本發(fā)明涉及分子遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及與黃瓜雄性不育基因相關(guān)的snp或indel的標(biāo)記，及其篩選，以及獲得的雄性不育基因及它們在鑒定雄性不育植株的用途。

背景技術(shù)：

目前在其他作物上定位了很多雄性不育基因，并開發(fā)了很多與雄性不育基因緊密連鎖的標(biāo)記，但在在黃瓜上雄性不育基因的報道很少，更談不上應(yīng)用。此外，目前利用最多的是核質(zhì)互作不育系、光敏不育系及溫敏不育系等，對核不育基因的利用很少，主要是因為難以找到保持系。傳統(tǒng)上基因定位的方法是利用已有的分子標(biāo)記，分離群體中大量的篩選差異條帶，定位基因太過耗時耗力。

雖然專利申請cn105420408a對黃瓜不育基因的分子標(biāo)記進(jìn)行了探索，但是其只獲得了一個snp標(biāo)記，并且該snp標(biāo)記過于單一，不能定位黃瓜不育基因。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

在本申請的一個實施方案中，本申請涉及一種獲得植物雄性不育分子標(biāo)記snp或indel標(biāo)記和定位雄性不育基因的方法。所述方法包括以下步驟：

(1)配置群體：將植物雄性不育系作為母本與可育遠(yuǎn)緣品種為父本進(jìn)行雜交，得到雜種f1，由雜種f1自交得到f2代分離群體，f2代分離群體中存在雄性可育和雄性不育兩種表型；

(2)建庫測序：提取母本、父本、f2代中可育單株和不育單株的基因組dna并分別混合形成4個混池即母本池、父本池、可育池及不育池，對各混池的基因組dna進(jìn)行雙末端測序，對測序得到的讀段用bwa軟件與正常黃瓜基因組比對，基于比對的結(jié)果，使用gatk軟件進(jìn)行snp的檢測和注釋；

(3)分離群體分組分析(bsa)：根據(jù)測序獲得的snp的檢測結(jié)果，計算可育池與不育池的δ(snp-index)值，采用δ(snp-index)值的99％的置信區(qū)間，來確定目標(biāo)基因所在區(qū)域。其中snp-index指某個染色體位點(diǎn)含有snp的讀段數(shù)與測到的該位點(diǎn)的總讀段數(shù)的比值，δ(snp-index)指可育池與不育池的snp-index值之差(takagi等人，2013)；

(4)競爭性等位基因特異性pcr(kasp)：針對候選區(qū)間內(nèi)選取的候選snp位點(diǎn)設(shè)計snp分型引物在938株f2群體中進(jìn)行kasp分型，得到與不育性狀緊密連鎖的snp或indel位點(diǎn)；

(5)根據(jù)ksap分型結(jié)果構(gòu)建遺傳圖譜，定位雄性不育基因。

本研究引入了一個snp位點(diǎn)的測序深度相關(guān)的參數(shù)snp-index，該參數(shù)是指某個位點(diǎn)含有snp的讀段數(shù)與測到該位點(diǎn)的總讀段數(shù)的比值，大小范圍為0-1。若該參數(shù)為0，代表所有測到的讀段都來自被用作參考基因組的那個親本的基因組；該參數(shù)為1，代表所有讀段都來自另一個親本；該參數(shù)為0.5，則代表此混池中snp來自兩個親本的基因組的頻率一致。將兩個池觀測到的snp都計算出snp-index，然后將兩個池的snp-index值相減后得到δ(snp-index)，將δ(snp-index)對應(yīng)該snp所在染色體位置作圖，采用δ(snp-index)值的99％的置信區(qū)間篩選雄性不育基因候選區(qū)域。針對δ(snp-index)再做零假設(shè)，得出相應(yīng)的p值，用于檢驗該數(shù)值的可信度，一般p＜0.05才認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述植株是黃瓜。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記是snp標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記是indel標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標(biāo)記是snp標(biāo)記和indel標(biāo)記。

在本發(fā)明的一個實施方案中，雄性不育基因位于snp標(biāo)記g729940c和snp標(biāo)記c974274g之間的基因組片段。

在本發(fā)明的一個實施方案中，雄性不育基因位于黃瓜3號染色體上。

在本發(fā)明的一個實施方案中，雄性不育基因位于黃瓜3號染色體上805,509-807,682。

在本發(fā)明的一個實施方案中，控制黃瓜雄性不育的基因為seiqno:1所示的csa3m006660.1基因，其編碼如seiqno:2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，黃瓜不育系的csa3m006660.1基因第1258位發(fā)生點(diǎn)突變。

在本發(fā)明的一個實施方案中，黃瓜不育系的csa3m006660.1基因的核酸序列如seqidno:3所示。其編碼如seiqno:4所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，競爭性等位基因特異性pcr(kasp)使用的引物的snp分型引物如下所示所示。

針對c304430g標(biāo)記的引物為：

aattacatgaataagtgttcgtaatttcg(seqidno:5)和

aattacatgaataagtgttcgtaatttcc(seqidno:6)；

針對g564531c標(biāo)記的引物為：

ggtttggaatcttgcttggcattg(seqidno:7)和

ggtttggaatcttgcttggcattc(seqidno:8)

針對a701466g標(biāo)記的引物為：

atctagaaaccaaataaaaactatagccaa(seqidno:9)和

ctagaaaccaaataaaaactatagccag(seqidno:10)

針對g729940c標(biāo)記的引物為：

ggaaccccttctgaagctgtg(seqidno:11)和

ggaaccccttctgaagctgtc(seqidno:12)

針對t785141c標(biāo)記的引物為：

gggtcacgcagatgggtattga(seqidno:13)和

ggtcacgcagatgggtattgg(seqidno:14)

針對c974274g標(biāo)記的引物為：

atttggtttcttgatactatcaattatacc(seqidno:15)和

atttggtttcttgatactatcaattatacg(seqidno:16)

針對t1031386g標(biāo)記的引物為：

tacgtgaatattttctttttctttatacgtat(seqidno:17)和

cgtgaatattttctttttctttatacgtag(seqidno:18)

針對t1101289c標(biāo)記的引物為：

aagactaatatgcccttcctcttcta(seqidno:19)和

gactaatatgcccttcctcttctg(seqidno:20)

針對t1508343g標(biāo)記的引物為：

tatgtacagcatcaacaagtgtgca(seqidno:21)和

tgtacagcatcaacaagtgtgcc(seqidno:22)

針對a2179014c標(biāo)記的引物為：

ttcgaacatatacaaaagtagatatatcaaaa(seqidno:23)和

cgaacatatacaaaagtagatatatcaaac(seqidno:24)。

本發(fā)明的一個實施方案涉及鑒定黃瓜不育株與可育株的方法，其特征在于，如果csa3m006660.1基因第1258位堿基為g，那么該植株為不育株。

本發(fā)明鑒定了與黃瓜雄性不育基因更加緊密連鎖的10個snp標(biāo)記，其中有6個snp標(biāo)記更加與黃瓜雄性不育基因緊密連鎖。本發(fā)明首次鑒定出黃瓜雄性不育基因為位于黃瓜3號染色體的csa3m006660.1基因。通過本發(fā)明鑒定的不育基因，能夠更直接、快速識別黃瓜雄性不育株，而且能夠用于黃瓜雜交種的高效生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為通過分離群體分組分析(bsa)所示出的可育池和不育池δsnp-index在黃瓜7條染色體上的分布情況。

圖2為kasp基因分型所用候選snp標(biāo)記及其對應(yīng)的引物。

圖3為c974274g標(biāo)記的kasp基因分型結(jié)果。(a)為對可育單株的kasp基因分型結(jié)果；(b)為對不育單株的kasp基因分型結(jié)果。

圖4為通過snp標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜以及突變基因的精細(xì)定位。

圖5為得到的csa3m006660.1基因的核酸序列。

具體實施方式

通過結(jié)合說明書附圖和以下實施例來具體說明本發(fā)明的具體實施方式。

實施例1

黃瓜雄性不育性狀相關(guān)的snp分子標(biāo)記的及不育基因的獲得，包括以下步驟：

(1)配置群體：將“yl-5”雄性不育系為母本與遠(yuǎn)緣品種“d37-1”為父本進(jìn)行雜交，得到雜種f1，由雜種f1自交得到f2代分離群體，f2代分離群體中存在雄性可育和雄性不育兩種表型。

(2)建庫測序：鑒定表型后，通過ctab法提取母本“yl-5”基因組dna、父本“d37-1”基因組dna、f2代中可育單株基因組dna、f2代中不育單株基因組dna，共形成4個混池即母本池、父本池、可育池及不育池。將檢驗合格的dna樣品用illuminahiseq2500平臺進(jìn)行雙末端測序，對測序得到的原始讀段進(jìn)行質(zhì)量評估并過濾得到干凈無雜質(zhì)的讀段，用bwa軟件將干凈無雜質(zhì)的讀段比對到黃瓜參考基因組，基于比對的結(jié)果，使用gatk軟件進(jìn)行snp的檢測和注釋。

(3)分離群體分組分析(bsa)：根據(jù)snp的檢測結(jié)果，計算可育池與不育池的snp-index值，方法為覆蓋該位點(diǎn)的突變基因型的讀段占覆蓋該位點(diǎn)的總讀段數(shù)的比值，如覆蓋某一位點(diǎn)的讀段數(shù)為20，而突變基因型基因型的讀段為15，則該位點(diǎn)snp-index值為0.75。若snp-index＝0，則該讀段來源于父本“d37-1”，若snp-index＝1，則該讀段來源于母本“yl-5”。然后計算可育池與不育池的δ(snp-index)值，得到δ(snp-index)圖(圖1)。假設(shè)位點(diǎn)a為目標(biāo)基因所在位點(diǎn)，則可育池該位點(diǎn)snp-index＝0(因可育池中有雜合基因型，所以實際值一般大于0，小于1)，而不育池該位點(diǎn)snp-index＝1，所以δ(snp-index)＝1，所以δ(snp-index)越大，與接近目標(biāo)基因。則本研究采用δ(snp-index)值的99％的置信區(qū)間，來確定目標(biāo)基因所在位點(diǎn)，結(jié)果表明可育池與不育池僅在3號染色體末端813kb(區(qū)域1:166710-564531,大小397kb；區(qū)域2:1954776-2371279,大小416kb)范圍內(nèi)出現(xiàn)明顯的分離趨勢。

(4)競爭性等位基因特異性pcr(kasp)分型：選取10個snp位點(diǎn)，采用leal-bertioli等(2015)的方法進(jìn)行引物設(shè)計，該項技術(shù)是基于引物末端堿基的特異匹配來對snp分型以及檢測插入和缺失(indels)。針對10個snp位點(diǎn)共設(shè)計了10套snp分型引物(圖2)，并在948株f2群體中進(jìn)行kasp分型。在948株f2分離群體中檢測相應(yīng)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分型，部分結(jié)果見圖3：該圖為c974274g標(biāo)記的kasp基因分型圖，其中圖3.a為c974274g標(biāo)記在96份可育單株即mf1至mf-96上的分型情況，圖3.b為c974274g標(biāo)記在96份不育單株即ms-1至ms-96上的分型情況，圖中每一個點(diǎn)都對應(yīng)這一個單株，紅色代表該單株的基因僅帶有exc標(biāo)簽序列即該位點(diǎn)基因型為g/g，藍(lán)色代表該單株的基因帶僅有fam標(biāo)簽序列即該位點(diǎn)基因型為c/c，綠色代表該單株的基因即帶有exc標(biāo)簽序列也帶有fam標(biāo)簽序列即該位點(diǎn)基因型為雜合g/c，黑色代表未能識別；另外，只有使三種基因型的單株各自成簇的引物的分型結(jié)果才可用。從圖3.a中可以看出96份可育單株中除一株未鑒定成功外，均成功分型，從圖3.b中可以看出96份不育單株中均分型成功；另外，在兩次的分型結(jié)果中，3種基因型的單株分簇情況良好，結(jié)果可用。

根據(jù)分型結(jié)果構(gòu)建遺傳圖譜(圖4)，精細(xì)定位不育基因，并得到與不育性狀緊密連鎖的snp或indel位點(diǎn)。最終定位到的該基因為csa3m006660.1(圖5)，與不育性狀緊密連鎖的6個snp或indel位點(diǎn)。

(5)序列與表達(dá)分析：通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)csa3m006660.1具有典型的phd結(jié)構(gòu)(cys4hiscys3)，是真核生物中一種進(jìn)化保守的鋅指結(jié)構(gòu)域，能特異性識別組蛋白的甲基化密碼。

通過不同物種氨基酸序列同源對比以及28個不同品系黃瓜的序列分析發(fā)現(xiàn)csa3m006660.1的第420位氨基酸高度保守，在可育植株中為酪氨酸y，在不育植株中突變?yōu)樘於彼醖。換言之，黃瓜不育系的csa3m006660.1基因第1258位發(fā)生點(diǎn)突變，從t突變?yōu)間。

blast分析發(fā)現(xiàn)，csa3m006660.1與擬南芥mmd1氨基酸序列的同源性為49.8％，在420位具有相同的氨基酸類型，并具有phd結(jié)構(gòu)域。有多篇文獻(xiàn)報道擬南芥mmd1突變會導(dǎo)致雄性不育，可能調(diào)控花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程。

csa3m006660.1表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因只在幼小花蕾中表達(dá)。

實施例2

不育基因的驗證

申請人隨機(jī)挑選了100株黃瓜正常可育珠和100株黃瓜不育株。針對seqidno:1設(shè)計引物。分別對這些植株的基因組進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測序。結(jié)果顯示，從所有的可育珠擴(kuò)增獲得的核酸序列其1258位堿基為t，而所有的不育株的基因擴(kuò)增產(chǎn)物第1258位堿基為g。

序列表

<110>天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司黃瓜研究所

<120>黃瓜雄性不育基因、分子標(biāo)記、篩選方法及其用途

<130>cp20170590

<160>24

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1995

<212>dna

<213>黃瓜（cucumissativus）

<400>1

atgtcgatttcgattctggaatcctgcaagaagagaaaaagaaggcctaaacttttcggg60

tttcaaacgttcggggatcctggatcgccaatcaaccccacgggtccatttcgtgagaat120

atcagaatctttcttcaacaatgtgcagagattgaagattacagaattcaagaaatgcct180

atatggtgtactctccttgttcatgaaaataaaagcttcgttgttccactttacactatt240

gaagaagatgtgaagctctccccaaaaccctactgcgatcaatgccgatgttctgggtgg300

agtaatcattttgtatcgaaaagaaaatatcatatcgtaataccgttggatgatcggtgg360

aacaaacgattagacgatggcggtttcgacctcgatgatcaaactcatcttcttcatgga420

ttgattcactgcaatggcttcgggcatttgctctgcgtcaatggaatcgaaggaggatcc480

aagtttctttgtggcagagaagttatggatctttgggatagaatctgcacaaatctaaga540

acaaggaaaattacagttgaggatttatccaagaaacgatcaatggatctacgtcttctt600

catggggtagcatacggtcatccatggtttgggagatggggctacagattttgccgagga660

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ctcgacaagataatgcacgaagtcgactatagcgatcgaggaagagaagtgaagcaaatc780

attcgacattatcgaaatctgagtgaaacgcagttgatcacactgaaagatctactgaag840

ttcatgttgacagtaaaatatgtttctgcgatcgagaagaaaacggttcaaccaatcgct900

aaatctcctcctccgtgtagacaatctctgcagcgaaacaagcagcaatctctagtgaag960

gagaagcaaatacggtacagaaaattcgccactgcaatttctaatatggacagccgatgg1020

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aaagaagcagcagaaaaagctctaagagacacatattacgttacggaacagttcgaggtt1680

ttggcgatagagaatttggagaattacgaagacagagaggtgatttttggagcggtagaa1740

tcgggagcagagttgtttgtgaaaggaatgggtattgatttagatacaccattgaagtac1800

caaggaggagttggtacatggaaagttcgatgtgagtgtggcaccggagacgacgatggc1860

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gacgacgctgataatgtgccgttgttgttcgtatgcgccgcctgctgcgactcgcttgga1980

caattaaaaatttga1995

<210>2

<211>664

<212>prt

<213>黃瓜（cucumissativus）

<400>2

metserileserileleuglusercyslyslysarglysargargpro

151015

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202530

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354045

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859095

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100105110

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115120125

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195200205

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<211>1995

<212>dna

<213>黃瓜（cucumissativus）

<400>3

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<212>prt

<213>黃瓜（cucumissativus）

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