用于皮膚真皮層的成纖維干細(xì)胞，使處于休眠、損傷的成纖維干細(xì)胞被激活和修復(fù)，并分化成大量成熟的成纖維細(xì)胞用于皮膚更新。
然而，當(dāng)前對細(xì)胞因子的開發(fā)，首先需要大量擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞，而原代細(xì)胞的活性和數(shù)量無疑是最關(guān)鍵的，但目前獲取原代細(xì)胞的組織塊直接貼壁法和酶消化法均略顯不足。在酶消化法中，使用多種消化酶(cn102127522b、cn101575590b)進(jìn)行長時間組合消化獲取單細(xì)胞懸液(胰酶和膠原酶ⅱ、ⅳ)，消化方式強(qiáng)烈，易對細(xì)胞膜造成破壞，致使細(xì)胞變形，增殖能力下降，傳代次數(shù)減少；且多種酶組合消化的消化時間不易把握，最佳配比有待實驗確認(rèn)。此外多種酶的使用也增加了外源物質(zhì)引入的風(fēng)險。而單純使用組織塊培養(yǎng)法則培養(yǎng)時間過長，至少需要20天原代細(xì)胞才可以進(jìn)行傳代。原代培養(yǎng)時間的延長將會使細(xì)胞長時間暴露于體外環(huán)境，增加了細(xì)胞的不穩(wěn)定性，使細(xì)胞易發(fā)生老化，增殖能力減弱，基因突變幾率大幅增加。
因此，當(dāng)前對更為有效的細(xì)胞因子的生產(chǎn)方法存在需求。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于此，本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種從臍帶組織中提取復(fù)合細(xì)胞因子的方法。本發(fā)明的方法操作簡單、可重復(fù)性高、成本低、提取效率高、無化學(xué)試劑殘留，為復(fù)合細(xì)胞因子進(jìn)一步地應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)、醫(yī)療美容、生物3d打印領(lǐng)域提供了基礎(chǔ)。
一方面，本發(fā)明提供了一種從臍帶組織中提取復(fù)合細(xì)胞因子的方法，所述方法包括以下步驟：
1)臍帶組織的處理：
將臍帶組織消毒并處理為0.1～0.3cm3的組織塊；
2)復(fù)合細(xì)胞因子的富集：
在步驟1)得到的組織塊中加入2～5倍體積生理鹽水，離心取沉淀，然后加入1～10倍體積的生理鹽水，混合均勻，并置于培養(yǎng)箱中孵化1～6天；
3)復(fù)合蛋白因子的分離：
收集步驟2)孵化后的組織塊和上清液，離心取上清液；
4)將步驟3)得到的上清液加壓依次通過120μm、70μm、50μm、25μm的濾器，并進(jìn)一步使用2～4kd的過濾膜濃縮脫鹽，即得。
優(yōu)選地，在步驟1)中，所述臍帶組織保存在4℃；
優(yōu)選地，在步驟1)中，所述消毒包括以下的步驟：
將臍帶組織使用碘伏浸泡1～10分鐘，優(yōu)選地1～3分鐘，更優(yōu)選地1分鐘后，使用體積比為75％的酒精浸泡脫碘，然后使用生理鹽水沖洗1～5次，優(yōu)選地3次。
優(yōu)選地，在步驟2)中，所述離心的條件為：在1000～1400r/min下，離心4～7min；更優(yōu)選地，所述離心的條件為：在1000r/min下，離心5min；
優(yōu)選地，在步驟2)中，離心取沉淀后，加入2～5倍體積，優(yōu)選地3倍體積的生理鹽水混合均勻；優(yōu)選地，在步驟2)中，混合均勻后，首先將混勻的組織塊轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，然后置于培養(yǎng)箱中孵化；
優(yōu)選地，在步驟2)中，所述培養(yǎng)箱的孵化條件為：
37℃、co2的濃度為3％；
優(yōu)選地，在步驟2)中，在培養(yǎng)箱中孵化2～3天；
優(yōu)選地，在步驟3)中，所述離心的條件為：在1000～1400r/min下，離心4～7min；更優(yōu)選地，所述離心的條件為：在1400r/min下，離心5min；
優(yōu)選地，在步驟4)中，將步驟3)得到的上清液加壓依次通過120μm、70μm、50μm、25μm的濾器，過濾條件為進(jìn)0.3～0.6mpa，溫度為5±3℃；
優(yōu)選地，在步驟4)中，收集通過過濾器的上清液，使用截留分子量3kd過濾膜進(jìn)行濃縮脫鹽。
優(yōu)選地，收集步驟3)離心后的臍帶組織，重復(fù)使用1～3次。
另一方面，本發(fā)明提供了一種保存從臍帶組織中提取的復(fù)合細(xì)胞因子的方法，將所述復(fù)合細(xì)胞因子分裝于西林瓶中，每瓶5ml。在3h～6h內(nèi)，冷凍到﹣50℃，抽真空干燥后，使溫度上升到5±3℃，可長期保存?zhèn)溆谩?/p>
使用時，將所述凍干的復(fù)合細(xì)胞因子加入2-4倍體積的滅菌用水溶解。例如將所述凍干的復(fù)合細(xì)胞因子每5ml加入10～20ml滅菌用水溶解。
再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的從臍帶組織中提取的復(fù)合細(xì)胞因子；
優(yōu)選地，所述復(fù)合細(xì)胞因子包括干細(xì)胞因子(scf)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(sdf-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胰島素樣生長因子(igf)、白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mcp-1)、金屬蛋白酶移植因子(timp-1)。
再另一方面，本發(fā)明提供了使用本發(fā)明的方法提取的復(fù)合細(xì)胞因子或者本發(fā)明的復(fù)合細(xì)胞因子在制備用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)、醫(yī)療美容、生物3d打印的材料或組合物中的用途。
本發(fā)明還提供了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織修復(fù)、醫(yī)療美容或生物3d打印的材料或組合物，其包含使用本發(fā)明的方法提取的復(fù)合細(xì)胞因子或者本發(fā)明的復(fù)合細(xì)胞因子。
本發(fā)明利用生物技術(shù)美容，將復(fù)合細(xì)胞因子用于外用美容，通過補(bǔ)充促進(jìn)表皮細(xì)胞代謝和增殖的生物活性因子，從根本上改善皮膚的生理狀態(tài)，促進(jìn)表皮組織的修復(fù)和代謝，促進(jìn)細(xì)胞外某些生物大分子(如透明質(zhì)酸、糖蛋白等)的合成；可使皮膚異常細(xì)嫩年輕；可淡化色斑，平復(fù)皺紋；可減輕日曬對皮膚的損傷；還具有顯著抗衰老作用，故嫩膚美容效果顯著，且安全可靠，無副作用。復(fù)合細(xì)胞因子相互作用，可顯著促進(jìn)人上皮組織的生成和增殖，美容效果顯著增強(qiáng)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點和效果：
1.本發(fā)明直接從臍帶組織中獲得復(fù)合細(xì)胞因子，這些復(fù)合細(xì)胞因子均為人體成分，可以直接被皮膚吸收，避免過敏反應(yīng)，無副作用。
2.本發(fā)明的每種細(xì)胞因子都為人體的內(nèi)源細(xì)胞因子，具有促進(jìn)皮膚新陳代謝的功能。
3.本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明的方法得到的細(xì)胞復(fù)合因子，特別適合用于進(jìn)行表皮組織的修復(fù)和代謝，因此在嫩膚美容，除皺抗斑中具有出乎意料的效果(詳見本申請實施例3)
4.本發(fā)明的方法不涉及高溫及化學(xué)滅菌的方式，僅僅利用過濾法去除微生物污染，既避免了產(chǎn)品出現(xiàn)污染變質(zhì)問題，又保證生物活性成分不被高溫、輻射或化學(xué)殺菌劑改變結(jié)果，保證了產(chǎn)品中細(xì)胞因子的活性，使產(chǎn)品效果穩(wěn)定。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
實施例1提取復(fù)合細(xì)胞因子
所述臍帶組織購自三甲醫(yī)院婦產(chǎn)科，
1)臍帶組織的處理：選取無傳染病源的臍帶組織，4℃保存碘伏浸泡1分鐘后，75％酒精浸泡脫碘，0.9％生理鹽水沖洗3次，將臍帶組織利用機(jī)械力剪切成0.1～0.3㏄大小的組織塊。
2)復(fù)合蛋白因子的富集：收集步驟1)處理得到的組織塊，加入適量生理鹽水1000r/min離心5min一次，然后加入0.9％生理鹽水到收集的組織塊中(體積比1∶3＝組織塊∶0.9％生理鹽水)混勻，將混勻的組織塊，取適量轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、3％co2培養(yǎng)箱中孵化。
3)復(fù)合蛋白因子的分離：收集步驟2)的孵化2～3天后的組織塊和上清液，1400r/min離心5min一次，收集上清液備用
4)復(fù)合蛋白因子的收集保存：將步驟3)得到的上清液加壓分別通過120μm、70μm、50μm、25μm的濾器，過濾條件為進(jìn)0.3～0.6mpa，溫度為5±3℃，收集過濾器后的上清液截留分子量3kd過濾膜進(jìn)行濃縮脫鹽，既得液體。
保存時，首先將所述復(fù)合細(xì)胞因子在3h～6h內(nèi)冷凍到﹣50℃，抽真空干燥使溫度上升到5±3℃，然后長期5±3℃保存?zhèn)溆谩?/p>
實施例2本發(fā)明的復(fù)合細(xì)胞因子成分
本發(fā)明獲得的為多種復(fù)合細(xì)胞因子的復(fù)合物，根據(jù)生物活性蛋白的性質(zhì)及主要功能選取5個代表性指標(biāo)檢測生物活性蛋白含量的變化。
應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)，分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中干細(xì)胞因子(scf)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(sdf-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vegf)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bfgf)、肝細(xì)胞生長因子(hgf)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gm-csf)、胰島素樣生長因子(igf)、白介素-6(il-6)、白介素-8(il-8)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(mcp-1)、金屬蛋白酶移植因子(timp-1)的水平，具體步驟如下。
(1)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣:在酶標(biāo)包被板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品10個孔，于第一、第二孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品100μl，然后在第一、第二孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻，混勻后從第一、第二孔中分別取100μl，然后分別加到第三、第四孔，然后在第三、第四孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl混勻，然后在第三、第四孔中先分別各取50μl棄掉，然后再各取50μl分別加到第五、第六孔中，并在第五、第六孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中各取50μl分別加到第九、第十孔，然后再在第九、第十孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻，最后從第九、第十孔各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為180ug/l，120ug/l，60ug/l，30ug/l，15ug/l)。
(2)加樣:分別設(shè)待測樣品孔及空白孔對照(空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)。首先在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中分別加入樣品稀釋液40μl，然后再加入待測樣品10μl(樣品最終的稀釋度為5倍)，輕輕晃動混勻。
(3)溫育:用封板膜密封板，并置于37℃恒溫箱中，溫浴30分鐘。
(4)配液:將30倍濃縮的洗滌液用蒸餾水稀釋30倍后備用。
(5)洗滌:揭掉封板膜，棄去板中的液體，甩干，然后在每孔中加滿洗滌液，靜置30秒后棄去孔中的液體，并如此重復(fù)5次，然后甩干。
(6)加酶:除空白孔外，其余每孔均加入酶標(biāo)試劑50μl。
(7)溫育:用封板膜密封板后，置于37℃恒溫箱，溫育30分鐘。
(8)洗滌:小心揭開封板膜，棄去孔中的液體，甩干，并在每孔中加滿洗滌液，靜置30秒后棄去液體，如此重復(fù)5次，然后甩干。
(9)顯色:首先將每孔中分別加入顯色劑a50μl，然后再加入顯色劑b50μl，輕輕震蕩混勻，然后置于37℃恒溫箱中，避光顯色15分鐘。
(10)終止:顯色完成后，將每孔中各加入終止液50μl，終止反應(yīng)(此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色)。
(11)測定:終止反應(yīng)后立即將酶標(biāo)包被板，放入酶標(biāo)儀中。以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(od值)。測定均在加終止液后15分鐘內(nèi)完成。
(12)計算:首先以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，od值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后再根據(jù)樣品的od值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度，或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與od值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的od值代入方程式，計算出樣品的濃度，再乘以稀釋的倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
數(shù)據(jù)均以
實施例3本發(fā)明的細(xì)胞因子的功能
實驗組：選取凍干的復(fù)合細(xì)胞因子加入10～20ml滅菌用水溶解，浸透空白壓縮面膜。
對照組：選取10～20ml滅菌用水，浸透空白壓縮面膜。
實驗對象：實驗志愿者來廣州市周邊地區(qū)，面部皮膚由于痤瘡、皮膚炎癥、疤痕或衰老而產(chǎn)生色斑及皺紋。實驗剔除妊娠、擬妊娠或哺乳期女性，剔除其他皮膚病患者，如日光性皮炎、面部銀屑病、脂溢性皮炎及蕁麻疹。志愿者在臨床觀察期禁止食用辛辣、刺激的食品，戒煙、戒酒。志愿者從臨床前2周開始，不使用激素類藥物和抗過敏藥物，不使用輔助護(hù)膚品。志愿者自愿參加實驗，簽訂知情同意書。
實驗方法：(1)嫩膚、去皺、祛斑試驗
選取25～55歲志愿者120人，分成兩組，男女對半，每組60人。每組分別使用上述實驗組和空白對照組，連續(xù)使用一個月，然后評價其效果。
(2)安全性試驗
在實驗方法(1)試驗中，同時觀察對皮膚的致敏性、刺激性和其他不良反應(yīng)。
實驗結(jié)果：嫩膚、去皺、祛斑試驗和安全性試驗
盡管在此公開了本發(fā)明的各個方面和實施例，但其他方面和實施例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言也是顯而易見的。在此公開的各個方面和實施例僅用于說明目的，而非限制目的。本發(fā)明的保護(hù)范圍和主旨僅通過后附的權(quán)利要求書來確定。