本發(fā)明涉及細胞的體外培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，是一種裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞的分離培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
裸鼴鼠是一種分布于東非部分地區(qū)的挖掘類嚙齒目動物，在分類學上屬于哺乳綱、嚙齒目、豪豬亞目、濱鼠科、異頭鼠亞科、裸鼴鼠屬、裸鼴鼠種。裸鼴鼠終生在黑暗的地下生活，能夠適應(yīng)低氧、高二氧化碳濃度的環(huán)境。裸鼴鼠的壽命是嚙齒類中最長的，可達近三十年；對癌癥具有超級免疫力，至今仍沒有發(fā)現(xiàn)裸鼴鼠自發(fā)癌癥的例子。裸鼴鼠長壽、抗衰老、耐低氧、抗腫瘤等特性引起了科學家的廣泛關(guān)注，針對這些特性的研究成果已發(fā)表在nature、pnas等著名刊物上。
肺泡ii型上皮細胞(alveolarepithelialcellstypeii，aecii)是肺的功能性細胞，作為滲透性屏障，具有阻止組織間隙的大分子物質(zhì)流入肺泡腔的功能，可以分化成為肺泡i型上皮細胞和成纖維細胞，具有肺干細胞的特性，能分泌抗菌物質(zhì)，在免疫方面起重要作用。大量研究表明，肺泡上皮ii型細胞是肺癌的主要來源細胞，針對肺泡上皮ii型細胞的深入研究有助于進一步了解肺癌發(fā)生機制和尋找有效的治療方法。獲得純度較高的裸鼴鼠肺泡上皮ii型細胞對于裸鼴鼠的耐低氧機制及抗肺腫瘤特性的研究是十分必要的。
自dobbs等首次報道對成年大鼠肺泡ii型上皮細胞提取方法以來，有許多學者進行了這方面的研究，使得該分離培養(yǎng)技術(shù)也更加的完善，但體外培養(yǎng)的肺泡上皮ii型細胞很快失去表達表面活性質(zhì)的情況仍然存在，并很快會分化為i型肺泡上皮細胞?，F(xiàn)有的裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞分離培養(yǎng)方法是借鑒小鼠肺泡上皮ii型細胞分離方法，取成年動物肺組織，剪碎成約1mm3大小后，進入消化過濾步驟，然后進行差速貼壁培養(yǎng)及免疫篩選純化獲得肺泡ii型上皮細胞?，F(xiàn)有的方法中，消化步驟采用的胰酶和膠原蛋白酶濃度不是裸鼴鼠細胞分離最佳濃度，對肺泡上皮ii細胞損傷較大。目前裸鼴鼠igg還沒有商品化的產(chǎn)品，采用小鼠的igg進行篩選，對裸鼴鼠細胞表面的iggfc片段受體的親和性不高，并且igg針對裸鼴鼠細胞分選的包被濃度還需要進一步摸索。
裸鼴鼠肺泡上皮ii型細胞原代分離純度不高，不利于通過該細胞對裸鼴鼠進行耐低氧抗腫瘤等方面的研究，國外尚未見這方面研究的報道。為了研究裸鼴鼠肺泡上皮ii型細胞在裸鼴鼠耐低氧抗腫瘤等方面發(fā)揮的作用，分離純化、體外培養(yǎng)出較純度的裸鼴鼠肺泡上皮ii型細胞是十分必要的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種裸鼴鼠的肺泡ii型上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，采用胰酶聯(lián)合彈性蛋白酶消化分離，經(jīng)過濾、差速貼壁、igg抗體篩選純化獲得裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞。
本發(fā)明的第一方面，提供一種裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
a、將成年裸鼴鼠肺組織，在預冷的洗滌液沖洗至清亮后剪碎備用；所述洗滌液的組成為：pbs溶液，0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
b、按每只動物2ml的量加入組織消化液，33-37℃消化5min；所述組織消化液的組成為：d-hanks溶液，0.03％-0.08％(w/v)胰酶，0.001％-0.01％(w/v)ii型膠原酶，0.005％-0.02％(w/v)dnasei。
c、移出消化好的細胞懸液，加入與組織消化液相等體積的抑制液終止消化；所述抑制液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps雙抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
d、將步驟b和步驟c重復5到8次，至組織塊基本消失；合并細胞懸液，經(jīng)細胞篩過濾，收取濾液，離心收集細胞；
e、采用33-37℃預熱的粘附培養(yǎng)基重懸細胞，接入包被igg的培養(yǎng)皿中，置于33-37℃、3-5％co2的環(huán)境下培養(yǎng)30-60min，輕柔收取未粘附的細胞再次接入包被igg的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)30-60min；所述粘附培養(yǎng)基的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、5％-15％(v/v)fbs、0.5％-2％(v/v)ps雙抗、0.005％-0.02％(w/v)dnasei；
f、吸取未黏附細胞，離心收集細胞，采用粘附培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻后加入培養(yǎng)皿中，在33-37℃、3-5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)20-30h換培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞，以后隔天換液一次，直到上層沒有懸浮細胞，即得裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞。
其中，步驟a具體還包括：將裸鼴鼠脫頸處死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超凈臺中盡快完整取下肺組織，在預冷的洗滌液沖洗至清亮后將肺組織剪成1mm3小塊，移入青霉素小瓶。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟a中，所述洗滌液的組成為：pbs溶液、0.01％(w/v)dnasei。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟b中，所述組織消化液的組成為：d-hanks溶液、0.05％(w/v)胰酶、0.005％(w/v)ii型膠原酶、0.01％(w/v)dnasei。本發(fā)明采用胰酶聯(lián)合膠原酶消化的方法，一方面降低胰酶濃度，另一方面采用對細胞基質(zhì)有消化作用而對上皮細胞無影響的ii型膠原酶，從而在保證細胞消化效率的同時減少胰酶對細胞的損傷。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟c中，所述抑制液的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟d中，所述細胞篩為200目細胞篩。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟d中，100g離心5min收集細胞。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟e中，所述裸鼴鼠igg包被濃度為：0.1mg/cm2；兩次黏附的時間為：40min。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟e中，所述粘附培養(yǎng)基的組成為：低糖dmem培養(yǎng)基、10％(v/v)fbs、1％(v/v)ps雙抗、0.01％(w/v)dnasei。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，步驟f中，在35℃、5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)24h后更換培養(yǎng)基。
在細胞分離過程中，由于酶的作用，細胞受損釋放出dna，與細胞外基質(zhì)形成dna蛋白復合物，聚集細胞成團。因此，本發(fā)明在細胞分離全程各種溶液都加入了dnasei，防止細胞聚團。
本發(fā)明優(yōu)點在于：
1、本發(fā)明的裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞的分離培養(yǎng)方法在已有方法上作了重要改進，以成年裸鼴鼠肺組織作為細胞提取的組織來源，一方面降低胰酶濃度，另一方面采用對細胞基質(zhì)有消化作用而對上皮細胞無影響的ii型膠原酶，從而在保證細胞消化效率的同時減少胰酶對細胞的損傷。應(yīng)用裸鼴鼠igg免疫篩選去除含有iggfc片段受體的成纖維細胞，肺泡巨噬細胞，淋巴細胞和中性粒細胞，而裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞沒有iggfc片段受體，因此免疫篩選后去除了大部分細胞。差速貼壁的時間也是成功分離肺泡上皮細胞的關(guān)鍵，成纖維細胞貼壁時間短，免疫吸附的時間由差速貼壁的時間需求來決定。將細胞懸液反復短時貼壁，本發(fā)明采取兩次各40min貼壁。
2、本發(fā)明建立了一套分離、培養(yǎng)裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞的方法，并對用該方法培養(yǎng)的細胞的生物學特性維持情況進行了評估，證實該培養(yǎng)方法能夠獲得純度很高的裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞，從而為進一步深入研究裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞的增殖、分化、液體轉(zhuǎn)運、合成分泌及其在肺損傷、修復等病理生理情況下的功能變化提供了可能。
附圖說明
圖1為倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞圖；
圖2為透射電鏡鑒定裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞圖；
圖3為免疫熒光染色法在熒光顯微鏡下鑒定裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞圖(a、細胞sftpc熒光染色；b、細胞dapi染色；c、a與b融合圖)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的具體實施方式作詳細說明。
以下實施例所使用的主要材料及來源分別如下：
裸鼴鼠(第二軍醫(yī)大學實驗動物中心)；
胰酶(gibco)；膠原蛋白酶(solarbio)；dmem低糖培養(yǎng)基(gibco)；fbs(gibco)；dnasei(solarbio)；雙抗(gibco)；裸鼴鼠igg(裸鼴鼠血清經(jīng)proteina親和柱層析純化獲得)；sftpc抗體(proteintech)
洗滌液(pbs、0.01％dnasei)
組織消化液(d-hanks溶液、0.05％胰酶、0.005％ii型膠原酶、0.01％dnasei)
抑制液(低糖dmem培養(yǎng)基、10％fbs、1％ps雙抗、0.01％dnasei)
黏附培養(yǎng)基(低糖dmem培養(yǎng)基、10％fbs、1％ps雙抗、0.01％dnasei)
以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本發(fā)明。
實施例1裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞分離培養(yǎng)方法
(1)將一只成年裸鼴鼠脫頸處死后，置于75％乙醇中浸泡5min，在超凈臺中盡快完整取下整個肺組織，在預冷的洗滌液沖洗至清亮后將肺組織剪成1mm3小塊，移入一個青霉素小瓶。
(2)加入2ml組織消化液，35℃消化5min。移出消化好的細胞懸液，加入與組織消化液相等體積的抑制液終止消化；
(3)將步驟(2)重復5次，至組織塊基本消失。合并細胞懸液20ml，經(jīng)200目細胞篩過濾，收取濾液，100g離心5min收集細胞；
(4)采用35℃預熱的5ml粘附培養(yǎng)基重懸細胞，接入包被igg的10cm培養(yǎng)皿中(包被濃度0.1mg/cm2)，置于35℃、5％co2的環(huán)境下培養(yǎng)40min，輕柔收取未粘附的細胞再次接入包被igg的10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)40min；
(5)吸取未黏附細胞，100g離心5min收集細胞，采用8ml粘附培養(yǎng)基重懸細胞，吹打均勻后加入10cm培養(yǎng)皿中，在35℃、5％co2的環(huán)境中培養(yǎng)24h換培養(yǎng)基，去除未貼壁細胞，以后隔天換液一次，直到上層沒有懸浮細胞，即得裸鼴鼠肺泡ii型上皮細胞。
實施例2實施例1的肺泡ii型上皮細胞的細胞鑒定及純度與活力評估
1、細胞鑒定
①pro-sp-c免疫熒光染色鑒定
sp-c是肺泡ii型上皮細胞特異表達的肺泡表面活性蛋白，而其他3種表面活性蛋白sp-a、sp-b、sp-d在其它細胞中也有表達，故選用表面活性蛋白中的sp-c才能用來鑒定肺泡ii型上皮細胞。
待肺泡ii型上皮細胞爬片達理想密度，4％(w/v)多聚甲醛固定樣本10min；pbs洗5min，0.1％(v/v)tritonx-100處理10min，增加細胞膜的通透性；山羊血清封閉1h；孵育一抗(sftpc用含0.1％(v/v)tritonx-100的pbs1：1000稀釋)稀釋，4℃過夜；另外用pbs代替一抗作陰性對照；pbs洗3遍，每次10min，孵育二抗(goatanti-rabbitigg(h+l))(用含0.1％tritonx-100的pbs1：200稀釋)4℃過夜或37℃避光1h；加入dapi(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)室溫3min-5min染核pbs洗3次，10min/次?？勾銣鐒┓馄?20℃避光保存，直到熒光顯微鏡觀察成像。
免疫熒光細胞化學染色可見sftpc經(jīng)熒光二抗顯色后，呈綠色顆粒狀分布于胞漿中，細胞核被dapi染成藍色(見圖1.pro-sp-c)。
②透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)鑒定
電鏡是鑒定肺泡ii型上皮細胞的最可靠的方法，因為它可以清晰直觀地觀察到特征性的板層小體。
在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的裸鼴鼠肺泡上皮ii細胞，長滿80％～90％(7天)后，用細胞刮刀將其輕輕刮下，置于1.5mlep管中800rpm離心5min；去除上清，沿壁緩慢加入3％(v/v)戊二醛固定20min，再次2000rpm離心10min。再經(jīng)2％(w/v)四氧化鋨后固定、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片、鋨酸染色后在透射電鏡下，80kv觀察拍片。
見圖2，透射電鏡能夠清晰地觀察到肺胞ii型上皮細胞特有的板層小體結(jié)構(gòu)(呈同心圓、片層狀分布)，同時也能觀察到與表面活性物質(zhì)分泌有關(guān)的絨毛結(jié)構(gòu)。透射電鏡下見到了呈同心圓排列的板層小體和微絨毛。
2、裸鼴鼠肺泡ii上皮細胞細胞純度與活力評估
用sftpc免疫熒光法，隨機多次計數(shù)五個不同視野中陽性著色細胞數(shù)評估細胞的純度；
臺盼藍染色評估細胞的活力：取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為104/ml，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔180μl，培養(yǎng)24h后加0.4％(w/v)臺盼藍，每孔20μl。用細胞全自動計數(shù)儀計數(shù)，拒染的為活細胞，計算活細胞的百分比，以判斷細胞存活狀況。
肺泡ii上皮細胞產(chǎn)量為3×105～7×105/克肺組織，sftpc染色評估細胞純度可達(87±5)％。0.4％臺盼藍染色評估細胞的活力為(95±2)％。剛分離純化得到的肺泡ii上皮細胞生長緩慢，在接種后48h才開始延展，60h能初步判斷出呈圓形或立方形(ii上皮細胞形態(tài)特征)，胞漿中可見大量顆粒狀物質(zhì)，且具有呈小島狀生長的特點(圖3)。
以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可做出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。