本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離技術領域，涉及一種從酵母發(fā)酵液中分離人血白蛋白的混合模式層析方法。

背景技術：

人血白蛋白是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占血漿蛋白60％，主要生理功能是維持血漿滲透壓，結合以及運輸營養(yǎng)物質(zhì)。臨床用于治療失血性休克、創(chuàng)傷性休克、急性血容量減少和低白蛋白血癥等。還可作為細胞培養(yǎng)的添加成分、藥物輔劑、賦形劑等，具有廣泛的應用價值。

臨床使用的人血白蛋白產(chǎn)品主要是從人源血漿中提取純化，制備方法包括冷乙醇沉淀、硫酸銨沉淀、利凡諾沉淀、辛酸鹽沉淀、層析等，原料緊張，分離復雜，且不能排除病毒或其它潛在致病因子的影響。利用現(xiàn)代生物技術構筑表達重組人血白蛋白的酵母細胞，可避免病毒感染，解決血源供應緊張等問題，具有良好的應用前景。但是，藥用人血白蛋白的純度要求高，而酵母發(fā)酵液組分復雜，含有蛋白酶、雜蛋白、核酸、脂肪酸、色素、多糖及熱原物質(zhì)等多種雜質(zhì)，必須采用多步層析方法才能去除。

酵母發(fā)酵液一般ph約6.0，電導為15～25ms/cm。專利cn1127299和us5521287利用加熱、稀釋、調(diào)酸、陽離子交換層析、疏水作用層析、金屬螯合層析、陰離子交換層析、硼酸鈣沉淀等步驟，得到純度較高的人血白蛋白。專利us5962649用陽離子交換擴張床吸附替代陽離子交換層析，縮短了工藝。不過，以上兩種方法均采用陽離子交換層析捕獲人血白蛋白，分離選擇性有限，同時料液需要稀釋處理，使得目標物濃度下降，吸附容量降低，處理量增大，過程時間延長。專利cn1854155公開了一種captommc介質(zhì)在酸性條件下捕獲人血白蛋白，高鹽淋洗去除雜質(zhì)，中性且加鹽條件下洗脫得到人血白蛋白，該方法得到的白蛋白收率為65.7％。專利cn101768206a中保持專利cn1854155的上樣和洗脫工藝不變，去除中間淋洗步驟，得到人血白蛋白純度為92％，收率為71.3％。專利cn101260145也公布采用captommc分離重組人血白蛋白及其融合蛋白的層析純化工藝，收率和純度均為80％以上。上述基于captommc的專利存在相似問題，純度和收率普遍較低，部分工藝需要高鹽淋洗去除雜質(zhì)吸附，過程復雜。針對酵母發(fā)酵液的特點，提高人血白蛋白的捕獲效率，開發(fā)一種高選擇性、具有耐鹽特性、收率高、過程簡單的分離新方法，將有助于簡化人血白蛋白的分離工藝，提高效率，節(jié)約成本。

混合模式層析是一種新型的生物分離技術，配基兼有多種功能基團，可以與目標蛋白產(chǎn)生多種相互作用，主要是疏水和靜電相互作用?；旌夏Ｊ浇橘|(zhì)的配基密度通常較高，吸附容量大，具有耐鹽吸附特性，洗脫條件溫和，特別適合于大規(guī)模的分離純化，已在抗體等蛋白的分離純化中得到應用。mx-trp-650m介質(zhì)是tosohbioscience公司開發(fā)的混合模式介質(zhì)，以聚甲基丙烯酸酯微球為基質(zhì)，色氨酸的氨基通過酰胺鍵偶聯(lián)到基質(zhì)上作為功能配基，配基結構見圖1，主要用于抗體的精制純化，如專利us0264685a1。查閱國內(nèi)外專利和文獻，未發(fā)現(xiàn)mx-trp-650m及其類似介質(zhì)用于從酵母發(fā)酵液中分離人血白蛋白

本發(fā)明利用混合模式層析的優(yōu)勢，以及人血白蛋白和小分子結合的特殊性，選用以色氨酸為主要功能配基的混合模式介質(zhì)，直接從酵母發(fā)酵液中捕獲人血白蛋白，開發(fā)一種混合模式層析分離人血白蛋白的新方法。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種從酵母發(fā)酵液中分離人血白蛋白的混合模式層析方法，具體包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，通過離心去除酵母細胞，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至5～20mm，68℃加熱30min，用離心機以8000～10000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的ph至4.0～4.5，用0.45μm濾膜過濾后，上樣到填充有以色氨酸為配基的混合模式介質(zhì)的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

3)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液，或者釀酒酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液；

所述的混合模式介質(zhì)為mx-trp-650m，或者以酰胺鍵偶聯(lián)色氨酸氨基作為配基的層析介質(zhì)；

所述的平衡緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph值為4.0～4.5；

所述的洗脫緩沖液為磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液、tris-鹽酸緩沖液或者甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，ph值為7.0～9.0，添加0-0.6mnacl；

所述的步驟1)中調(diào)節(jié)酵母發(fā)酵液ph值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的ph調(diào)節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸溶液，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

本發(fā)明針對酵母發(fā)酵液組分復雜、電導較高的特點，采用混合模式介質(zhì)直接處理經(jīng)預處理的酵母發(fā)酵液，充分利用混合模式層析的吸附容量大、選擇性好、具有耐鹽特性、洗脫條件溫和等優(yōu)勢，提高分離效率，簡化分離步驟，得到一個從酵母發(fā)酵液中直接分離人血白蛋白的新方法。本發(fā)明的優(yōu)點在于：1)采用以色氨酸為主要功能配基的混合模式介質(zhì)，利用色氨酸與人血白蛋白的特異性結合，提高人血白蛋白的吸附選擇性，單步層析分離純度高達95％以上，色素去除率達90％以上；2)混合模式介質(zhì)具有良好的耐鹽吸附特性，料液無需調(diào)節(jié)離子強度，直接上樣，簡化預處理步驟，提高分離效率；

3)混合模式介質(zhì)的吸附容量大，上樣量達到40mg/ml介質(zhì)以上，過程處理量大；4)洗脫條件溫和，ph中性或弱堿性條件下，利用靜電排斥作用實現(xiàn)有效洗脫，人血白蛋白的回收率高，達到92％以上；5)工藝簡單，易于放大。

附圖說明

圖1是混合模式介質(zhì)的配基結構示意圖。

圖2是本發(fā)明混合模式層析分離人血白蛋白的層析分離譜圖。

圖3是本發(fā)明混合模式層析分離的料液和洗脫組分高效液相色譜分析圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種從酵母發(fā)酵液中分離人血白蛋白的方法。取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，通過離心澄清后，加入辛酸鈉，加熱，去除雜蛋白和滅活蛋白酶，離心分離，取上清液；將上清液通過混合模式層析柱進行分離，得到人血白蛋白。本發(fā)明方法得到的人血白蛋白純度大于95％。

從酵母發(fā)酵液中分離人血白蛋白的方法包括如下步驟：

1)取含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液，通過離心去除酵母細胞，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至5～20mm，68℃加熱30min，用離心機以8000～10000rpm轉(zhuǎn)速離心10～20min，取上清液，得到人血白蛋白粗品溶液；

2)調(diào)節(jié)人血白蛋白粗品溶液的ph至4.0～4.5，用0.45μm濾膜過濾后，上樣到填充有以色氨酸為配基的混合模式介質(zhì)的層析柱中，平衡緩沖液沖洗，洗脫緩沖液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩沖液，得到人血白蛋白溶液；

3)將人血白蛋白溶液脫鹽，冷凍干燥，得到純度大于95％的人血白蛋白；

所述的含有人血白蛋白的酵母發(fā)酵液為畢赤酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液，或者釀酒酵母表達重組人血白蛋白的發(fā)酵液；

所述的混合模式介質(zhì)為mx-trp-650m，或者以酰胺鍵偶聯(lián)色氨酸氨基作為配基的層析介質(zhì)；

所述的平衡緩沖液為乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph值為4.0～4.5；

所述的洗脫緩沖液為磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液、tris-鹽酸緩沖液或者甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，ph值為7.0～9.0，添加0-0.6mnacl；

所述的步驟1)中調(diào)節(jié)酵母發(fā)酵液ph值和步驟3)人血白蛋白粗品溶液的ph調(diào)節(jié)所用酸溶液為乙酸或檸檬酸溶液，所用堿溶液為氫氧化鈉溶液。

實施例1

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至5mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以8000rpm轉(zhuǎn)速離心20min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.0，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.0)，洗脫液為20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為96.6％，收率為96.0％，色素去除率為90.2％。

實施例2

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至20mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以10000rpm轉(zhuǎn)速離心10min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.5，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.5)，洗脫液為添加0.2mnacl的20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為96.7％，收率為97.8％，色素去除率為91.4％。

實施例3

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至15mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心15min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.2，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.2)，洗脫液為添加0.4mnacl的20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，層析分離譜圖如圖2所示,hplc分析純度為98.5％，收率為97.4％，色素去除率為92.5％,液相分析譜圖如圖3所示。

實施例4

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至15mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心15min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.0，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.0)，洗脫液為50mm的tris-鹽酸緩沖液(ph8.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為96.8％，收率為96.3％，色素去除率為91.1％。

實施例5

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至20mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以8000rpm轉(zhuǎn)速離心20min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.5，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.5)，洗脫液為50mm甘氨酸-氫氧化鈉鈉緩沖液(ph9.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為95.2％，收率為95.3％，色素去除率為90.2％。

實施例6

取含有重組人血白蛋白的釀酒酵母發(fā)酵液，電導率約20ms/cm，人血白蛋白濃度為8mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至10mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心15min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.0，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml的mx-trp-650m介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.0)，洗脫液為添加0.6mnacl的20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為96.8％，收率為97.5％，色素去除率為90.0％。

實施例7

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至15mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心15min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.0，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml以酰胺鍵偶聯(lián)色氨酸的氨基作為配基的瓊脂糖介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.0)，洗脫液為添加0.2mnacl的20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為96.7％，收率為97.0％，色素去除率為92.2％。

實施例8

取含有重組人血白蛋白的畢赤酵母發(fā)酵液，電導率約24ms/cm，人血白蛋白濃度為10mg/ml。通過離心澄清后，調(diào)節(jié)ph至6.0，加入辛酸鈉至15mm，68℃加熱30min，沉淀雜蛋白和滅活蛋白酶，以9000rpm轉(zhuǎn)速離心15min，得到上清液。調(diào)節(jié)上清液ph值為4.0，0.45μm濾膜過濾，取10ml作為進樣樣品。層析柱(內(nèi)徑0.5cm)中填充2ml以酰胺鍵偶聯(lián)色氨酸的氨基作為配基的纖維素介質(zhì)，平衡緩沖液為20mm的乙酸-乙酸鈉緩沖液(ph4.0)，洗脫液為添加0.2mnacl的20mm磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(ph7.0)，收集洗脫組分，脫鹽，冷凍干燥，得到人血白蛋白，hplc分析純度為97.2％，收率為96.5％，色素去除率為91.1％。