本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種紫皮石斛多糖及其制備方法，尤其涉及所述紫皮石斛多糖在免疫調(diào)節(jié)和降血糖活性方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

紫皮石斛為雙子葉植物藥蘭科植物齒瓣石斛dendrobiumdevonianumpaxt.的干燥莖，具有益胃生津，滋陰清熱等功效。紫皮石斛莖具節(jié)，稍肉質(zhì)，葉革質(zhì)，互生，因其莖在秋冬收獲季節(jié)除去葉鞘膜后，表面多為紫色，生長在陽光較強(qiáng)的地方者，紫色更加明顯，因此俗稱紫皮石斛或紫皮蘭。新鮮紫皮石斛的莖稈經(jīng)修剪、烘干定型后加工成的螺旋團(tuán)狀顆粒稱為紫皮楓斗。石斛的化學(xué)成分主要為多糖、生物堿、菲類、聯(lián)芐類、酚酸類和黃酮類，另外還含有少量的微量元素以及氨基酸，可用于治療白內(nèi)障、糖尿病、關(guān)節(jié)炎、慢性咽炎、腫瘤等疾病。2015年版《中國藥典》收載有鐵皮石斛dendrobiumofficinale和石斛(金釵石斛dendrobiumnobile、鼓槌石斛dendrobiumchrysotoxum、流蘇石斛dendrobiumfimbriatum等)，其中鐵皮石斛功效冠蓋石斛之首，然其生長條件苛刻、自然繁殖能力低，生長緩慢，價(jià)格昂貴。紫皮石斛價(jià)格僅為鐵皮石斛1/5-1/4，可謂物美價(jià)廉。但目前對(duì)于紫皮石斛多糖的研究還較少。

國內(nèi)外提取石斛多糖有水提醇沉方法、溶劑萃取法、酶解提取、超聲波提取等多種提取技術(shù)，例專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510931074.1的專利公開了“一種提高紫皮石斛中多糖成分浸出率的方法”，將新鮮紫皮石斛洗凈，干燥，切段，粉碎，料液比1:4-8水提，溫度80-100℃，時(shí)間1-3h，提取3-4次，提取物濃縮、干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物。但其并未明確所得的紫皮石斛多糖的具體活性成分及結(jié)構(gòu)特征，使得其應(yīng)用進(jìn)一步受到限制。再如專利申請(qǐng)?zhí)枮?01610611421.7的專利公開了“一種石斛多糖的提取方法”，將原料粉碎后加水經(jīng)過高壓浸泡，過濾濃縮提取液，將濃縮液加乙醇沉淀，真空干燥得到石斛多糖。然而，其采用的原料為鐵皮石斛，其原材料成本高，并且該申請(qǐng)中同樣并未明確所得的石斛多糖的具體活性成分及結(jié)構(gòu)特征，使得其應(yīng)用進(jìn)一步受到限制。又如專利申請(qǐng)?zhí)枮?01610490394.2的專利公開了“鐵皮石斛多糖在制備防治代謝綜合征藥物及保健品中的應(yīng)用”，通過水提醇沉法提取，將鐵皮石斛加水進(jìn)行煎煮，合并多次煎煮所得的鐵皮石斛藥液，減壓濃縮獲得浸膏；再用乙醇沉淀并真空干燥即得鐵皮石斛多糖。然而，其采用的原料為鐵皮石斛，其原材料成本高，并且該申請(qǐng)中同樣并未明確所得的石斛多糖的具體活性成分及結(jié)構(gòu)特征，使得其應(yīng)用進(jìn)一步受到限制。雖然上述公開的文獻(xiàn)中，均制備得到石斛多糖，但多數(shù)是針對(duì)原料成本較高的鐵皮石斛進(jìn)行的，并且均未進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析與活性之間關(guān)系的研究，因而存在無法進(jìn)一步研究或應(yīng)用于市場的問題，嚴(yán)重影響了石斛多糖作為潛在的活性劑在藥品、食品或保健品領(lǐng)域中的應(yīng)用。鑒于此，研究一種原材料成本低、并且結(jié)構(gòu)特征與活性明確的石斛多糖的制備方法與應(yīng)用，是本發(fā)明亟待解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，為了充分利用自然界中的資源，特別是原料價(jià)格低、生產(chǎn)成本低的資源，本發(fā)明對(duì)紫皮石斛進(jìn)行研究，并進(jìn)一步優(yōu)化對(duì)其中含有的紫皮石斛多糖的提取方法，進(jìn)一步明確提取的多糖的結(jié)構(gòu)特征，并且進(jìn)行活性的研究與探討。進(jìn)而，本發(fā)明提供了一種紫皮石斛多糖及其制備方法，以及其在免疫調(diào)節(jié)和降血糖活性的方面的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的：以粉碎的紫皮石斛莖為原料，經(jīng)過脫脂后，熱水微波提取，3-4倍體積乙醇沉淀多糖，加水溶解沉淀物，冷凍干燥得到粗多糖，通過濾膜過濾分離，冷凍干燥，得到高純度的紫皮石斛多糖。

本發(fā)明反復(fù)多次制備出的紫皮石斛多糖經(jīng)過氣相色譜法分析可知，其單糖組成為甘露糖、乙酰化甘露糖和葡萄糖，甘露糖和葡萄糖摩爾質(zhì)量比為20～29:1。

本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖經(jīng)甲基化、氣相色譜-質(zhì)譜法及核磁共振分析可知，其糖苷鍵為β-1,4-manp和β-1,4-glcp，比例為20～27:1。

本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖采用高效凝膠排阻色譜結(jié)合動(dòng)態(tài)光散射分析可知，其分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da。

因此，本發(fā)明提供一種紫皮石斛多糖，碘-碘化鉀試劑顯色陰性，分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da；組成單糖主要為甘露糖、乙酰化甘露糖acetyl-man及少量葡萄糖glc，且甘露糖和葡萄糖組成比大于20:1，糖苷鍵主要為β-1,4-manp和β-1,4-glcp。

本發(fā)明還提供了一種紫皮石斛多糖的制備方法，包括以下步驟：

1)將適當(dāng)粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛以75-85％乙醇回流脫脂；

2)將步驟1)脫脂后殘?jiān)尤胨崛。?/p>

3)水提液加入3-4倍量乙醇醇沉；

4)沉淀物為紫皮石斛粗多糖；

5)紫皮石斛粗多糖配成水提液，采用截留分子量大于3000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復(fù)超濾，直至濾液中基本無糖檢出；

6)截留液冷凍干燥，得紫皮石斛多糖。

本發(fā)明還提供了一種紫皮石斛多糖的制備方法，包括以下步驟：

1)將適當(dāng)粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛加入水提?。?/p>

2)水提液采用截留分子量大于3000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復(fù)超濾，直至濾液中基本無糖檢出；

3)截留液冷凍干燥，得紫皮石斛多糖。

優(yōu)選的，所述紫皮石斛多糖碘-碘化鉀試劑顯色陰性，分子量為1×10⁵-10×10⁵da，主要分子量范圍3×10⁵-5×10⁵da；組成單糖主要為甘露糖、乙酰化甘露糖(acetyl-man)及少量葡萄糖(glc)，且甘露糖和葡萄糖組成比大于20:1，糖苷鍵主要為β-1,4-manp和β-1,4-glcp。

優(yōu)選的，所述步驟4)中冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對(duì)壓強(qiáng)約為4～7帕。

優(yōu)選的，所述步驟1)乙醇濃度80％。

優(yōu)選的，所述步驟2)殘?jiān)c加入水的比例為1:25-1:35，優(yōu)選1:30。

優(yōu)選的，所述步驟3)乙醇濃度95％。

優(yōu)選的，所述步驟5)中采用截留分子量為10000da的超濾膜作超濾處理。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備免疫調(diào)節(jié)藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備提高機(jī)體免疫功能的食品和保健品方面的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備降血糖藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種如上所述的紫皮石斛多糖在制備預(yù)防和治療糖尿病的食品和保健品方面的應(yīng)用。

本申請(qǐng)人經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖具有促進(jìn)鼠巨噬細(xì)胞raw264.7釋放no的作用，同時(shí)能增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用，并具有劑量依賴性。本發(fā)明制備出的紫皮石斛多糖具有降低血糖作用，并具有劑量依賴性。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明以紫皮石斛莖為原料，其原料來源豐富，成本低，但具有豐富的藥理價(jià)值。

通常采用水提醇沉得到的石斛多糖多含有大量淀粉，采用碘試驗(yàn)顯色，本發(fā)明制備的紫皮石斛多糖經(jīng)碘試驗(yàn)測試后不顯色。

本發(fā)明制備的紫皮石斛多糖結(jié)構(gòu)特征明確，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜和核磁共振檢測其單糖組成和糖苷鍵類型，高效凝膠排阻色譜-多角度激光聯(lián)用檢測其分子量及在溶液中的構(gòu)象，并經(jīng)藥理研究證明此紫皮石斛多糖具有免疫調(diào)節(jié)和降血糖活性，為進(jìn)一步研究開發(fā)多糖類藥物或功能性食品提供了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是紫皮石斛多糖的單糖組成gc-ms圖。

圖2是紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型gc-ms圖。

圖3是紫皮石斛多糖nmr圖。

圖4是紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構(gòu)象分析hpsec-malls-ri圖譜。

圖5是不同濃度紫皮石斛多糖的細(xì)胞活性(a)及對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞no分泌量(b)的影響柱狀圖。

圖6是不同濃度紫皮石斛多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力影響柱狀圖(a)及流式細(xì)胞儀圖譜(b)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是本發(fā)明并不僅僅局限于這些實(shí)施例，這些實(shí)施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在權(quán)利要求的范圍內(nèi)所做出的某些改變和調(diào)整也應(yīng)該認(rèn)為屬于本發(fā)明范圍。

若無特殊說明，所用實(shí)驗(yàn)方法為常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法；所使用的試劑和材料等均可通過商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1

紫皮石斛多糖的制備：

(1)紫皮石斛莖干燥、打粉，用80％乙醇回流脫脂，加入水使得料液比1:30，微波反應(yīng)提取，微波功率800w，反應(yīng)時(shí)間9min。

(2)水提液濃縮至一定體積，加入4倍體積95％乙醇沉淀，靜置30min，4000g離心10min，保留沉淀，加水復(fù)溶，冷凍干燥得到粗多糖，提取率為28.3％。其中，冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對(duì)壓強(qiáng)約為4～7帕。

(3)將上述粗多糖加去離子水配成濃度為5-10mg/ml的溶液，超濾(截留分子量:>3kda,millipore,billerica,ma,usa)，棄超濾液，反復(fù)多次補(bǔ)水、超濾，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測濾液中糖含量，直至濾液中基本無糖檢出，截留液冷凍干燥，得到純化后的紫皮石斛多糖(ddp)。采用苯酚-硫酸法測定ddp糖含量為93.6％，采用碘-碘化鉀無淀粉檢出，采用間羥基聯(lián)苯比色法無糖醛酸檢出。其中，冷凍干燥條件為：溫度-50～-70℃，絕對(duì)壓強(qiáng)約為4～7帕。

實(shí)施例2

紫皮石斛多糖的制備：

將適當(dāng)粉碎的新鮮或干燥紫皮石斛加入水提取，水提液采用截留分子量10000da的超濾膜作超濾處理；棄濾液后反復(fù)多次補(bǔ)水、超濾，采用苯酚-硫酸法跟蹤檢測濾液中糖含量，直至濾液中基本無糖檢出，截留液冷凍干燥，得到純化后的紫皮石斛多糖(ddp)，采用碘-碘化鉀無淀粉檢出，采用間羥基聯(lián)苯比色法無糖醛酸檢出。

實(shí)施例3

紫皮石斛多糖的鑒定：

(1)紫皮石斛多糖的單糖組成分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定紫皮石斛多糖的單糖組成，取5mg紫皮石斛多糖樣品加入1ml2mtfa，于微波下水解，微波條件為：功率500w，微波時(shí)間4min，待冷卻后，水解液于氮吹吹干，加入0.5ml吡啶(含20mg鹽酸羥胺)90℃反應(yīng)30min，后再加入0.5ml乙酸酐加熱90℃30min，氮?dú)獯蹈桑?ml甲醇溶解后gc-ms測定。

gc-ms分析條件為：色譜柱agilent19091s-433，hp-5ms毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為he氣，柱流量1.0ml/min。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比25:1，進(jìn)樣量1μl；柱溫：程序升溫：初始溫度165℃，保持7min,以5℃/min的速率程序升溫至185℃，保持5min，以4℃/min的速率程序升溫至200℃，以20℃/min升至280℃。

其結(jié)果見圖1，由圖1紫皮石斛多糖的單糖組成gc-ms圖中可知，該紫皮石斛多糖由甘露糖和葡萄糖兩種單糖組成，其摩爾比為甘露糖：葡萄糖＝20-29:1。

(2)紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型分析

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振測定紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型，稱取3mg紫皮石斛多糖，加入1ml無水dmso，充分溶解。加入約20mgnaoh，置于常溫超聲溶解10min。再加入100μlch3i，利用微波輔助甲基化，微波功率為200w，及微波下反應(yīng)4min，冷卻后利用透析管透析(分子截留量3500da)，再利用超濾離心管超濾濃縮(分子截留量3500da)樣品。加入tfa至終濃度2m，封管，微波輔助水解(500w,4min)，反應(yīng)結(jié)束后，氮吹干燥。加入1ml2mnh4oh(1mnabh4)還原，置于常溫?cái)嚢?h。加入50μlch3cooh終止反應(yīng)，氮吹干燥，加入200μl甲醇，和5μlch3cooh干燥兩次，最后加入200μl甲醇干燥。利用0.5ml吡啶和0.5ml乙酸酐進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，90℃反應(yīng)30min。反應(yīng)后利用1ml水和1mlch2cl2萃取兩次，收集ch2cl2層，樣品氮吹干燥，加入1ml甲醇復(fù)溶。

gc-ms分析條件為：色譜柱agilent19091s-433，hp-5ms毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm)；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為he氣，柱流量1.0ml/min。進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比25:1，進(jìn)樣量1μl；柱溫：程序升溫：初始溫度120℃，以5℃/min的速率程序升溫至200℃，以8℃/min的速率程序升溫至250℃，以20℃/min升至280℃。

其結(jié)果見圖2，由圖2紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型gc-ms圖中的甲基化結(jié)果可知，紫皮石斛多糖中主要糖苷鍵為1,4-manp和1,4-glcp，其比例為20-27:1，以及含有少量的t-glcp。

稱取20mg紫皮石斛多糖，反復(fù)利用0.5mld2o充分溶解并凍干三次，最后利用0.5mld2o充分溶解，于¹hnmr和¹³cnmr分析。

其結(jié)果見圖3，由圖3紫皮石斛多糖的糖苷鍵類型nmr圖中可知，具體見圖3a/b，紫皮石斛多糖中主要糖苷鍵類型為β-d-manp，乙?；壤s為15-25％。

(3)紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構(gòu)象分析

采用高效凝膠排阻色譜-多角度激光光散射法測定紫皮石斛多糖的分子參數(shù)以及在溶液中的鏈構(gòu)象，稱取約3mg紫皮石斛多糖，溶解于1.0ml0.9％(w/v)的氯化鈉水溶液中，hplc-malls-rid-dad檢測條件：流動(dòng)相為0.9％(w/v)的氯化鈉水溶液；色譜柱柱溫35℃；流速0.5ml/min；色譜柱tskgelg5000pwxl串聯(lián)tskgelg3000pwxl；進(jìn)樣量100μl，并聯(lián)用dad檢測樣品uv吸收。

其結(jié)果參見圖4，由圖4的紫皮石斛多糖的分子參數(shù)及構(gòu)象分析hpsec-malls-ri圖譜可知，紫皮石斛重均分子量mw范圍為1.0～10.0×10⁵da，主要為3.0-4.0×10⁵da，無紫外吸收，說明該多糖組分相對(duì)均一(圖4a/b/c)。由構(gòu)象分析公式<s²>z^1/2＝kmw^v計(jì)算，v值為0.38，可知該紫皮石斛多糖在0.9％nacl溶液中呈球形(圖4d)。

實(shí)施例4

紫皮石斛多糖的免疫活性測定

(1)細(xì)胞培養(yǎng)

raw264.7細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(atcc)，采用培養(yǎng)基dmem，加10％胎牛血清，1％鏈/青霉素，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)細(xì)胞活力檢測

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100μl，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至5000/孔。5％co2，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的藥物，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、lps(0.4μg/ml)陽性藥對(duì)照組。5％co2，37℃孵育24h。每孔加入20μlmtt溶液(至終濃度1mg/ml)，繼續(xù)避光培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入100μl二甲基亞砜，避光低速振蕩5-10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。

其結(jié)果參見圖5，由圖5不同濃度紫皮石斛多糖的細(xì)胞活性(a)的影響柱狀圖可知，紫皮石斛多糖在100-400μg/ml濃度下對(duì)raw264.7細(xì)胞無毒性(圖5a)。

(3)no釋放測定

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入100μl，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度至5×10⁴/孔。5％co2，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的藥物，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組、lps(0.4μg/ml)陽性藥對(duì)照組。5％co2，37℃孵育24小時(shí)。離心細(xì)胞板300g，5分鐘，收集細(xì)胞上清75μl，加入75μlgriess試劑室溫反應(yīng)15分鐘。在酶聯(lián)免疫檢測儀od540nm處測量各孔的吸光值。

其結(jié)果參見圖5，由圖5不同濃度紫皮石斛多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞no分泌量(b)的影響柱狀圖可知，紫皮石斛多糖ddp在100-800μg/ml濃度下具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放no的作用，并且具有濃度依賴性(圖5b)。

(4)細(xì)胞吞噬功能檢測

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞(40×10⁴/孔)于12孔板中，37℃孵育培養(yǎng)過夜，加入濃度梯度的紫皮石斛多糖ddp和lps(0.4μg/ml)。5％co2，37℃孵育18h。棄去原培養(yǎng)基藥物，加入含fitc-dextran染液(終濃度0.1mg/ml)的培養(yǎng)基避光，繼續(xù)培養(yǎng)1h。棄去培養(yǎng)基，然后用冷的pbs(含2％fbs)清洗4次去除未進(jìn)入細(xì)胞的fitc-dextran。流式細(xì)胞儀檢測fitc平均熒光強(qiáng)度。

其結(jié)果參見圖6，由圖6不同濃度紫皮石斛多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力影響柱狀圖(a)及流式細(xì)胞儀圖譜(b)可知，紫皮石斛多糖ddp在100-800μg/ml濃度下具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用，并且具有濃度依賴性(圖6)。

實(shí)施例5

紫皮石斛多糖的降血糖活性測定：取腹腔注射四氧嘧啶80mg/kg造模成功的60只小鼠隨機(jī)分為糖尿病模型組、陽性對(duì)照組(消渴丸)、紫皮石斛多糖高、中、低劑量組，每組12只，編號(hào)。另隨機(jī)抽取12只沒有注射四氧嘧啶的小鼠作為空白對(duì)照組。陽性對(duì)照組(消渴丸1g/kg)、紫皮石斛多糖低(25mg/kg)、中(50mg/kg)、高劑量組(100mg/kg)按體質(zhì)量灌胃給藥，糖尿病模型組和空白對(duì)照組灌胃給予生理鹽水0.1ml/10g。每天灌胃給藥1次，連續(xù)15d。用血糖儀測定第5、10、15天禁食3h、灌胃5h后的血糖值。

結(jié)果見表1，表明：紫皮石斛多糖具有降低糖尿病小鼠高血糖作用，在給藥15d后明顯低于給藥前水平(p＜0.01)；在給藥15d后，紫皮石斛多糖高、中、低劑量組、陽性對(duì)照組與糖尿病模型組比較差異極顯著(p＜0.01)。

表1紫皮石斛多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖影響(x±s)

注：—.不給藥；

與糖尿病模型組比，*p＜0.01；**p＜0.01；

與給藥前比，▲p＜0.05；▲▲p＜0.01。

顯然，上述實(shí)施例中所示具體提取方法及參數(shù)僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。