本發(fā)明涉及松材線蟲(chóng)的分子檢測(cè)，尤其涉及用于檢測(cè)松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp引物組和試劑盒，還涉及所述lamp引物組、試劑盒在檢測(cè)松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)中的應(yīng)用，屬于松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的分子檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

松材線蟲(chóng)病(pinewiltdisease)，又被稱(chēng)為松樹(shù)萎蔫病、枯萎病，該病由松材線蟲(chóng)[bursaphelenchusxylophilus(steiner&buhrer)nickle]引起，主要通過(guò)墨天牛屬(monochamus)昆蟲(chóng)在松樹(shù)上取食和產(chǎn)卵進(jìn)行自然傳播以及病木、病木加工木的運(yùn)輸進(jìn)行長(zhǎng)距離傳播。林區(qū)內(nèi)松材線蟲(chóng)的傳播主要靠松墨天牛，可為害包括松屬(pinusspp.)、落葉松屬(larixspp.)、云杉屬(piceaspp.)、黃杉屬(pseudotsugaspp.)、冷杉屬(abiesspp.)和雪松屬(cedrusspp.)的36種松屬植物和8種非松屬植物，其中松屬植物是最主要的寄主。由于其危害極其嚴(yán)重而目前又缺乏有效的防治方法，被多個(gè)國(guó)家列為頭號(hào)檢疫對(duì)象。

形態(tài)學(xué)是線蟲(chóng)種類(lèi)常規(guī)鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，松材線蟲(chóng)的鑒定主要依靠成蟲(chóng)的形態(tài)特征。但是，通過(guò)形態(tài)學(xué)準(zhǔn)確鑒定松材線蟲(chóng)成蟲(chóng)對(duì)于非專(zhuān)業(yè)人員相當(dāng)困難，且無(wú)法對(duì)幼蟲(chóng)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。由于形態(tài)學(xué)的限制，免疫學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)方法被應(yīng)用到松材線蟲(chóng)的鑒定上。

松墨天牛是松材線蟲(chóng)病最重要的傳播媒介，攜帶的是松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)，且攜帶的線蟲(chóng)有多種，難以根據(jù)形態(tài)學(xué)特征來(lái)區(qū)分和鑒定松材線蟲(chóng)幼蟲(chóng)。準(zhǔn)確診斷松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)是監(jiān)測(cè)松材線蟲(chóng)病發(fā)生蔓延過(guò)程中急需解決的難題。分子生物學(xué)技術(shù)的引入，克服了形態(tài)學(xué)的一些限制，實(shí)現(xiàn)快速鑒定。松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)分子檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)，對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期疫點(diǎn)，有效的將松材線蟲(chóng)病控制在一定的范圍內(nèi)，縮小松材線蟲(chóng)病的發(fā)生，降低防治成本，具有重要的意義；同時(shí)為松材線蟲(chóng)病的總體預(yù)警與控制策略提供依據(jù)。

目前，松材線蟲(chóng)的檢測(cè)與鑒定主要以分子生物學(xué)的方法為主。其中，dna探針技術(shù)雖能有效地鑒定松材線蟲(chóng)，但費(fèi)用較高，具有放射性；rapd技術(shù)分析松材線蟲(chóng)與近似種的關(guān)系，結(jié)果重復(fù)性較差；rflp技術(shù)區(qū)分松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)，內(nèi)切酶價(jià)格昂貴、耗時(shí)；熒光pcr靈敏、快速，但較昂貴；pcr技術(shù)操作簡(jiǎn)便、花費(fèi)較少，但所需時(shí)間也較長(zhǎng)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermalamplification，簡(jiǎn)稱(chēng)lamp)是2000年日本榮研化學(xué)株式會(huì)的notomit等開(kāi)發(fā)的一種新的核酸擴(kuò)增方法，該方法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了2對(duì)特異的引物，引物在鏈置換dna聚合酶(bstdnapolymerase)的作用下在恒溫條件(65℃左右)下保溫幾十分鐘，因其獨(dú)特的反轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，對(duì)自身進(jìn)行鏈置換無(wú)限擴(kuò)增；整個(gè)反應(yīng)過(guò)程1個(gè)小時(shí)內(nèi)即可完成，其間不需要模板的熱變性、退火、溫度循環(huán)等過(guò)程，擴(kuò)增具有高特異性、等溫快速的特點(diǎn)。因此，相較以上幾種分子檢測(cè)技術(shù)，lamp擴(kuò)增不需要昂貴的儀器和試劑，更利于在一些基層機(jī)構(gòu)的應(yīng)用。

syg-2基因是編碼多功能細(xì)胞粘附因子的基因。syg-1和syg-2存在于所有動(dòng)物類(lèi)群中，從突觸的形成到過(guò)濾防御屏障的建立，參與多種主要的生理功能。以松材線蟲(chóng)的syg-2基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)進(jìn)行l(wèi)amp快速擴(kuò)增，將對(duì)于松材線蟲(chóng)的快速鑒定及有效防控具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供用于檢測(cè)松材線蟲(chóng)的lamp引物組；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種松材線蟲(chóng)的lamp檢測(cè)試劑盒；

本發(fā)明所要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是建立一種松材線蟲(chóng)的lamp快速檢測(cè)方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開(kāi)了用于檢測(cè)松材線蟲(chóng)的lamp引物組，所述lamp引物組選自以下2組引物中的任意一組：

引物組(1)：包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物；所述外引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物組成；所述內(nèi)引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.3所示上游內(nèi)引物和seqidno.4所示下游內(nèi)引物組成；

引物組(2)：包括一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)環(huán)引物；所述外引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物組成；所述內(nèi)引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.3所示上游內(nèi)引物和seqidno.4所示下游內(nèi)引物組成；所述環(huán)引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.5所示上游環(huán)引物和seqidno.6所示下游環(huán)引物組成。

優(yōu)選的，所述檢測(cè)樣品是松墨天牛。

本發(fā)明經(jīng)ncbi比對(duì)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的syg-2基因片段，發(fā)現(xiàn)該段基因在松材線蟲(chóng)種內(nèi)保守，與擬松材線蟲(chóng)種間差異極其大。因此，本發(fā)明以松材線蟲(chóng)的syg-2基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)了16組lamp引物。對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果證明，16號(hào)引物組不加環(huán)引物(即本發(fā)明所述引物組(1))，擴(kuò)增不出擬松材線蟲(chóng)，對(duì)松材線蟲(chóng)檢測(cè)的特異性好；而且16號(hào)引物組不加環(huán)引物，檢測(cè)松材線蟲(chóng)bx的出峰時(shí)間為25-30min，擴(kuò)增效率較高。16號(hào)引物組在加環(huán)引物的情況下(即本發(fā)明所述引物組(2))，可以擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，對(duì)松材線蟲(chóng)檢測(cè)的特異性不好。

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的8號(hào)引物組在不加環(huán)引物的情況下，也擴(kuò)增不出擬松材線蟲(chóng)，其檢測(cè)松材線蟲(chóng)bx的出峰時(shí)間為15-20min，擴(kuò)增效率略?xún)?yōu)于16號(hào)引物組不加環(huán)引物。雖然4號(hào)引物組加環(huán)引物或者不加環(huán)引物，都不能擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，但其擴(kuò)增效率不是最優(yōu)；具體為，4號(hào)引物組加環(huán)引物檢測(cè)松材線蟲(chóng)bx的出峰時(shí)間為20-25min；4號(hào)引物組不加環(huán)引物檢測(cè)松材線蟲(chóng)bx的出峰時(shí)間為30-35min。比較可見(jiàn)，在不加環(huán)引物的情況下，16號(hào)引物組的擴(kuò)增效率優(yōu)于4號(hào)引物組。另外，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的1號(hào)、10號(hào)、13號(hào)和15號(hào)引物組加/不加環(huán)引物都能擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，對(duì)松材線蟲(chóng)檢測(cè)的特異性差；3號(hào)和5號(hào)引物組在加環(huán)引物的情況下，可擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，而不加環(huán)引物，均擴(kuò)增不出松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)；其余7組引物加/不加環(huán)引物均不能擴(kuò)增出松材線蟲(chóng)；可見(jiàn)，上述引物組均不能用于松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的檢測(cè)。

因此，本發(fā)明用于檢測(cè)松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp引物組優(yōu)選為16號(hào)引物組不加環(huán)引物，即引物組(1)：包括一對(duì)外引物和一對(duì)內(nèi)引物；所述外引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.1所示上游外引物和seqidno.2所示下游外引物組成；所述內(nèi)引物對(duì)由核苷酸序列為seqidno.3所示上游內(nèi)引物和seqidno.4所示下游內(nèi)引物組成。

本發(fā)明所述的lamp引物組能夠應(yīng)用于檢測(cè)松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp檢測(cè)試劑盒，包括：lamp引物組，2×rm(包括：tris-hcl，kcl，mgso4，(nh4)so4，tween20，betaine，dntps)，sybrgreenⅰ，bstdna聚合酶和ddh2o；其中，所述lamp引物組選自本發(fā)明所述的lamp引物組，即16號(hào)引物組加環(huán)引物或者不加環(huán)引物，優(yōu)選為16號(hào)引物組不加環(huán)引物。

本發(fā)明所述的lamp檢測(cè)試劑盒能夠應(yīng)用于檢測(cè)松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp檢測(cè)方法，包括以下步驟：(1)提取待測(cè)松墨天牛的dna；(2)以提取的dna為模板，以本發(fā)明所述的lamp引物組(即16號(hào)引物組加環(huán)引物或者不加環(huán)引物)為擴(kuò)增引物，建立lamp反應(yīng)體系并置于實(shí)時(shí)熒光pcr儀中進(jìn)行pcr反應(yīng)；(3)對(duì)反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行判定：①收集熒光信號(hào)，如果出現(xiàn)“s”型擴(kuò)增曲線，則判定為陽(yáng)性(有核酸擴(kuò)增，即待測(cè)松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng))；如果無(wú)“s”型擴(kuò)增曲線，則判定為陰性(無(wú)核酸擴(kuò)增，即待測(cè)松墨天牛不攜帶松材線蟲(chóng))；或者，②將pcr反應(yīng)產(chǎn)物滅活，加入顯色液混勻；如果呈現(xiàn)綠色，則判定為陽(yáng)性(有核酸擴(kuò)增，即待測(cè)松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng))；如果呈現(xiàn)橙色，則判定為陰性(無(wú)核酸擴(kuò)增，即待測(cè)松墨天牛不攜帶松材線蟲(chóng))。

其中，當(dāng)所述lamp引物組為16號(hào)引物組不加環(huán)引物時(shí)，lamp反應(yīng)體系包括：反應(yīng)體系的總體積為25μl；其中，2×rm12.5μl(包括：ph8.8的tris-hcl40mm，kcl20mm，mgso416mm，(nh4)so420mm，tween200.2％，betaine1.6m，dntps(2.8mm每種))，sybrgreeni0.5μl，40μm的上游內(nèi)引物1μl，40μm的下游內(nèi)引物1μl，10μm的上游外引物0.5μl，10μm的下游外引物0.5μl，8u/μl的bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl，余量為ddh2o?；蛘?，當(dāng)所述lamp引物組為16號(hào)引物組加環(huán)引物時(shí)，所述lamp反應(yīng)體系包括：反應(yīng)體系的總體積為25μl；其中，2×rm12.5μl，sybrgreeni0.5μl，40μm的上游內(nèi)引物1μl，40μm的下游內(nèi)引物1μl，10μm的上游外引物0.5μl，10μm的下游外引物0.5μl，20μm的上游環(huán)引物0.5μl，20μm的下游環(huán)引物0.5μl，8u/μl的bstdna聚合酶1μl，dna模板1μl，余量為ddh2o。

本發(fā)明所述lamp檢測(cè)方法中，所述pcr反應(yīng)的程序包括：63℃15s，63℃45s作為一個(gè)循環(huán)；于63℃45s處收集熒光信號(hào)。所述滅活是85℃滅活3min。

應(yīng)用本發(fā)明所建立的松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp檢測(cè)方法，對(duì)江蘇南京采集的攜帶松材線蟲(chóng)的松墨天牛的檢出率分別為28.60％和43.75％。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明以松材線蟲(chóng)種內(nèi)保守的syg-2基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)并篩選獲得能夠特異性區(qū)分松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的lamp引物組。本發(fā)明進(jìn)一步利用該特異性lamp引物組建立一種松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp檢測(cè)方法，該方法能夠?qū)λ赡炫y帶的松材線蟲(chóng)進(jìn)行快速檢測(cè)，不僅特異性高，而且操作簡(jiǎn)便、耗時(shí)短，成本低。本發(fā)明方法對(duì)于準(zhǔn)確診斷松墨天牛攜帶的松材線蟲(chóng)，監(jiān)控松材線蟲(chóng)病的發(fā)生與蔓延以及對(duì)松材線蟲(chóng)病的總體預(yù)警與控制策略等均具有重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為1號(hào)、4號(hào)和15號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果；

圖2為8號(hào)和16號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx的檢測(cè)結(jié)果；

圖3為8號(hào)和16號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)天牛檢測(cè)的結(jié)果；其中，nj1代表從江蘇南京采集的天牛攜帶松材線蟲(chóng)(6月21日批)；nj2代表從江蘇南京采集的天牛攜帶松材線蟲(chóng)(6月24日批)；

圖4為10號(hào)和13號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果；

圖5為1號(hào)、8號(hào)、13號(hào)和15號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果；

圖6為3號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果；

圖7為4號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和天牛的檢測(cè)結(jié)果；其中，nj1代表從江蘇南京采集的天牛攜帶松材線蟲(chóng)(6月21日批)；nj2代表從江蘇南京采集的天牛攜帶松材線蟲(chóng)(6月24日批)；sd-1代表從山東采集的松材線蟲(chóng)；js代表從江蘇采集的松材線蟲(chóng)；jst-10代表從江蘇采集的松材線蟲(chóng)；js和jst-10代表不同的株系；

圖8為5號(hào)和16號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果；

圖9為10號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1松墨天牛攜帶松材線蟲(chóng)的lamp快速檢測(cè)方法的建立

1、材料與方法

1.1松墨天牛dna的提取

取松墨天牛成蟲(chóng)頭部及胸部組織0.2g放入2mlep管中，放入鋼珠研磨儀研磨5min(60hz)；加入600μl3m異硫氰酸胍提取緩沖液，室溫裂解1h，期間顛倒混勻；加入600μltris-酚氯仿異戊醇(25:24:1)，12000r/min離心10min；吸取上清液，加入600μl氯仿異戊醇(24:1)，12000r/min離心10min；吸取上清液，加入600μl異丙醇-20℃沉淀20min，12000r/min離心10min；棄上清，70％乙醇清洗沉淀2次，每次12000r/min離心3min；吸干乙醇徹底干燥后，用60μlbufferte溶解dna，備用。

1.2lamp引物設(shè)計(jì)

經(jīng)ncbi比對(duì)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)的syg-2基因片段，發(fā)現(xiàn)該段基因在松材線蟲(chóng)種內(nèi)保守，與擬松材線蟲(chóng)種間差異極其大。因此，syg-2可以作為松材線蟲(chóng)lamp檢測(cè)的新靶基因。

以syg-2基因?yàn)榘谢?，通過(guò)榮研公司的lamp引物在線設(shè)計(jì)軟件http://primerexplorer.jp/e/進(jìn)行了lamp引物設(shè)計(jì)。所設(shè)計(jì)的lamp引物組見(jiàn)表1。

表1以syg-2為靶基因設(shè)計(jì)的lamp引物

1.3lamp反應(yīng)

lamp反應(yīng)方法參照l(shuí)oopampdna擴(kuò)增試劑盒(eikenchemical)，按下表反應(yīng)液配比構(gòu)建25μl的lamp反應(yīng)體系(表2)。

表2lamp反應(yīng)體系

上述試劑混勻后，加入20μl密封液，混勻離心，蓋緊管蓋。

1.4lamp反應(yīng)結(jié)果檢測(cè)

1.4.1實(shí)時(shí)熒光法

將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光pcr儀，反應(yīng)程序?yàn)?3℃15s，63℃45s作為一個(gè)循環(huán)，于63℃45s處收集熒光信號(hào)，若有“s”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陽(yáng)性(有核酸擴(kuò)增)，若無(wú)“s”型擴(kuò)增曲線，則判斷為陰性(無(wú)核酸擴(kuò)增)。

1.4.2染色法

從實(shí)時(shí)熒光pcr儀中拿出反應(yīng)管，85℃滅活3min，然后將1μl顯色液滴在pcr管蓋中間，蓋緊管蓋。顛倒反應(yīng)管數(shù)次，使反應(yīng)混合液與顯色液充分混勻，觀察反應(yīng)液顏色。若呈現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性(有核酸擴(kuò)增)，呈現(xiàn)橙色則為陰性(無(wú)核酸擴(kuò)增)。

2、結(jié)果與分析

2.1lamp引物對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果

以syg-2為靶基因設(shè)計(jì)的lamp引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3lamp引物對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的16組引物，其中9組引物對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm進(jìn)行l(wèi)amp檢測(cè)，結(jié)果為：

1號(hào)、10號(hào)、13號(hào)和15號(hào)引物組加/不加環(huán)引物都能擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)；

3號(hào)和5號(hào)引物組在加環(huán)引物的情況下，可擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，而不加環(huán)引物，擴(kuò)增不出松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)；

8號(hào)、16號(hào)引物組在加環(huán)引物的情況下，可擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，而不加環(huán)引物，擴(kuò)增不出擬松材線蟲(chóng)。

4號(hào)引物組加/不加環(huán)引物都不能擴(kuò)增出擬松材線蟲(chóng)，但擴(kuò)增效率不算最優(yōu)。

具體的，1號(hào)、4號(hào)和15號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果(實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線)見(jiàn)圖1；

8號(hào)和16號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2；8號(hào)和16號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)天牛的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3；

10號(hào)和13號(hào)引物組不加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4；

1號(hào)、8號(hào)、13號(hào)和15號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5；

3號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖6；

4號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和天牛的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖7；

5號(hào)和16號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖8；

10號(hào)引物組加環(huán)引物，對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。

采用另外7組引物(即：2號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、9號(hào)、11號(hào)、12號(hào)和14號(hào)引物組)對(duì)松材線蟲(chóng)bx和擬松材線蟲(chóng)bm進(jìn)行l(wèi)amp檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這7組引物無(wú)論加環(huán)引物或不加環(huán)引物都不能擴(kuò)增出松材線蟲(chóng)。

2.2攜帶松材線蟲(chóng)的松墨天牛檢出率

應(yīng)用本發(fā)明所述的16號(hào)引物組不加環(huán)引物，分別對(duì)2批松墨天牛進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果松墨天牛中松材線蟲(chóng)的檢出率分別為28.60％和43.75％(表4)。

表4松墨天牛中松材線蟲(chóng)的檢出率

sequencelisting

<110>中國(guó)林業(yè)科學(xué)院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所

<120>用于檢測(cè)松材線蟲(chóng)的lamp引物組、試劑盒及檢測(cè)方法

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