本發(fā)明涉及一種番茄腺毛性狀的連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：番茄是世界上廣泛生產(chǎn)和消費(fèi)的一種重要的蔬菜作物，其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中常遭受多種病蟲害的危害。番茄的腺毛及其次生代謝產(chǎn)物與其對(duì)昆蟲的防御性密切相關(guān)，腺毛分泌物對(duì)多種植食性昆蟲表現(xiàn)出趨避和毒殺作用。因此，利用分子標(biāo)記輔助育種方法選擇腺毛較密的番茄品種在生產(chǎn)上對(duì)于提高番茄產(chǎn)量、降低農(nóng)藥使用量具有重要意義。傳統(tǒng)方法主要靠肉眼鑒定腺毛的密度，但該方法具有很大的局限性。絕大多數(shù)番茄品種的腺毛密度在定植前的幼苗期并無顯著差別，難以通過肉眼鑒別。而利用分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assistedselection，mas)技術(shù)可以在番茄幼苗期快速高效地鑒定出不同腺毛密度地番茄植株，從而選擇所需的品種進(jìn)行定植。目前，關(guān)于番茄的腺毛密度，還沒有可應(yīng)用于生產(chǎn)中的分子標(biāo)記，因此，開發(fā)能夠被廣泛利用于育種中的標(biāo)記，變得尤為重要。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種番茄腺毛性狀的連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種特異引物對(duì)；所述特異引物對(duì)由引物f和引物r組成；所述引物f為如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的單鏈dna分子；(a2)將序列1經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列1具有相同功能的dna分子；所述引物r為如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的單鏈dna分子；(a4)將序列2經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代且與序列2具有相同功能的dna分子。所述特異引物對(duì)的用途為如下(b1)-(b6)中的至少一種：(b1)鑒定或輔助鑒定番茄腺毛性狀；(b2)篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄；(b3)篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄；(b4)制備用于鑒定或輔助鑒定番茄腺毛性狀的試劑盒；(b5)制備用于篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄的試劑盒；(b6)制備用于篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對(duì)的應(yīng)用，為如下(b1)-(b6)中的至少一種：(b1)鑒定或輔助鑒定番茄腺毛性狀；(b2)篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄；(b3)篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄；(b4)制備用于鑒定或輔助鑒定番茄腺毛性狀的試劑盒；(b5)制備用于篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄的試劑盒；(b6)制備用于篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄的試劑盒。本發(fā)明還保護(hù)含有所述特異引物對(duì)的試劑盒；所述試劑盒的應(yīng)用為如下(c1)-(c3)中的至少一種：(c1)鑒定或輔助鑒定番茄腺毛性狀；(c2)篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄；(c3)篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄。本發(fā)明還保護(hù)所述試劑盒的制備方法，包括將所述特異引物對(duì)中的各條引物進(jìn)行獨(dú)立包裝的步驟。本發(fā)明還保護(hù)鑒定或輔助鑒定番茄果實(shí)腺毛性狀的方法(方法甲)，包括如下步驟：以待測(cè)番茄的基因組dna為模板，采用所述特異引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中具有171bp的dna片段、待測(cè)番茄為或候選為具有腺毛的番茄，如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中具有193bp的dna片段且不具有171bp的dna片段，待測(cè)番茄為或候選為腺毛缺失的番茄。本發(fā)明還保護(hù)鑒定或輔助鑒定番茄果實(shí)腺毛性狀的方法(方法乙)，包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)番茄基因組dna中是否含有特異dna片段甲和特異dna片段乙，如果所述基因組dna中含有特異dna片段甲、待測(cè)番茄為或候選為具有腺毛的番茄，如果所述基因組dna中含有特異dna片段乙且不含有特異dna片段甲、待測(cè)番茄為或候選為腺毛缺失的番茄。所述特異dna片段甲為序列表的序列3所示的dna分子；所述特異dna片段甲為序列表的序列4所示的dna分子。所述特異dna片段甲或特異dna片段甲均位于番茄10號(hào)染色體39kb的區(qū)間內(nèi)。本發(fā)明還保護(hù)一種篩選或輔助篩選腺毛豐富的番茄的方法(方法丙)，包括如下步驟：(d1)按照所述方法甲或所述方法乙鑒定待測(cè)番茄腺毛性狀；(d2)基于步驟(d1)的結(jié)果篩選或輔助篩選具有腺毛的番茄。本發(fā)明還保護(hù)一種篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄的方法(方法丁)，包括如下步驟：(e1)按照所述方法甲或所述方法乙鑒定待測(cè)番茄腺毛性狀；(e2)基于步驟(e1)的結(jié)果篩選或輔助篩選腺毛缺失的番茄。本發(fā)明還保護(hù)所述特異引物對(duì)或以上任一所述方法在番茄育種中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)番茄育種方法，為方法a或方法b。所述方法a包括如下步驟：將所述方法丙篩選得到的具有腺毛的番茄作為育種材料。所述方法b包括如下步驟：將所述方法丁篩選得到的腺毛缺失的番茄作為育種材料。以上任一所述待測(cè)番茄具體可為番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)及其自交后代。所述番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)在tomatogeneticsresourcecenter的代碼為la2706。以上任一所述待測(cè)番茄具體可為醋栗番茄solanumpimpinellifolium及其自交后代。所述醋栗番茄solanumpimpinellifolium在tomatogeneticsresourcecenter的代碼為la1375。以上任一所述待測(cè)番茄具體可為番茄‘moneymaker’(solanumlycopersicum‘moneymaker’)和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的雜交后代。本發(fā)明首次利用分子標(biāo)記輔助育種的方法，開發(fā)了番茄腺毛的連鎖標(biāo)記，并在近等基因系群體中進(jìn)行了驗(yàn)證。利用番茄腺毛連鎖標(biāo)記來選育腺毛密度較高的抗蟲番茄品種可以在番茄的幼苗期就進(jìn)行鑒定，不需要等到定植后再進(jìn)行表型測(cè)定，大大提早了鑒定時(shí)間，縮短了不必要的種植面積，減少了人力和物力的消耗。附圖說明圖1為bc4f2群體連鎖標(biāo)記引物鑒定結(jié)果。圖2為nil群體腺毛性狀表型鑒定結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。番茄‘moneymaker’，英文名稱為solanumlycopersicum‘moneymaker’，是一種栽培品種，整個(gè)植株均有腺毛分布。tomatogeneticsresourcecenter，代碼為la2706。醋栗番茄solanumpimpinellifolium，為野生近緣種，整個(gè)植株均無腺毛分布。tomatogeneticsresourcecenter，代碼為la1375。實(shí)施例1、連鎖標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)1、以番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium為親本進(jìn)行雜交，并按單粒傳法獲得由200個(gè)重組自交系構(gòu)成的f10代rils群體。2、通過對(duì)步驟1得到的rils群體進(jìn)行重測(cè)序及腺毛相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析，獲得了一個(gè)與腺毛相關(guān)性狀的qtls(p值為5.94e-18)，位于10號(hào)染色體39kb的區(qū)間內(nèi)。在此區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)合成了一對(duì)可應(yīng)用的連鎖標(biāo)記引物對(duì)(由引物f和引物r組成)，引物信息如表1所示。表1引物信息引物名稱引物序列(5’-3’)faaattggacaattggtccac(序列表的序列1)rgagcaaatcctactacttttg(序列表的序列2)實(shí)施例2、使用連鎖標(biāo)記引物對(duì)鑒定待測(cè)番茄基因型的方法的建立提取待測(cè)番茄的基因組dna，以基因組dna為模板，采用引物f和引物r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中具有171bp的dna片段且不含有193bp的dna片段，則將待測(cè)植株定義為mm純合型；如果pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中具有193bp的dna片段且不具有171bp的dna片段，則將待測(cè)植株定義為pp純合型。采用上述方法對(duì)番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium進(jìn)行鑒定，番茄‘moneymaker’為mm純合型，醋栗番茄solanumpimpinellifolium為pp純合型。實(shí)施例3、連鎖標(biāo)記引物對(duì)在判斷番茄腺毛性狀中的應(yīng)用1、從實(shí)施例1構(gòu)建的重組自交系rils群體中選擇sl021株系(經(jīng)抽樣檢測(cè)，該株系所有植株均為mm純合型)和sl134株系(經(jīng)抽樣檢測(cè)，該株系所有植株均為pp純合型)。2、以sl021株系和sl134株系為親本雜交，得到f1代植株；將f1代植株與親本sl021株系回交3代，再自交一代，獲得bc4f2群體。3、從步驟2得到的bc4f2群體中隨機(jī)選取85棵單株，提取基因組dna。4、檢測(cè)基因型待測(cè)番茄分別為番茄‘moneymaker’、醋栗番茄solanumpimpinellifolium和步驟3得到的85棵單株。采用實(shí)施例2的方法檢測(cè)待測(cè)番茄的基因型。部分待測(cè)番茄的電泳圖見圖1。圖1中，向上箭頭指向的為番茄‘moneymaker’，顯示一條特異條帶(命名為特異條帶1)，向下箭頭指向的為醋栗番茄solanumpimpinellifolium，顯示一條特異條帶(命名為特異條帶2)，其余泳道分別為步驟3得到的不同單株(有的與番茄‘moneymaker’帶型一致，有的與醋栗番茄solanumpimpinellifolium帶型一致，有的顯示為番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的疊加帶型)。將番茄‘moneymaker’以及與番茄‘moneymaker’帶型一致的各個(gè)單株中的特異條帶均進(jìn)行測(cè)序，均如序列表的序列3所示(171bp)，這些單株均為候選mm純合型單株。將醋栗番茄solanumpimpinellifolium以及與醋栗番茄solanumpimpinellifolium帶型一致的各個(gè)單株中的特異條帶均進(jìn)行測(cè)序，均如序列表的序列4所示(193bp)，這些單株均為候選pp純合型單株。將顯示為番茄‘moneymaker’和醋栗番茄solanumpimpinellifolium的疊加帶型的各個(gè)單株中的兩條特異條帶均進(jìn)行測(cè)序，其中一條特異條帶均如序列表的序列3所示(171bp)，其中另一條特異條帶均如序列表的序列4所示(193bp)，這些單株均為雜合型。5、取步驟4鑒定為mm純合型的所有單株、鑒定為pp純合型的所有單株和鑒定為雜合型的所有單株作為待測(cè)樣本，進(jìn)行腺毛表型鑒定。結(jié)果如圖2所示。圖2中，1為mm純合型植株的腺毛表型，2為pp純合型植株的腺毛表型。結(jié)果表明，85棵單株中的mm純合型植株表型全部顯示圖2中的有腺毛表型(85棵單株中的雜合型植株也顯示相同表型)，主要顯示在植株莖段和幼嫩新鮮組織區(qū)域；而85棵單株中的pp純合型植株表型全部顯示圖2中的腺毛缺失表型，看不到明顯的腺毛，整個(gè)植株表皮呈現(xiàn)光滑的表型。因此，說明該位點(diǎn)是與控制植株腺毛性狀緊密連鎖主要的位點(diǎn)，該標(biāo)記可應(yīng)用于腺毛性狀的鑒定。<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>番茄腺毛性狀的連鎖標(biāo)記及其應(yīng)用<160>4<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1aaattggacaattggtccac20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gagcaaatcctactacttttg21<210>3<211>171<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>3aaattggacaattggtccactttttctaaaatagttgaagacaacccataaatagctata60taccataaatatagtccaaaaatattgtactactaatttgtacgagacattttctttaaa120aaaattcacccaaaataggattgtttttttcaaaagtagtaggatttgctc171<210>4<211>193<212>dna<213>番茄（lycopersiconesculentummill.）<400>4aaattggacaattggtccactttttctaaaatagttgaagacaacccataaatagctatt60taccatagatatagtccaaacataccataaatatagtccaaacatattgtactactaatt120tgtatgagacatttcctttaaaaaaattcacccaaaatagaattgtttttttcaaaagta180gtaggatttgctc193當(dāng)前第1頁(yè)12