本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種gata2蛋白可結(jié)合的dna片段及其在檢測細胞內(nèi)gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

gata結(jié)合蛋白2(gata2)由gata2基因編碼，是轉(zhuǎn)錄因子gata家族成員之一。目前研究發(fā)現(xiàn)：gata2對參與造血及內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤細胞的增殖與分化的基因起到重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。gata2通過其c端鋅指結(jié)構(gòu)，結(jié)合位于靶基因啟動子、轉(zhuǎn)錄起始位點的上游或接近啟動子區(qū)域從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。

gata2蛋白作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子一直備受關(guān)注。研究表明：在實體腫瘤中，gata2高表達與前列腺癌的預(yù)后不良及復(fù)發(fā)密切相關(guān)。除此之外，gata2在人類乳腺癌細胞中高表達，通過抑制pten基因轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤細胞增殖。然而，也有報道在肝細胞肝癌中，gata2表達降低，且與肝細胞肝癌的不良預(yù)后相關(guān)。因而，gata2可能作為不同類型腫瘤預(yù)后判斷的新型預(yù)測因子。

然而，目前檢測內(nèi)源性gata2仍然依靠的是westernblot技術(shù)，這類方法雖然特異度高，但靈敏度低，而且操作復(fù)雜，檢測到的只是gata2蛋白含量的差異，并不能直接體現(xiàn)其活性的改變，而gata2的活性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，我們需要檢測的不僅是gata2的轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)含量，而是需要檢測gata2結(jié)合至有效位點以影響轉(zhuǎn)錄的活性。因此，找到一種簡單可靠的檢測內(nèi)源性gata2活性的方法對于gata2的研究顯得極為重要。

因此，需要設(shè)計一種新的用于檢測細胞內(nèi)gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，gata2蛋白結(jié)合的dna序列存在高度的保守性，其結(jié)合的dna核心序列為t/a(gata)a/g。

基于以上研究，本發(fā)明提供了一種gata2蛋白可結(jié)合的dna片段，其包含一個或多個gata2蛋白結(jié)合框，所述gata2蛋白結(jié)合框的序列為5’-t/a(gata)a/g-3’。

優(yōu)選地，當(dāng)包含多個gata2蛋白結(jié)合框時，每兩個相鄰的gata2蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列，并且每兩個相鄰的gata2蛋白結(jié)合框之間的間隔序列為所述間隔序列為ag、ac或aa。用多個結(jié)合框可提高gata2蛋白的識別和結(jié)合效率，提高靈敏度。

優(yōu)選地，所述dna片段的序列如seqidno:1所示。在研究過程中，我們試驗了多種組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列的dna片段比其他組合方式對gata2蛋白的結(jié)合效率更高。

本發(fā)明還提供了上述dna片段在檢測細胞內(nèi)gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測細胞內(nèi)gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法，其包括以下步驟：

s1：將包括上述dna片段以及連接于所述dna片段下游的報告基因表達框的報告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細胞；

s2：通過檢測所述報告基因的表達來計算所述細胞內(nèi)gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。可將報告基因的表達強度作為指示gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

優(yōu)選地，所述報告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，包括重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，并且所述重組質(zhì)粒帶有所述dna片段以及連接在所述dna片段下游的熒光素酶i的表達框，所述對照質(zhì)粒帶有熒光素酶ii的表達框，所述熒光素酶i與所述熒光素酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長不同。將gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性表示為熒光素酶i激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度與熒光素酶ii激發(fā)產(chǎn)生的熒光強度的比值。

優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒通過將所述dna片段插入至質(zhì)粒pgl3-basic的kpni與hindiii位點之間得到。

優(yōu)選地，所述對照質(zhì)粒為phrl-tk。

優(yōu)選地，s1具體包括：

s11：將所述細胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；

s12：將所述重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中。

優(yōu)選地，s2具體包括：

s21：轉(zhuǎn)染后將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時，洗滌細胞；

s22：分別檢測轉(zhuǎn)染后的細胞中的熒光素酶i和熒光素酶ii的活性；

s23：將熒光素酶ii活性歸一化熒光素酶i活性得到值作為衡量gata2轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

通過使用本發(fā)明的dna片段和方法，可直接針對性地檢測細胞內(nèi)gata2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而非僅僅檢測其轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)的含量，從而使得能夠更準(zhǔn)確地分析gata2作為轉(zhuǎn)錄因子在一些發(fā)育生物學(xué)和病理學(xué)發(fā)展中所起的作用。

附圖說明

圖1為kpni與hindiii對重組質(zhì)粒進行雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳照片；

圖2為分別轉(zhuǎn)染有pgl3.0-basic和pgl3.0-gata2-luc的人前列腺癌細胞系pc-3、人宮頸癌細胞系hela和人胚腎細胞系hek-293t細胞中的相對gata2活性(即，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計圖；

圖3為分別轉(zhuǎn)染有pegfp-n1(即，空載體)和pcegfp-n1-gata2的人前列腺癌細胞系pc-3、人宮頸癌細胞系hela和人胚腎細胞系hek-293t細胞中的相對gata2活性(即，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.構(gòu)建gata2蛋白可結(jié)合的dna片段

發(fā)明人對gata2進行研究分析，發(fā)現(xiàn)gata2蛋白結(jié)合的dna序列為5’-t/a(gata)a/g-3’，合成該dna核心序列時，將這段dna核心序列重復(fù)四次，以ag、ac或aa堿基進行間隔，并連接至攜帶螢火蟲熒光素酶的表達載體(pgl3.0-basic)中，構(gòu)建成功后，該熒光素酶報告基因表達載體即包含四個重復(fù)的gata2蛋白結(jié)合的dna核心序列，以ag、ac或aa堿基進行間隔，其序列如seqidno:1所示。

為保證載體構(gòu)建的成功，在末端加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點的粘性末端，本例在5’端加入kpni酶切位點的粘性末端(catgg)，在3’端加入hindiii酶切位點的粘性末端(ttcga)，序列兩邊的粘性末端的設(shè)計有助于片段與載體的連接。

通過從頭合成的方法，分別合成該片段的兩條寡核苷酸鏈，其序列分別如seqidno:2和3所示，這兩條寡核苷酸鏈皆由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。兩條寡核苷酸鏈互補配對后形成包含kpni酶切位點粘性末端和hindiii酶切位點粘性末端的雙鏈dna片段。100μl退火體系如下：annealingbufferfordnaoligos(5x)20μl、寡核苷酸鏈(50μm)各20μl，余下為ddh2o。

充分混勻后，設(shè)置pcr儀程序進行退火反應(yīng)，具體程序為：95℃退火2分鐘(目的是讓dnaoligo充分變性)；每90秒下降1℃，降至25℃后結(jié)束反應(yīng)。dna退火產(chǎn)物用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定(由于dna片段較小，電泳鑒定無法看到單一、特異的條帶)，測濃度后置冰上備用。

2.將gata2蛋白可結(jié)合的dna片段插入熒光素酶表達載體

用內(nèi)切酶kpni和hindiii(購自takara公司，kpni貨號為1618，hindiii貨號為1615)對上述pgl3.0-basic空載體進行雙酶切，20μl酶切體系如下：10xquickcutgreenbuffer2μl，kpni1μl，hindiii1μl，pgl3.0-basic空載體1μg，余下為ddh2o。

充分混勻后，37℃酶切反應(yīng)90分鐘，用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒雙酶切后的情況，然后切膠回收(dna膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，貨號為dp209)，回收結(jié)束后測樣品濃度，置冰上備用。

將退火得到的雙鏈dna連接至pgl3.0-basic熒光素酶表達載體上。10μl連接體系如下：dna連接酶(購自takara公司，貨號為6022)5μl，雙鏈dna片段與經(jīng)雙酶切的pgl3-basic載體共5μl。為促進酶連成功率，將dna片段與載體的摩爾比控制在8:1左右。充分混勻后，將酶連體系置于pcr儀中，16℃反應(yīng)1小時，連接反應(yīng)結(jié)束后得到重組質(zhì)粒，置于冰上備用。

將重組質(zhì)粒(含有g(shù)ata2蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3.0-basic表達載體)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。具體方法如下：取解凍后的感受態(tài)大腸桿菌dh5α，加入上述連接好的重組質(zhì)粒，輕柔吹打，冰上孵育20分鐘，42℃熱休克60秒，冰上靜置3分鐘，然后加入450μl不含抗生素的lb液體培養(yǎng)基，放置于恒溫搖床中復(fù)蘇1小時(37℃，200rpm)。取復(fù)蘇后的菌液至鋪有固體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素)培養(yǎng)皿上，用玻璃鋪菌器將菌液均勻地鋪滿整個平皿，放置10分鐘后，倒置于37℃孵箱過夜后，觀察細菌生長情況。挑取菌落至5ml含氨芐青霉素的lb液體培養(yǎng)基，搖菌(37℃，200rpm)繁殖12小時后提取質(zhì)粒，1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定

用內(nèi)切酶kpni和hindiii(購自takara公司，kpni貨號為1618，hindiii貨號為1615)對上述提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，本發(fā)明實施例雙酶切鑒定如圖1所示(泳道1為marker，泳道2和3顯示為陽性克隆)。陽性組送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，確認(rèn)dna片段已整合至pgl3-basic載體上.至此，含有g(shù)ata2蛋白結(jié)合的dna片段的pgl3-basic表達載體(以下均表示為pgl3.0-gata2-luc)構(gòu)建成功。

3.pgl3.0-gata2-luc轉(zhuǎn)染細胞

本發(fā)明實施例采用人前列腺癌細胞系pc-3、人宮頸癌細胞系hela、人胚腎細胞系hek-293t進行雙熒光素酶實驗。分別將對數(shù)期生長的細胞均勻種植在24孔板內(nèi)，每孔約10萬個細胞，用10％胎牛血清，高糖dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁并恢復(fù)形態(tài)后，將報告基因系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中(轉(zhuǎn)染時細胞密度約為60-80％為宜)。使用的轉(zhuǎn)染試劑為neofect(購自零客創(chuàng)智生物科技有限公司，貨號為tf20121201)。50μl轉(zhuǎn)染體系如下：質(zhì)粒0.5μg，neofect轉(zhuǎn)染試劑0.5μl，余下為無血清培養(yǎng)基。

本實驗中使用的質(zhì)粒分別為：pgl3.0-basic空報告基因質(zhì)粒、pgl3.0-gata2-luc(含有g(shù)ata2蛋白的核心dna結(jié)合位點序列的pgl3.0-basic報告基因質(zhì)粒)、phrl-tk(帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒)、pcegfp-n1-gata2(gata2過表達質(zhì)粒)。

4.計算gata2的活性

以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進行標(biāo)準(zhǔn)化，計算gata2活性。具體實驗方法如下：轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時，再棄培養(yǎng)基上清，用1xpbs清洗細胞3次，每次5分鐘，清洗細胞時注意操作輕柔，避免正面吹打細胞。采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(購自蓋寧生物科技有新公司，貨號為gn201-01)進行檢測。

本發(fā)明實施例為驗證該報告基因系統(tǒng)是否具有活性，將pgl3.0-gata2-luc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細胞中，檢測gata2報告基因系統(tǒng)的活性，測定結(jié)果如圖2所示，處理組(轉(zhuǎn)染pgl3.0-gata2-luc)熒光活性明顯高于對照組(轉(zhuǎn)染pgl3.0-basic空載體)。

本發(fā)明實施例為驗證該報告基因系統(tǒng)是否可以特異性檢測gata2活性，將pegfp-n1-gata2轉(zhuǎn)染至細胞，結(jié)果如圖3所示，外源導(dǎo)入gata2后，陽性處理組(轉(zhuǎn)染pegfp-n1-gata2)熒光活性明顯高于對照組(轉(zhuǎn)染pegfp-n1空載體)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

序列表

<110>華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120>一種gata2蛋白可結(jié)合dna片段及在gata2活性檢測中的應(yīng)用

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agagataagaactgataacaaaagataggaagtgatagca40

<210>2

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