本發(fā)明屬于藥物化學技術(shù)領域，具體涉及一種富馬酸盧帕替芬的雜質(zhì)及其制備方法和檢測方法。
背景技術(shù)：
富馬酸盧帕替芬是一種多通路全面抑制過敏藥物，其優(yōu)勢在于：(1)去除了酮替芬氮原子上的甲基(導致鎮(zhèn)靜作用)，保留了其母核的抗組織胺和穩(wěn)定肥大細胞作用；(2)引入3-吡啶甲基功能團(有助于抗血小板激活因子作用和抑制嗜酸細胞作用)。因此，富馬酸盧帕替芬具有多重抗過敏作用：抗組胺作用、肥大細胞穩(wěn)定作用、抗血小板活化因子作用、抗嗜酸性粒細胞作用，以及降低了酮替芬的中樞副作用。
富馬酸盧帕替芬的合成工藝路線方案為：
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明人通過對上述富馬酸盧帕替芬合成工藝的細致研究，發(fā)現(xiàn)制備富馬酸盧帕替芬過程中，其反應中間體吡啶環(huán)上的氮位置進一步與胺成鹽反應，形成季銨鹽化合物，即一種富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)。
本發(fā)明的目的在于提供了一種富馬酸盧帕替芬新雜質(zhì)化合物及其制備方法，該新雜質(zhì)可用于控制富馬酸盧帕替芬及其制劑的質(zhì)量，為富馬酸盧帕替芬原料藥及其制劑的質(zhì)量進行有效的控制夯實了基礎。
用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：
本發(fā)明提供一種式ⅰ所示化合物，
其中，陰離子x-選自f-、cl-、br-、i-；優(yōu)選地，陰離子x-為br-。
式ⅰ所示化合物可出現(xiàn)于富馬酸盧帕替芬的制備過程中，可作為雜質(zhì)存在于富馬酸盧帕替芬合成產(chǎn)物中。在本發(fā)明中，術(shù)語“式ⅰ所示化合物”與“富馬酸盧帕替芬新雜質(zhì)化合物”、“新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物”以及其類似術(shù)語可互換使用。
本發(fā)明所述式ⅰ所示化合物的制備方法，該制備方法包括式ⅱ所示化合物與式ⅲ所示化合物在堿的存在下，在有機溶劑中反應生成式ⅰ所示化合物，
優(yōu)選地，所述式ⅱ所示化合物與所述式ⅲ所示化合物的摩爾比為1：1～6；優(yōu)選1：2～4；
優(yōu)選地，所述式ⅱ所示化合物與堿的摩爾比為1：3～8；優(yōu)選1：4～6；
優(yōu)選地，所述式ⅱ所示化合物與有機溶劑的摩爾比為1：10～20；優(yōu)選1：16。
優(yōu)選地，所述制備方法包括以下步驟：
(1)將式ⅱ所示化合物、有機溶劑混合，攪拌，后加入堿，攪拌，在15～25℃下加入式ⅲ所示化合物，后加熱至30～80℃，反應2～5h；
優(yōu)選地，所述加熱至35～45℃；
優(yōu)選地，所述反應時間為2h；
優(yōu)選地，所述步驟(1)為：將式ⅱ所示化合物、有機溶劑混合，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌，后加入堿，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌20～40min，在15～25℃下加入式ⅲ所示化合物，后加熱至35～45℃，反應2h。
優(yōu)選地，所述堿為有機堿和/或無機堿；
優(yōu)選地，所述有機堿選自三乙胺、吡啶、甲醇鈉、乙醇鈉、叔丁醇鈉和叔丁醇鉀中的一種或多種；
優(yōu)選地，所述無機堿選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀和碳酸銫中的一種或多種；
優(yōu)選地，所述堿為三乙胺。
優(yōu)選地，所述有機溶劑選自鹵代烴類溶劑、芳烴類溶劑、酮類溶劑、醚類溶劑、酯類溶劑和腈類溶劑中的一種或多種；
優(yōu)選地，所述鹵代烴類溶劑選自氯仿、二氯甲烷和四氯化碳中的一種或多種；
優(yōu)選地，所述芳烴類溶劑為甲苯和/或二甲苯；
優(yōu)選地，所述酮類溶劑為丙酮和/或丁酮；
優(yōu)選地，所述醚類溶劑為乙醚和/或四氫呋喃；
優(yōu)選地，所述酯類溶劑為乙酸丁酯和/或乙酸乙酯；
優(yōu)選地，所述腈類溶劑為乙腈和/或丙腈；
優(yōu)選地，所述有機溶劑為二氯甲烷。
優(yōu)選地，所述制備方法還包括：
(2)將步驟(1)得到的反應液分別經(jīng)3-10％的nahco3溶液、水洗滌、干燥、過濾、濃縮；
優(yōu)選地，所述干燥溫度為50-70℃；
優(yōu)選地，所述干燥時間為5-7h；
優(yōu)選地，所述濃縮后的密度為1.5-1.8g/ml；
優(yōu)選地，所述步驟(1)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1。
優(yōu)選地，所述制備方法還包括：
(3)將步驟(2)得到的濃縮液與溶劑、反溶劑混合，加熱，攪拌，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，干燥，得到黃色顆粒；
優(yōu)選地，所述溶劑選自乙酸乙酯、無水乙醇、無水甲醇和丙酮中的一種或多種；優(yōu)選為乙酸乙酯；
優(yōu)選地，所述反溶劑選自乙醚、石油醚和正戊烷中的一種或多種；優(yōu)選為為石油醚；
優(yōu)選地，所述溶劑和反溶劑的體積比為1：2～35；優(yōu)選為1：3～15；
優(yōu)選地，所述步驟(2)得到的濃縮液、溶劑和反溶劑的體積比為1：3：15；
優(yōu)選地，所述步驟(3)為：
將步驟(2)得到的濃縮液與溶劑、反溶劑混合，加熱至50～90℃，優(yōu)選80～90℃，攪拌0.5～1h，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，50-70℃下干燥5-7h，得到黃色顆粒。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備方法包括：
(i)將式ⅱ所示化合物、有機溶劑混合，攪拌，后加入堿，攪拌，在15～25℃下加入式ⅲ所示化合物，后加熱至30～80℃，反應2～5h；
(ii)將步驟(i)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液、水洗滌，于50-70℃下干燥5-7h、過濾、濃縮至1.5-1.8g/ml，其中，所述步驟(i)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1。
(iii)將步驟(ii)得到的濃縮液與溶劑、反溶劑混合，加熱至80～90℃，攪拌0.5～1h，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，50-70℃下干燥5-7h，得到黃色顆粒。
本發(fā)明新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物以及本發(fā)明所述的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備方法制備的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的檢測方法，該檢測方法包括采用高效液相色譜法測定富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物；
優(yōu)選地，所述富馬酸盧帕替芬制備方法如下所示；
具體而言，所述富馬酸盧帕替芬由包括以下步驟的制備方法制備得到：
(a)室溫下，將去甲酮替芬游離堿、三氯甲烷混合攪拌，后加入三乙胺、dmap繼續(xù)攪拌，反應溫度不再升高后，15℃下投料所述式ⅲ所示化合物，后升溫繼續(xù)反應，液相監(jiān)控反應進程；
(b)室溫下，將步驟(a)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液、水洗滌，于50-70℃下干燥、過濾、濃縮；
(c)將步驟(b)得到的濃縮液經(jīng)正相硅膠柱分離，梯度洗脫(洗脫劑：甲醇-二氯甲烷溶液1-5％)，收集主成分，濃縮至干，即得到式ⅱ所示化合物；
(d)在乙醇二氯甲烷溶液中加入富馬酸，35℃下攪拌溶解至清，加入式ⅱ所示化合物，過濾，攪拌冷卻，保溫，后于0-6℃下攪拌15h，抽濾至干，70℃烘干，得到淺黃色固體富馬酸盧帕替芬成品。
進一步地，所述富馬酸盧帕替芬由包括以下步驟的制備方法制備得到：
(a)室溫下，將去甲酮替芬游離堿(sm，14.74g，49.9mmol)、三氯甲烷(320ml)混合，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌，后加入三乙胺(34.8ml，249.6mmol)，dmap(0.61g，4.99mmol)，繼續(xù)攪拌30min，觀察反應溫度不再升高，再緩慢投料式ⅲ所示化合物(5-甲基-3-(溴甲基)吡啶溴酸鹽)(39.8g，149.7mmol)，設置15℃，反應溫度超過25℃則停止加料，待溫度低于25℃則繼續(xù)加料，加料結(jié)束后，打開加熱裝置，升溫至35℃，繼續(xù)反應2-4h，hplc監(jiān)控反應情況；
(b)室溫下，將步驟(a)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液(320ml)、水(320ml)洗滌，于50-70℃下干燥5-7h、過濾、濃縮；其中，所述步驟(a)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1；
(c)將步驟(b)得到的濃縮液經(jīng)正相硅膠柱純化分離，梯度洗脫(洗脫劑：甲醇-二氯甲烷溶液1％-5％)，收集主成分，濃縮至干，呈泡沫狀固體即式ⅱ所示化合物，m＝10.0g，收率：50.0％；
(d)在250ml50％的乙醇二氯甲烷溶液中加入2.90g富馬酸，35℃下攪拌溶解至清，加入10.0g式ⅱ所示化合物，溶清過濾，濃縮至總體積的50-60％，攪拌冷卻至28℃保溫0.5h，攪拌冷卻至15℃保溫0.5h，0-6℃下冰浴攪拌15h，抽濾至干，70℃烘干5h，獲得淺黃色固體富馬酸盧帕替芬成品，稱重m＝8.39g，收率：65.1％。
并且所述高效液相色譜法的條件包括：
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～12min，流動相a為40％，流動相b為60％；
12～20min，流動相a為40％→10％，流動相b為60％→90％；
20～25min，流動相a為10％，流動相b為90％；
25～26min，流動相a為10％→40％，流動相b為90％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％。
優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件還包括：
流動相流速：0.5-1.5ml/min；優(yōu)選為1.0ml/min；
色譜柱柱溫：15～40℃；優(yōu)選為30℃；
檢測波長：200～400nm；優(yōu)選為297nm。
優(yōu)選地，所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為450～550:10；優(yōu)選500：10；
優(yōu)選地，所述流動相b中所述乙腈與水的體積比為450～550：10；優(yōu)選500：10。
優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的供試品溶液按照以下步驟來制備：
精密稱取富馬酸盧帕替芬20mg，置50ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的對照品溶液按照以下步驟來制備：
精密稱取雜質(zhì)式ⅰ所示化合物對照品1mg，置于100ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
優(yōu)選地，所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的檢測方法包括以下步驟：
色譜條件：
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～12min，流動相a為40％，流動相b為60％；
12～20min，流動相a為40％→10％，流動相b為60％→90％；
20～25min，流動相a為10％，流動相b為90％；
25～26min，流動相a為10％→40％，流動相b為90％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：0.5-1.5ml/min；優(yōu)選為1.0ml/min；
色譜柱柱溫：15～40℃；優(yōu)選為30℃；
波長：200～400nm；優(yōu)選為297nm；
優(yōu)選地，所述乙酸銨與乙腈的體積比為450～550：10；優(yōu)選500：10；
優(yōu)選地，所述流動相b中所述乙腈與水的體積比為450～550：10；優(yōu)選500：10；
供試品溶液：
精密稱取富馬酸盧帕替芬20mg，置50ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
對照品溶液：
精密稱取雜質(zhì)式ⅰ所示化合物對照品1mg，置于100ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定：
分別吸取供試品溶液和對照品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測量供試品溶液色譜圖上各吸收峰的峰面積，計算雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量。
本發(fā)明所述的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物以及本發(fā)明所述的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備方法制備的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物在表征所述富馬酸盧帕替芬質(zhì)量中的用途。
本發(fā)明中所述式ⅱ化合物可采用上述富馬酸盧帕替芬制備方法制備獲得，所述式?；衔锟刹捎靡韵潞铣陕肪€獲得：
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
本發(fā)明提供了一種富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物及其制備方法和檢測方法，可以將該新雜質(zhì)應用于檢測富馬酸盧帕替芬原料藥或其制劑樣品的質(zhì)量。通過檢測富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物，完善富馬酸盧帕替芬或其制劑的質(zhì)量標準；同時，該新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備方法沒有催化劑、沒有惰性氣體氛圍保護的條件下進行的，具有反應穩(wěn)定、條件溫和、操作簡單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點。
具體實施方式
以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。
所述式ⅱ所示化合物可采用上述富馬酸盧帕替芬制備方法獲得，制備路線如下；
所述式?；衔锟刹捎靡韵潞铣陕肪€獲得：
其它儀器及試劑：
儀器：高效液相色譜儀(島津lc-20a)，恒溫磁力攪拌器(長城科工貿(mào)hwcl-5)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(ika)，鼓風干燥箱(上海三發(fā)科學儀器dhg-9070型)，球形冷凝器，分液漏斗(1000ml)，茄型瓶(500ml)若干；
試劑:丙酮、thf、hbr、nabh4、bf3、et2o。
實施例1：本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備
本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備包括以下步驟：
(i)室溫下，將式ⅱ所示化合物(sm，20g，49.9mmol)、二氯甲烷(320ml))混合，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌，后加入三乙胺(27.8ml，199.7mmol)，繼續(xù)攪拌30min，觀察反應溫度不再升高，再緩慢投料式ⅲ所示化合物(5-甲基-3-(溴甲基)吡啶溴酸鹽)(26.5g，99.8mmol)，設置15℃，反應溫度超過25℃則停止加料，待溫度低于25℃則繼續(xù)加料，加料結(jié)束后，打開加熱裝置，升溫至35℃，繼續(xù)反應2h，hplc監(jiān)控反應情況。
(ii)室溫下，將步驟(i)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液(320ml)、水(320ml)洗滌，于50-70℃下干燥5-7h、過濾、濃縮至1.5-1.8g/ml，其中，所述步驟(i)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1。
(iii)將步驟(ii)得到的濃縮液與乙酸乙酯(35ml)、石油醚(175ml)混合，加熱60-70℃，攪拌0.5h，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，干燥，得到黃色顆粒，收率85.5％。
(新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物25.01g，85.5％)。esi-ms(m/s)：506.21hnmr(500mhz,meod)δ8.97(d,j＝18.3hz,2h),8.59(s,1h),8.49(s,1h),8.45(s,1h),7.90(s,1h),7.78(d,j＝5.0hz,1h),7.35–7.30(m,1h),7.23(td,j＝4.9,2.2hz,2h),7.20(dt,j＝6.0,2.4hz,1h),7.15(d,j＝5.0hz,1h),5.89(s,2h),4.27(d,j＝13.4hz,1h),3.79(s,2h),3.69(d,j＝13.5hz,1h),2.85(dd,j＝10.4,5.0hz,1h),2.76(dd,j＝10.1,4.8hz,1h),2.72–2.64(m,2h),2.59(s,3h),2.51(ddd,j＝14.0,9.6,4.3hz,1h),2.42(dd,j＝9.3,4.4hz,2h),2.39(s,3h),2.33–2.26(m,1h).
實施例2：本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備
本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備包括以下步驟：
(i)室溫下，將式ⅱ所示化合物(sm，20g，49.9mmol)、二氯甲烷(320ml))混合，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌，后加入三乙胺(34.8ml，249.6mmol)，繼續(xù)攪拌30min，觀察反應溫度不再升高，再緩慢投料式ⅲ所示化合物(5-甲基-3-(溴甲基)吡啶溴酸鹽)(39.8g，149.7mmol)，設置15℃，反應溫度超過25℃則停止加料，待溫度低于25℃則繼續(xù)加料，加料結(jié)束后，打開加熱裝置，升溫至40℃，繼續(xù)反應2h，hplc監(jiān)控反應情況。
(ii)室溫下，將步驟(i)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液(320ml)、水(320ml)洗滌，于50-70℃下干燥5-7h、過濾、濃縮至1.5-1.8g/ml，其中，所述步驟(i)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1。
(iii)將步驟(ii)得到的濃縮液與無水乙醇(20ml)、乙醚(100ml)，加熱80-90℃，攪拌1h，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，干燥，得到黃色顆粒，收率87.5％。
(新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物25.59g，87.5％)。esi-ms(m/s)：506.21hnmr(500mhz,meod)δ8.97(d,j＝18.3hz,2h),8.59(s,1h),8.49(s,1h),8.45(s,1h),7.90(s,1h),7.78(d,j＝5.0hz,1h),7.35–7.30(m,1h),7.23(td,j＝4.9,2.2hz,2h),7.20(dt,j＝6.0,2.4hz,1h),7.15(d,j＝5.0hz,1h),5.89(s,2h),4.27(d,j＝13.4hz,1h),3.79(s,2h),3.69(d,j＝13.5hz,1h),2.85(dd,j＝10.4,5.0hz,1h),2.76(dd,j＝10.1,4.8hz,1h),2.72–2.64(m,2h),2.59(s,3h),2.51(ddd,j＝14.0,9.6,4.3hz,1h),2.42(dd,j＝9.3,4.4hz,2h),2.39(s,3h),2.33–2.26(m,1h).
實施例3：本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備
本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的制備包括以下步驟：
(i)室溫下，將式ⅱ所示化合物(sm，20g，49.9mmol)、二氯甲烷(320ml))混合，60～80轉(zhuǎn)/min下攪拌，后加入三乙胺(52.2ml，299.4mmol)，繼續(xù)攪拌30min，觀察反應溫度不再升高，再緩慢投料式ⅲ所示化合物(5-甲基-3-(溴甲基)吡啶溴酸鹽)(53.0g，199.6mmol)，設置15℃，反應溫度超過25℃則停止加料，待溫度低于25℃則繼續(xù)加料，加料結(jié)束后，打開加熱裝置，升溫至40℃，繼續(xù)反應2h，hplc監(jiān)控反應情況。
(ii)室溫下，將步驟(i)得到的反應液分別經(jīng)5％的nahco3溶液(320ml)、水(320ml)洗滌，于50-70℃下干燥5-7h、過濾、濃縮至1.5-1.8g/ml，其中，所述步驟(i)得到的反應液、nahco3溶液和水的體積比為1：1：1。
(iii)將步驟(ii)得到的濃縮液與丙酮(30ml)、正戊烷(150ml)，加熱50-60℃，攪拌1h，冷卻至室溫后降溫至4～8℃，保持10～15h，析出固體顆粒，過濾，干燥，得到黃色顆粒，收率78.6％。
(新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物22.99g，78.6％)。esi-ms(m/s)：506.21hnmr(500mhz,meod)δ8.97(d,j＝18.3hz,2h),8.59(s,1h),8.49(s,1h),8.45(s,1h),7.90(s,1h),7.78(d,j＝5.0hz,1h),7.35–7.30(m,1h),7.23(td,j＝4.9,2.2hz,2h),7.20(dt,j＝6.0,2.4hz,1h),7.15(d,j＝5.0hz,1h),5.89(s,2h),4.27(d,j＝13.4hz,1h),3.79(s,2h),3.69(d,j＝13.5hz,1h),2.85(dd,j＝10.4,5.0hz,1h),2.76(dd,j＝10.1,4.8hz,1h),2.72–2.64(m,2h),2.59(s,3h),2.51(ddd,j＝14.0,9.6,4.3hz,1h),2.42(dd,j＝9.3,4.4hz,2h),2.39(s,3h),2.33–2.26(m,1h).
實施例4：采用高效液相色譜法測定本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物含量：
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～12min，流動相a為40％，流動相b為60％；
12～20min，流動相a為40％→10％，流動相b為60％→90％；
20～25min，流動相a為10％，流動相b為90％；
25～26min，流動相a為10％→40％，流動相b為90％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm；
供試品溶液：
精密稱取富馬酸盧帕替芬20mg，置50ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
對照品溶液：
精密稱取雜質(zhì)式ⅰ所示化合物對照品1mg，置于100ml容量瓶中，加入50％的乙腈水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定：
分別吸取供試品溶液和對照品溶液20μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測量供試品溶液色譜圖上各吸收峰的峰面積，計算雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量。
所述供試品溶液中如有與新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物保留時間一致的雜質(zhì)，按外標法計算，不得過0.5％；
ar：對照品峰面積
wr：對照品的稱量
x：標示量
s：稀釋倍數(shù)
wx:樣品稱樣量
s：稀釋倍數(shù)
ax：樣品峰面積
校正因子：f＝wr*x/(ar*s)
新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量：t％＝ax*f*/wx*100％
結(jié)論：
經(jīng)上述分析方法檢測，所述富馬酸盧帕替芬主峰保留時間t＝9.5-9.8min，新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的相對主峰保留時間△t＝0.45，能夠精確計算供試品中新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量。
本發(fā)明所述檢測方法能夠排除相鄰雜質(zhì)峰的干擾，確定富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物在色譜圖中的位置，并準確計算所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量，進而對所述富馬酸盧帕替芬及其制劑的質(zhì)量進行有效控制。
實施例5：本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的檢測方法的方法學考察：
1、精密度實驗
采用和實施例4相同的操作步驟和條件，精密量取同一對照品溶液，于同一天內(nèi)連續(xù)進樣5次，每次20μl，分別測定新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的峰面積，得出精密度見表1，表明精密度好。
表1：精密度實驗結(jié)果
2、穩(wěn)定性實驗
采用和實施例4相同的操作步驟和條件，取同一供試品溶液，分別于配制后的0，2，4，8，16，24h進樣分析，每次20μl，分別測定新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的峰面積積分值，見表2，表明供試品溶液在24小時內(nèi)穩(wěn)定。
表2：穩(wěn)定性實驗結(jié)果
3、重復性試驗
采用和實施例4相同的操作步驟和條件，制備樣品，分別測定新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的平均含量(mg/g)和rsd，見表3，結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性良好。
表3：重復性實驗結(jié)果
實施例6：本發(fā)明所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的檢測方法的梯度洗脫條件的選擇和優(yōu)化：
方法1
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；等度洗脫50min。
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
方法2
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～6min，流動相a為40％，流動相b為60％；
6～20min，流動相a為40％→20％，流動相b為60％→80％；
20～25min，流動相a為20％，流動相b為80％；
25～26min，流動相a為20％→40％，流動相b為80％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
方法3
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～15min，流動相a為40％，流動相b為60％；
15～20min，流動相a為40％→20％，流動相b為60％→80％；
20～25min，流動相a為20％，流動相b為80％；
25～26min，流動相a為20％→40％，流動相b為80％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
方法4
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～15min，流動相a為40％，流動相b為60％；
15～20min，流動相a為40％→15％，流動相b為60％→85％；
20～25min，流動相a為15％，流動相b為85％；
25～26min，流動相a為15％→40％，流動相b為85％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
方法5
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～12min，流動相a為40％，流動相b為60％；
12～20min，流動相a為40％→10％，流動相b為60％→85％；
20～25min，流動相a為10％，流動相b為90％；
25～26min，流動相a為10％→40％，流動相b為85％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
方法6
色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的c18色譜柱；
流動相：流動相a為0.01mol/l的乙酸銨-乙腈溶液，流動相b為乙腈-水溶液，進行梯度洗脫；所述流動相a中所述乙酸銨與乙腈的體積比為500：10；所述流動相b中所述乙腈與水的的體積比為500：10；
所述梯度洗脫程序如下，其中流動相的比例均為體積百分比：
0～12min，流動相a為40％，流動相b為60％；
12～20min，流動相a為40％→10％，流動相b為60％→90％；
20～25min，流動相a為10％，流動相b為90％；
25～26min，流動相a為10％→40％，流動相b為90％→60％；
26～33min，流動相a為40％，流動相b為60％；
流動相流速：1.0ml/min；
色譜柱柱溫：30℃；
波長：297nm。
表4：上述方法1-6數(shù)據(jù)對比
表5：上述方法1-6數(shù)據(jù)對比結(jié)論
實施例7：采用本發(fā)明的檢測方法對所述富馬酸盧帕替芬中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物含量進行測定。
取3批富馬酸盧帕替芬樣品，采用和實施例4相同的操作和條件，制備供試品溶液，按實施例4的測定方法，測得富馬酸盧帕替芬中新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量，見表6。
表6：測定3批富馬酸盧帕替芬樣中的新雜質(zhì)式ⅰ所示化合物的含量的實驗結(jié)果
總之，以上對本發(fā)明具體實施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。