本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種檢測dna聚合酶活性的方法及檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：dna聚合酶(dnapolymerase)是細(xì)胞復(fù)制dna中的重要作用酶，在特定的條件下能夠誘導(dǎo)dna鏈的復(fù)制延長。生物體內(nèi)較為重要的dna聚合酶例如有t4dna聚合酶、klenow酶(又稱klenow片段，klenowfragment)和dna聚合酶i(dna-poli)等。其中t4dna聚合酶是由t4噬菌體聚合酶i基因編碼，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。t4dna聚合酶是基因工程技術(shù)中一種重要的工具酶，在高通量測序(nextgenerationsequencing)文庫構(gòu)建的過程具有重要的作用。傳統(tǒng)的檢測dna聚合酶活性的方法一般采用放射性同位素法，將dna聚合酶催化的32p標(biāo)記的dntp摻入到小牛胸腺dna中。經(jīng)過tca沉淀、whatman濾紙過濾，通過測定酸不溶性物質(zhì)中放射性的含量，從而計算聚合酶活性。這種方法易產(chǎn)生放射性污染、操作繁瑣，難以實現(xiàn)高通量的檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種非放射性、操作簡便的檢測dna聚合酶活性的方法及檢測試劑盒。一種檢測dna聚合酶活性的方法，包括以下步驟：提供待補平模板，所述待補平模板包括第一模板鏈和第二模板鏈，所述第一模板鏈包括第一dna片段，所述第二模板鏈包括第二dna片段以及與所述第二dna片段5’端相連接的凸出片段，所述第二dna片段與所述第一dna片段堿基互補，所述凸出片段中含有u堿基；在dntp存在的條件下，將待測dna聚合酶與足量的所述待補平模板混合，使得所述第一dna片段的3’端延伸形成補平片段，得到補平模板，所述補平片段與所述凸出片段堿基互補；將所述補平模板與正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)，其中所述正向引物針對所述凸出片段設(shè)計，所述反向引物針對所述第一dna片段的5’端設(shè)計，所述探針用于檢測所述第一dna片段；以及獲取所述實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值，將所述ct值帶入由dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到所述待測dna聚合酶的酶活性。在一個實施方式中，所述由dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過如下操作得到：將dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，獲得梯度酶活性的所述dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品；在dntp存在的條件下，分別將每一個酶活性的所述dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品與足量的所述待補平模板混合，得到多個補平模板，所述多個補平模板分別為每一個酶活性的所述dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的補平模板；分別將所述多個補平模板與正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)；以及獲取每一個酶活性的所述dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值，根據(jù)所述ct值與酶活性的對應(yīng)關(guān)系建立所述標(biāo)準(zhǔn)曲線。在一個實施方式中，所述第一模板鏈的堿基序列如seqidno.1所示，所述第二模板鏈的堿基序列如seqidno.2所示。在一個實施方式中，所述正向引物的堿基序列如seqidno.3所示，所述反向引物的堿基序列如seqidno.4所示。在一個實施方式中，所述探針的堿基序列如seqidno.5所示。在一個實施方式中，所述將待測dna聚合酶與足量的所述待補平模板混合的操作中，混合的溫度為25℃～40℃，混合的時間為0.5h～1.5h。在一個實施方式中，所述將所述補平模板、正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的操作中，所述熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)條件為：45℃～55℃、20min～40min，1～3個循環(huán)；93℃～97℃、5min～15min，1～3個循環(huán)；以及90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45個循環(huán)。在一個實施方式中，所述dna聚合酶選自t4dna聚合酶、klenow酶和dna聚合酶i中的至少一種。一種檢測dna聚合酶活性的檢測試劑盒，包括待補平模板、正向引物、反向引物和探針；所述待補平模板包括第一模板鏈和第二模板鏈，所述第一模板鏈包括第一dna片段，所述第二模板鏈包括第二dna片段以及與所述第二dna片段5’端相連接的凸出片段，所述第二dna片段與所述第一dna片段堿基互補，所述凸出片段中含有u堿基；所述正向引物針對所述凸出片段設(shè)計；所述反向引物針對所述第一dna片段的5’端設(shè)計；所述探針針對所述第一dna片段中的部分堿基設(shè)計。在一個實施方式中，第一模板鏈的堿基序列如seqidno.1所示，所述第二模板鏈的堿基序列如seqidno.2所示，所述正向引物的堿基序列如seqidno.3所示，所述反向引物的堿基序列如seqidno.4所示，所述探針的堿基序列如seqidno.5所示。上述檢測dna聚合酶活性的方法，在dntp存在的條件下，將待測dna聚合酶與足量的待補平模板混合后，通過待測dna聚合酶誘導(dǎo)待補平模板中的第一dna片段的3’端延伸形成與凸出片段的堿基互補的補平片段，從而得到補平模板。將補平模板、正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)。補平模板中的u堿基被足量的udg酶消化去除，得到適于pcr擴(kuò)增的模板，正向引物針對凸出片段設(shè)計，反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，即正向引物能夠結(jié)合補平片段，誘導(dǎo)第一模板鏈擴(kuò)增。而未經(jīng)補平的模板由于沒有形成補平片段，經(jīng)消化酶去除u堿基后則無法與正向引物配對，即不能進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，不同酶活性的dna聚合酶和實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值(熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))存在穩(wěn)定的相關(guān)性，在足量的待補平模板的條件下，dna聚合酶的酶活性越高，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板的量越多，經(jīng)消化酶酶切后的獲得的適于pcr擴(kuò)增的模板的量也越多，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值越小。將待測dna聚合酶的ct值帶入由dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，運算即可獲得待測dna聚合酶的酶活性。上述檢測dna聚合酶活性的方法不需要放射性檢測，操作簡便，實驗結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的檢測。附圖說明圖1為一實施方式的檢測dna聚合酶活性的方法的流程圖；圖2為一實施方式的檢測dna聚合酶活性的方法的原理示意圖；圖3為不同稀釋倍數(shù)的t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品pcr擴(kuò)增后的擴(kuò)增曲線；圖4為以t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性作為橫坐標(biāo)，pcr擴(kuò)增反應(yīng)對應(yīng)的ct值作為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖5為以另一種t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性作為橫坐標(biāo)，pcr擴(kuò)增反應(yīng)對應(yīng)的ct值作為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖6為以自制的dna聚合酶的酶活性作為橫坐標(biāo)，pcr擴(kuò)增反應(yīng)對應(yīng)的ct值作為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體實施方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施例及附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。未特別說明，序列表中的堿基序列均為從5’端到3’端的順序。請參閱圖1，一實施方式的檢測dna聚合酶活性的方法包括以下步驟s110～s140。s110、提供待補平模板，該待補平模板包括第一模板鏈和第二模板鏈，第一模板鏈包括第一dna片段，第二模板鏈包括第二dna片段以及與第二dna片段5’端相連接的凸出片段，第二dna片段與第一dna片段堿基互補，凸出片段中含有u堿基。當(dāng)?shù)谝荒０彐満偷诙０彐溞纬呻p鏈后，由于第二dna片段與第一dna片段堿基互補，第二模板鏈中的凸出片段形成凸出末端，而第一模板鏈中的3’端凹陷。s120、在dntp存在的條件下，將待測dna聚合酶與足量的s110中的待補平模板混合，使得第一dna片段的3’端延伸形成補平片段，得到補平模板，補平片段與凸出片段堿基互補。dna聚合酶是細(xì)胞復(fù)制dna中的重要作用酶，在特定的條件下能夠誘導(dǎo)dna鏈的復(fù)制延長，dna聚合酶一般以dna為復(fù)制模板，將dna由5'端向3'端延伸。一實施方式檢測的dna聚合酶選自t4dna聚合酶、klenow酶和dna聚合酶i中的至少一種。具體在本實施方式中，檢測的dna聚合酶為t4dna聚合酶。具體地，待補平模板的量以及加入的dntp(脫氧核糖核苷三磷酸，包括datp、dgtp、dttp、dctp)為足量的，即不會因為待補平模板或dntp被消耗掉而導(dǎo)致反應(yīng)的終止，待補平模板或dntp可能是過量的也有可能是剛剛好。請參閱圖2，檢測dna聚合酶活性的方法的原理示意圖，待補平模板包括第一模板鏈10和第二模板鏈20，第一模板鏈10包括第一dna片段，第二模板鏈20包括第二dna片段以及與第二dna片段5’端相連接的凸出片段，凸出片段中含有u堿基。第一模板鏈10和第二模板鏈20形成雙鏈后，第一dna片段從5’端到3’端的堿基與第二dna片段從3’端到5’端的堿基互補。由于第二模板鏈20含有凸出片段，形成雙鏈后第二模板鏈20的5’端凸出而第一模板鏈10的3’端凹陷。在dntp存在的條件下，待測dna聚合酶與足量的待補平模板混合，通過待測dna聚合酶誘導(dǎo)待補平模板中的第一dna片段延伸形成與凸出片段堿基互補的補平片段。從而得到補平模板30，補平模板30為末端平滑的雙鏈模板。由于待補平模板的量為足量的，待測dna聚合酶量相對不足，反應(yīng)后體系中還存在未補平的雙鏈40。在一個實施方式中，第一模板鏈從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.1所示，而從3’端到5’端的堿基序列為：tagcaccgttcgacatgagataggcaagtcgccgtcggaaaccgatgccatcgagtcgacgagatagataataagctagaataataatataaa。第二模板鏈的序列如seqidno.2所示，在第二模板鏈中第二dna片段的從5’端到3’端的堿基序列為：atcgtggcaagctgtactctatccgttcagcggcagcctttggctacggtagctcagctgctctatctattattcgatcttattattatattt。與第二dna片段5’端相連接的凸出片段的序列為：cauauagcauaucgaucguagctg。如seqidno.1所示的第一模板鏈以及如seqidno.2所示的第二模板鏈，第一dna片段從5’端到3’端的堿基與第二dna片段從3’端到5’端的的堿基互補。通過待測dna聚合酶誘導(dǎo)待補平模板中的第一dna片段的3’端延伸形成補平片段，該補平片段從3’端到5’端的序列為gtatatcgtatagctagcatcgac。補平片段從3’端到5’端與凸出片段從5’端到3’端堿基互補。設(shè)計的第二模板鏈和第二模板鏈長度適宜，凸出片段的堿基數(shù)量合適，便于根據(jù)該模板鏈設(shè)計適宜的擴(kuò)增引物和探針。實驗結(jié)果表明，序列如seqidno.1所示的第二模板鏈和序列如seqidno.2所示的第二模板鏈組成的待補平模板能夠特異性的結(jié)合dna聚合酶，從而在待測dna聚合酶的誘導(dǎo)下得到補平模板。在一個實施方式中，在將待測dna聚合酶與足量的待補平模板混合的操作之前，還包括將待測dna聚合酶的樣品經(jīng)過sds-page跑膠，根據(jù)sds-page測定的蛋白濃度，初步確定樣品中dna聚合酶的酶活性，從而確定待補平模板的量，提高檢測的準(zhǔn)確性。在一個實施方式中，檢測的dna聚合酶為t4dna聚合酶，t4dna聚合酶是由t4噬菌體聚合酶i基因編碼，具有5’-3’聚合酶活性以及3’-5’外切酶活性。t4dna聚合酶是基因工程技術(shù)中一種重要的工具酶，在高通量測序(nextgenerationsequencing)文庫構(gòu)建的過程具有重要的作用。本實施方式利用t4dna聚合酶具有5’-3’聚合酶活性誘導(dǎo)待補平模板中的第一dna片段的3’端延伸形成與凸出片段的堿基互補的補平片段，從而得到補平模板。補平模板經(jīng)消化酶酶切去除u堿基后與引物配對，從而進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)，根據(jù)pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值檢測dna聚合酶的活性，檢測重現(xiàn)性好，即使0.3×10-6u/μl較低的酶活性依然能夠檢測出來，靈敏度高。在一個實施方式中，將待測dna聚合酶與足量的待補平模板混合的操作中，混合溫度為25℃～40℃，反應(yīng)時間為0.5h～1.5h，例如37℃下反應(yīng)1h。s130、將s120中得到的補平模板與正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)，其中正向引物針對凸出片段設(shè)計，反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，探針用于檢測第一dna片段。具體地，udg酶(尿嘧啶-dna糖基化酶)能夠消化雙鏈模板中的u堿基，切去部分凸出片段。請繼續(xù)參閱圖2，補平模板30經(jīng)udg酶去除u堿基后，得到擴(kuò)增模板50。加入正向引物和反向引物后，擴(kuò)增模板50中由第一dna片段的3’端延伸形成補平片段特異性的與正向引物51互補配對，從而進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。由于正向引物針對凸出片段設(shè)計，反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計。正向引物能夠與第一dna片段的3’端延伸形成補平片段互補，反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，反向引物能夠與第一dna片段復(fù)制后形成的互補鏈的3’端互補，使得含有第一dna片段的模板鏈實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。而未補平的雙鏈40經(jīng)消化酶酶切去除雙鏈模板中的u堿基后，得到一般的dna雙鏈60，該dna雙鏈60中不含有補平片段，從而無法與正向引物51配對，即不能進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。在足量的待補平模板的條件下，dna聚合酶的酶活性越高，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板30的量越多，酶切后的獲得的擴(kuò)增模板50的量也越多，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)相應(yīng)的越少，即ct值越小。相反，dna聚合酶的酶活性越低，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板30的量越少，酶切后的獲得的擴(kuò)增模板50的量也越少，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)相應(yīng)的越多，即ct值越大。將待測dna聚合酶與相應(yīng)的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)比較運算即可獲得待測dna聚合酶的酶活性。具體地，第一模板鏈的堿基序列如seqidno.1所示，第二模板鏈的堿基序列如seqidno.2所示。經(jīng)足量的消化酶酶切去除雙鏈模板中的u堿基后，seqidno.2中的cauauagcauaucgaucgu片段被去除。在一個實施方式中，正向引物的堿基序列與凸出片段中的部分或全部的堿基序列相同，反向引物的堿基序列與第一dna片段5’端的部分堿基序列相同。正向引物針對凸出片段設(shè)計，從而與第一dna片段的3’端延伸形成補平片段互補，特異性誘導(dǎo)擴(kuò)增模板中含有第一dna片段的這一條dna單鏈復(fù)制擴(kuò)增。反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，與第一dna片段中的部分堿基序列相同。在前期的擴(kuò)增反應(yīng)中，能夠與少量的第二dna片段中部分堿基序列互補，誘導(dǎo)擴(kuò)增模板中含有第二dna片段的這一條dna單鏈復(fù)制擴(kuò)增。之后，反向引物與第一dna片段復(fù)制后形成的互補鏈的3’端互補，即誘導(dǎo)第一dna片段的復(fù)制后形成的互補鏈的擴(kuò)增。正向引物與反向引物配合，使得含有第一dna片段的模板鏈實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。具體地，正向引物和反向引物的摩爾比為0.5～2:1，例如1:1。具體地，正向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.3所示，反向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.4所示。正向引物和反向引物堿基數(shù)合理，快速誘導(dǎo)擴(kuò)增模板進(jìn)行擴(kuò)增。具體地，探針用于檢測第一dna片段，探針的兩端分別結(jié)合有熒光報告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。探針的堿基序列與第一dna片段中的部分堿基序列相同，探針能夠捕獲擴(kuò)增后形成的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)熒光強度實時監(jiān)控pcr反應(yīng)的進(jìn)程。在一個實施方式中，探針從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.5所示。探針堿基數(shù)合理，能夠特異性的捕獲擴(kuò)增后形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。具體地，熒光報告基團(tuán)結(jié)合在探針的5’端，熒光淬滅基團(tuán)結(jié)合在探針的3’端。熒光報告基團(tuán)例如為fam(6-羧基熒光素)，熒光淬滅基團(tuán)例如為bhq1。具體地，正向引物、反向引物以及探針的摩爾比為0.5～2:0.5～2：1，例如1：1：1。在一個實施方式中，將補平模板與正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的操作中，除加入正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶外，還包括加入耐高溫dna聚合酶。耐高溫dna聚合酶例如為hotsarttaq酶，使得dna擴(kuò)增過程中保持高保真度。在一個實施方式中，將補平模板、正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的操作中，熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)條件為：45℃～55℃、20min～40min，1～3個循環(huán)，93℃～97℃、5min～15min，1～3個循環(huán)；以及90℃～100℃、15s～25s，50℃～60℃、15s～25s，70℃～75℃、25s～35s，35～45個循環(huán)。進(jìn)一步地，熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熱循環(huán)條件為：50℃、30min，1個循環(huán)；95℃、10min，1個循環(huán)；94℃、20s，55℃、20s，72℃、30s，40個循環(huán)。具體地，50℃、30min，1個循環(huán)使得udg酶在適宜的條件下去除補平模板中u堿基，得到擴(kuò)增模板。95℃、10min，1個循環(huán)，使得擴(kuò)增模板中地雙鏈打開。94℃、20s，55℃、20s，72℃、30s，40個循環(huán)，pcr循環(huán)擴(kuò)增條件，在pcr循環(huán)擴(kuò)增中能夠收集到熒光。s140、獲取實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值，將ct值帶入由dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到待測dna聚合酶的酶活性。在足量的待補平模板的條件下，dna聚合酶的酶活性越高，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板的量越多，udg酶切后的獲得的擴(kuò)增模板的量也越多，在pcr擴(kuò)增反應(yīng)中，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的熒光信號到達(dá)設(shè)定域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)相應(yīng)的越少，即pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值越小。因此通過將待測dna聚合酶與相應(yīng)的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)比較運算即可獲得待測dna聚合酶的酶活性。具體地，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值(cycle)為pcr擴(kuò)增反應(yīng)中熒光信號開始由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段所對應(yīng)的循環(huán)數(shù)。研究結(jié)果表明，不同酶活性的dna聚合酶和ct值的對數(shù)具有良好的線性關(guān)系，因此通過將待測dna聚合酶與相應(yīng)的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)相同的補平條件和酶切條件后獲得擴(kuò)增模板，比較兩者擴(kuò)增模板pcr擴(kuò)增反應(yīng)中所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即可獲得待測dna聚合酶的酶活性。在一個實施方式中，由dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線通過如下操作得到：將dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，獲得梯度酶活性的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品。具體地，進(jìn)行梯度稀釋所用的稀釋液例如為te緩沖液。在dntp存在的條件下，分別將每一個酶活性的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品與足量的待補平模板混合，得到多個補平模板，其中多個補平模板分別為每一個酶活性的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的補平模板。分別將多個補平模板與正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)。獲取每一個酶活性的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值，根據(jù)ct值與酶活性的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測時，將待測dna聚合酶在對應(yīng)的在pcr擴(kuò)增反應(yīng)中獲得的ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中運算即可獲得待測dna聚合酶的活性。上述檢測dna聚合酶活性的方法為非放射性的檢測，操作簡便。待測dna聚合酶誘導(dǎo)待補平模板中的第一dna片段延伸形成與凸出片段的堿基互補補平片段，從而將待補平模板補平形成補平模板。將補平模板、正向引物、反向引物、探針、dntp以及足量的udg酶混合進(jìn)行實時熒光定量pcr擴(kuò)增反應(yīng)。補平模板中的u堿基被足量的udg酶消化去除，得到適于pcr擴(kuò)增的模板，正向引物針對凸出片段設(shè)計，反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，即正向引物能夠結(jié)合補平片段，誘導(dǎo)第一模板鏈擴(kuò)增。而未經(jīng)補平的模板由于沒有形成補平片段，經(jīng)消化酶去除u堿基后則無法與正向引物配對，即不能進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)。根據(jù)不同酶活性的dna聚合酶和pcr擴(kuò)增反應(yīng)的ct值與相應(yīng)的dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的ct值比較運算即可獲得待測dna聚合酶的酶活性。實驗結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)高通量的檢測。一實施方式的檢測dna聚合酶活性的檢測試劑盒包括待補平模板、正向引物、反向引物和探針。其中，待補平模板包括第一模板鏈和第二模板鏈，第一模板鏈包括第一dna片段，第二模板鏈包括第二dna片段以及與所述第二dna片段5’端相連接的凸出片段，第二dna片段與第一dna片段堿基互補，凸出片段中含有u堿基。正向引物針對凸出片段設(shè)計，具體地，正向引物的堿基序列與凸出片段中的部分或全部的堿基序列相同。反向引物針對第一dna片段的5’端設(shè)計，具體地，反向引物的堿基序列與第一dna片段5’端的部分堿基序列相同。探針針對第一dna片段中的部分堿基設(shè)計。pcr擴(kuò)增時，探針用于檢測第一dna片段。探針的堿基序列與第一dna片段中的部分堿基序列相同。在一個實施方式中，第一模板鏈從5’端到3’端的序列如seqidno.1所示，第二模板鏈從5’端到3’端的序列如seqidno.2所示。設(shè)計的第一模板鏈和第二模板鏈長度適宜，凸出片段的堿基數(shù)量合適，便于根據(jù)該模板鏈設(shè)計適宜的擴(kuò)增引物和探針。實驗結(jié)果表明，序列如seqidno.1所示的第一模板鏈和序列如seqidno.2所示的第二模板鏈組成的待補平模板能夠特異性的結(jié)合dna聚合酶，從而在待測dna聚合酶的誘導(dǎo)下得到補平模板。具體地，正向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.3所示，反向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.4所示。具體地，探針從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.5所示。具體地，熒光報告基團(tuán)結(jié)合在探針的5’端，熒光淬滅基團(tuán)結(jié)合在探針的3’端。熒光報告基團(tuán)例如為fam(6-羧基熒光素)，熒光淬滅基團(tuán)例如為bhq1。具體地，使用時，正向引物、反向引物以及探針的的摩爾比為0.5～2:0.5～2：1，例如1：1：1。上述檢測試劑盒可用于檢測t4dna聚合酶、klenow酶和dna聚合酶i中的至少一種dna聚合酶的酶活性。上述檢測試劑盒用于檢測dna聚合酶活性時，不需要放射性的試劑，操作簡便、快速，檢測的重現(xiàn)性好、靈敏度高。以下為具體實施例部分。實施例中采用試劑和儀器如非特別說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)選擇。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如文獻(xiàn)、書本中所述的條件或者試劑盒生產(chǎn)廠家推薦的方法實現(xiàn)。實施例1由t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線1.1、提供包括第一模板鏈和第二模板鏈的待補平模板，第一模板鏈的堿基序列如seqidno.1所示，第二模板鏈的堿基序列如seqidno.2所示。取10μl的t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品(3u/μl)加入90μl的1×te緩沖液中，進(jìn)行連續(xù)6個10倍梯度稀釋，形成6個標(biāo)準(zhǔn)品梯度。分別按下表1配置補平反應(yīng)體系，補平反應(yīng)條件為：37℃，1h，補平后得到補平模板。表1：補平反應(yīng)體系試劑體積10×t4dna聚合酶緩沖液5μldntp(10mmol/l)0.2μl待補平模板(0.025μmol/l)10μl梯度稀釋t4dna聚合酶5μlddh2o補充至總體積為50μl其中，t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品為商品化t4dna聚合酶(neb-t4dnapolymerase)。10×的t4dna聚合酶緩沖液的配方如下：nacl500mmol/l、tris-hcl100mmol/l、mgcl2100mmol/l、dtt10mmol/l，25℃下ph為7.9。1.2、取10μl1.1中補平后的體系按下表2配置pcr反應(yīng)體系，其中，正向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.3所示。反向引物從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.4所示。探針從5’端到3’端的堿基序列如seqidno.5所示，探針的5’端結(jié)合有熒光報告基團(tuán)fam，3’端結(jié)合有熒光淬滅基團(tuán)bhq1。表2：pcr反應(yīng)體系1.3、將按表2配置pcr反應(yīng)體系，每個梯度稀釋的樣品至少兩份樣品，置于熒光定量pcr擴(kuò)增儀中，按下表3設(shè)置pcr擴(kuò)增條件，并實時檢測熒光亮度，獲得擴(kuò)增曲線。表3：pcr擴(kuò)增條件不同稀釋倍數(shù)的t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的pcr后的擴(kuò)增曲線如圖3所示，對應(yīng)的ct值如下表4。表4：不同稀釋倍數(shù)的t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的ct值從結(jié)果可以看出，在足量的待補平模板的條件下，t4dna聚合酶的酶活性越高，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板的量越多，酶切后的獲得的擴(kuò)增模板的量也越多，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的對應(yīng)的ct值越小。相反，t4dna聚合酶的酶活性越低，誘導(dǎo)補平后獲得的補平模板的量越少，酶切后的獲得的擴(kuò)增模板的量也越少，pcr擴(kuò)增反應(yīng)的對應(yīng)的ct值越大。以t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性為橫坐標(biāo)，pcr擴(kuò)增反應(yīng)對應(yīng)的ct值為縱坐標(biāo)用graphpadprism5作圖得到圖4，t4dna聚合酶標(biāo)準(zhǔn)品的酶活性與ct值呈對數(shù)型線性關(guān)系，得到曲線方程為y＝-0.876ln(x)+13.235，r2＝0.9982。實施例2檢測未知t4dna聚合酶的酶活性將待檢樣品sds-page跑膠，根據(jù)蛋白濃度初步標(biāo)定待檢樣品中t4dna聚合酶酶活。取10μl待檢樣品進(jìn)行100倍稀釋，平行稀釋8組。根據(jù)實施例1中表1配制補平體系，按照表2的pcr反應(yīng)體系配置pcr反應(yīng)體系，并根據(jù)表3中的pcr擴(kuò)增條件進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲取8組樣品pcr擴(kuò)增對應(yīng)的ct值，結(jié)果如表5所示。表5：t4dna聚合酶樣品的ct值樣品標(biāo)號1#2#3#4#5#6#7#8#ct值16.6716.6816.6116.6516.6716.6216.5816.6將樣品對應(yīng)的ct值分別帶入圖4的曲線方程中，推算待檢樣品中t4dna聚合酶的酶活，結(jié)果如下表6。表6：樣品中t4dna聚合酶的酶活性通過多次重復(fù)實驗，并計算曲線的相關(guān)系數(shù)和待檢樣品的酶活，我們發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)和待檢樣品的酶活多次實驗間保持穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。實施例3檢測不同來源的t4dna聚合酶的酶活性為了進(jìn)一步驗證檢測方法的可行性，選擇兩種商品化t4dna聚合酶進(jìn)行檢測，商品化t4dna聚合酶1為neb-t4dnapolymerase，商品化t4dna聚合酶2為enzymatics-t4dnapolymerase。另外還檢測自行表達(dá)純化t4dna聚合酶的酶活性，自制t4dna聚合酶克隆自t4噬菌體dna聚合酶i基因，克隆至pet28a表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物采用常規(guī)層析方法純化至約98％的純度。兩種商品化的酶和自行表達(dá)純化t4dna聚合酶均先用標(biāo)準(zhǔn)放射性同位素?fù)饺敕y定，國際單位(iu)定義為：1小時內(nèi)使1nmol同位素標(biāo)記的datp摻入酸不溶性沉淀物所需的酶量定義為1個單位(u)。以放射性同位素標(biāo)定后的t4dna聚合酶作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后按照實施例1的方法獲得ct值并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如下表7。表7：不同來源的t4dna聚合酶的ct值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)其中，商品化t4dna聚合酶1曲線方程為：y＝-0.876ln(x)+13.235，r2＝0.9982(參見實施例1，曲線圖請參閱圖4)。商品化t4dna聚合酶2曲線方程為：y＝-0.881ln(x)+13.127，r2＝0.9992，曲線圖請參閱圖5。自制t4dna聚合酶曲線方程為：y＝-0.877ln(x)+13.211，r2＝0.9985，曲線圖請參閱圖6。上述結(jié)果表明，不同來源的t4dna聚合酶的聚合酶均可形成標(biāo)準(zhǔn)曲線，且ct值彼此無明顯差異。因此，這種標(biāo)準(zhǔn)曲線方法可作為聚合酶活性標(biāo)定。參照實施例2的方法，檢測未知t4dna聚合酶活性的ct值，每組重復(fù)8個樣品，結(jié)果如下表8。其中未知t4dna聚合酶8組樣品pcr擴(kuò)增對應(yīng)的ct值如表8所示。表8：未知t4dna聚合酶樣品的ct值未知樣品標(biāo)號1#2#3#4#5#6#7#8#ct值16.3116.2916.3316.3216.3416.2816.2716.3將未知t4dna聚合酶對應(yīng)的ct值分別帶入商品化t4dna聚合酶1曲線方程：y＝-0.876ln(x)+13.235，商品化t4dna聚合酶2曲線方程：y＝-0.881ln(x)+13.127自制t4dna聚合酶曲線方程：y＝-0.877ln(x)+13.211。計算檢樣品中t4dna聚合酶的酶活，結(jié)果如下表9。表9：未知樣品中t4dna聚合酶的酶活性上述結(jié)果表明，不同來源的t4dna聚合酶均可采用上述檢測方法進(jìn)行檢測，標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)小，表明檢測的重現(xiàn)性好、靈敏度高。以上具體實施例以檢測t4dna聚合酶的結(jié)果為例說明，可以理解，上述檢測方法對其他的dna聚合酶也依然能夠檢測。以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。sequencelisting<110>菲鵬生物股份有限公司、廣東菲鵬生物有限公司<120>檢測dna聚合酶活性的方法及檢測試劑盒<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>93<212>dna<213>人工序列<400>1aaatataataataagatcgaataatagatagagcagctgagctaccgtagccaaaggctg60ccgctgaacggatagagtacagcttgccacgat93<210>2<211>117<212>dna<213>人工序列<400>2cauauagcauaucgaucguagctgatcgtggcaagctgtactctatccgttcagcggcag60cctttggctacggtagctcagctgctctatctattattcgatcttattattatattt117<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3catatagcatatcgatcgtagctg24<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4aaatataataataagatcgaata23<210>5<211>30<212>dna<213>人工序列<400>5tggcaagctgtactctatccgttcagcggc30當(dāng)前第1頁12