本發(fā)明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一種受低溫和脫落酸誘導的啟動子s6pdhp3及其應用。

背景技術：

啟動子對于一個基因的表達具有非常重要的調控作用。qi等(2007)認為大豆pvsr2基因啟動子的(-222/-188)區(qū)和(-187/-147)區(qū)是重金屬脅迫響應的關鍵區(qū)域。xu等(2010)發(fā)現葡萄芪合成酶基因啟動子的(-162/0)區(qū)對脅迫誘導最為關鍵。li等(2013)的結果也表明gpp基因啟動子受不同逆境的誘導。

在植物抗逆啟動子方面，現有技術進行了富有成效的研究，如中國農業(yè)科學院棉花研究所所持的中國專利201310450331.0提供了一種干旱脅迫誘導的啟動子。不過，目前，在低溫和脫落酸誘導啟動子方面的研究還相對較少。

因此，構建一種受低溫和脫落酸誘導的啟動子是十分必要的。

技術實現要素：

針對現有技術的缺點，本發(fā)明的目的之一在于提供一種受低溫和脫落酸誘導的啟動子，所述啟動子的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明的另一個目的在于提供包含上述啟動子的表達載體。本發(fā)明所述的表達載體可以為任何一種可包含本發(fā)明所述啟動子的表達載體，如pgwb433表達載體。

在實際利用時，舉例而言，本發(fā)明所述的表達載體可以用于表達gus基因。

本發(fā)明的另一個目的在于提供包含上述啟動子的重組菌或表達盒。

本發(fā)明的所述的表達盒由所述啟動子、所述啟動子轉錄的目的基因和終止子構成。

本發(fā)明的另一個目的在于提供利用所述啟動子培育轉基因植物的方法，該方法包括：構建含所述啟動子的表達載體并轉化入植物中，得到受低溫和脫落酸誘導表達的轉基因植物。

舉例而言，本發(fā)明所述的植物可以為薔薇科植物(山梨醇(sorbitol)是其糖代謝的主要形式)。

如本發(fā)明的實施例所示，所述植物可以為擬南芥。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的啟動子可以顯著的提高外源基因在低溫脅迫和脫落酸脅迫下的表達水平，可將其用于提高和改善植物在逆境脅迫下的生長特性和環(huán)境適應性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明s6pdhp3::gus融合表達載體的pcr檢測；

圖2為本發(fā)明所得轉基因擬南芥的pcr檢測；

圖3為本發(fā)明轉基因擬南芥不同部位gus染色結果圖；其中，a：葉；b：莖；c：花；d：根；

圖4為本發(fā)明實施例1低溫處理下轉基因擬南芥中gus活性分析；其中，gus活性平均值源自3次獨立試驗；標準差標于柱型圖上；單側配對t檢驗用于顯著性差異檢測分析(*：p<0.05)；wt：野生型；

圖5為本發(fā)明實施例1aba處理下轉基因擬南芥中gus活性分析；gus活性平均值源自3次獨立試驗；標準差標于柱型圖上；單側配對t檢驗用于顯著性差異檢測分析(**：p<0.01)；wt：野生型；

圖6為本發(fā)明是實施例1和對比實施例1～3低溫處理下轉基因擬南芥中進行低溫誘導時的gus活性分析；gus活性平均值源自3次獨立試驗；標準差標于柱型圖上；單側配對t檢驗用于顯著性差異檢測分析(**：p<0.01)；wt：野生型。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用于對本發(fā)明進行進一步的說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員根據上述發(fā)明內容所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

1.1材料

本研究所用的擬南芥(arabidopsisthaliana)為columbia野生型。mug、sds、tris酚、x-gal、4-mu購自sigma公司，bpclonaseenzymemix和lrclonaseenzymemix均購自invitrogen公司，其它試劑均為國產分析純。載體pdonr221(kan抗性)、pgwb433、農桿菌eha105和含有蘋果s6pdhp基因的載體(pmd-s6pdhp)為本實驗室保存。大腸桿菌top10感受態(tài)購買于天根公司。

1.2s6pdhp3::gus融合表達載體的構建

以蘋果基因組dna為模板，使用attb-p3(1f)s與attb-p(1f)a(表1)配對進行第1輪pcr擴增，產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化。然后以第1輪pcr純化產物為模板，attb-p3(2f)s和attb-p(2f)a為引物進行第2輪pcr擴增，產物經1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收純化。最后再以第2輪pcr純化產物為模板，attba/s為引物(表1)進行第3輪pcr擴增，最終獲得攜帶attb全位點的attb-s6pdhp3產物。以上產物進行回收純化后用于下一步bp反應構建entry載體。

利用得到的attb-s6pdhp3產物和pdonr221進行bp反應，構建含卡那霉素抗性的entry載體。將bp反應產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞后，用卡那霉素進行篩選，并對菌液進行pcr鑒定。將獲得的entry載體質粒通過lr反應連接到pgwb433表達載體上，將lr反應產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞中，用壯觀霉素進行篩選，并對菌液進行pcr鑒定，引物為attba/s(圖3)。鑒定為陽性的菌液進行測序驗證。測序正確的命名為pgwb433-s6pdhp3，菌液提取質粒后轉化農桿菌感受態(tài)eh105待用。結果表明我們成功地構建了s6pdhp::gus融合表達載體。

表1

1.3pgwb433-s6pdhp3轉化擬南芥

首先用70％的酒精(1min)和naclo溶液(10％的naclo水溶液，10min)依次浸泡擬南芥種子；然后用無菌水沖洗至少3次；然后把種子均勻懸浮于0.05％的瓊脂糖溶液中，再傾倒于不含抗生素的固體b5培養(yǎng)基上，風干后封口。

將以上培養(yǎng)皿在4℃冰箱中放置4～7天，然后把培養(yǎng)皿放到光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)(16h光照25℃，8h黑暗20℃)。待擬南芥長出4-6片真葉時進行移苗土培。移苗培養(yǎng)后3～4周后即可形成大量花簇，可用于下一步轉基因試驗。移苗土培期間約10d施用一次hogland培養(yǎng)液。

陽性農桿菌培養(yǎng)至od600值為1.5-2.0，離心后用適量5％蔗糖溶液重懸至od600值為0.4-0.7即可，再加入0.02％的sweet試劑。立即浸染已經提前一天澆好水的擬南芥花絮10s。黑暗培養(yǎng)24h后轉至正常條件培養(yǎng)至結果，記為t0代。

將收獲的t0代種子進行無菌消毒后，在含有50mg/l的卡那霉素的ms培養(yǎng)基上進行篩選。培養(yǎng)兩周后獲得t1代擬南芥抗性幼苗，對t1代擬南芥的葉片提取總dna后進行pcr檢測(引物為attb)，檢測出現目的條帶的擬南芥視為轉基因成功(圖2)。以上植株經過連續(xù)3代篩選得到t3代純合體，收取種子后進行后續(xù)試驗。對轉基因擬南芥進行gus活性染色，結果發(fā)現可以在轉基因擬南芥的葉、莖、花和根中檢測到gus活性(圖3)。

1.4轉基因擬南芥低溫和外源脫落酸處理后gus活性分析

將t3代種子無菌消毒后培養(yǎng)到4-6片真葉時分別進行低溫和aba處理，在分別處理12h和24h后進行gus酶活檢測(圖4和圖5)。結果表明：在低溫處理12h后，與常溫對照相比，轉基因株系中gus活性有所提高，達到顯著水平(圖4)。與無菌水處理的對照相比，經過24小時的aba處理后，轉基因擬南芥中gus活性顯著升高，達到顯著水平(圖5)。結果表明，s6pdhp3能低溫和外源脫落酸誘導。對比例1

與實施例1相比，除啟動子的序列如seqidno:2所示之外，其余步驟參考實施例1。

對比例2

與實施例1相比，除啟動子的序列如seqidno:3所示之外，其余步驟參考實施例1。

對比例3

與實施例1相比，除啟動子的序列如seqidno:4所示之外，其余步驟參考實施例1。

如附圖6所示，在進行低溫誘導時，本發(fā)明的gus活性顯著高于對比例1～3。

sequencelisting

<110>四川農業(yè)大學

<120>一種受低溫和脫落酸誘導的啟動子s6pdhp3及其應用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>836

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<212>dna

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<210>4

<211>236

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

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