本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種比拉底白刺NbCIPK25基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

比拉底白刺（Nitrariatangutorum）屬于無患子目（Sapindales）白刺科（Nitrariaceae）白刺屬（Nitraria），主要分布于澳大利亞南部干旱草原或沙漠，為澳洲特有白刺種類。白刺屬為強(qiáng)旱生落葉灌木，具有極強(qiáng)耐鹽抗旱性。研究表明，比拉底白刺不僅可以生存于含鹽量達(dá)900mM的環(huán)境中，而且還可以改善鹽性，提高土壤的肥力，對(duì)于生態(tài)平衡的維持具有重要作用。此外，白刺果實(shí)中含有豐富的生物堿、黃酮和酚酸等類活性物質(zhì)，具有降血壓，降血脂，抗氧化，抗腫瘤以及抗炎等藥用價(jià)值。因此，白刺作為一種生態(tài)和經(jīng)濟(jì)植物逐漸受到關(guān)注。目前，比拉底白刺的研究主要包括種源分布，生物堿類活性物質(zhì)及抗旱耐鹽生理生化性質(zhì)等方面，為比拉底白刺的育種，活性物質(zhì)開發(fā)利用及抗逆分子機(jī)理的研究提供數(shù)據(jù)支持，也為抗性基因的挖掘與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

CIPKs（CBL-interacting protein kinase），與CBL形成CBL-CIPK復(fù)合體，參與植物在脅迫環(huán)境中Ca²⁺的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為植物特有的Ser/Thr類磷酸蛋白激酶基因。CIPKs在N端有保守的激酶結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)催化目的蛋白；C端含有NAF結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)與CBL蛋白結(jié)合。目前數(shù)據(jù)表明，在模式植物擬南芥中有26個(gè)CIPK類同源異型盒基因，水稻中有30個(gè)CIPK類同源異型盒基因，楊樹中有27個(gè)CIPK類同源異型基因。眾多研究表明，CIPK類基因在植物耐鹽，耐低鉀，抗寒和抗旱等抗逆過程中發(fā)揮重要作用。

目前有研究報(bào)道的是鷹嘴豆的CIPK25基因，其研究結(jié)果表明鷹嘴豆在NaCl，PEG，低溫，ABA，IAA，MeJA及SA等處理環(huán)境下，其CIPK25基因均上調(diào)表達(dá)以響應(yīng)脅迫環(huán)境；CaCIPK25在鹽脅迫條件下，可以促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草的種子萌發(fā)及根生長(zhǎng)，提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性。此外，胡楊的PeCIPK25基因與PeCBL1形成復(fù)合體調(diào)節(jié)Na⁺/K⁺平衡。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種比拉底白刺NbCIPK25基因。本發(fā)明的另一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因的表達(dá)蛋白。本發(fā)明還有一目的是提供比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐鹽育種中的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種比拉底白刺NbCIPK25基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述的比拉底白刺NbCIPK25基因的表達(dá)蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述的比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐鹽育種中的應(yīng)用。

含有比拉底白刺NbCIPK25基因的載體。

含有比拉底白刺NbCIPK25基因的宿主細(xì)胞。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明結(jié)合比拉底白刺的抗旱耐鹽特性，利用比拉底白刺的葉片提取組織RNA，通過同源比對(duì)設(shè)計(jì)引物，克隆了比拉底白刺抗旱耐鹽相關(guān)的CIPK基因片段，再通過5’RACE和3’RACE技術(shù)獲得基因全長(zhǎng)，并根據(jù)擬南芥中的同源基因而命名為NbCIPK25。再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及擬南芥花絮侵染法獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。在正常培養(yǎng)環(huán)境中，比拉底白刺NbCIPK25基因過表達(dá)的擬南芥T3代純合植株的生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)與野生型擬南芥無明顯差異。在干旱及鹽脅迫處理過程中，純合轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱耐鹽性顯著高于野生型擬南芥，由此證明了比拉底白刺NbCIPK25基因在植物抗旱耐鹽方面的功能，為植物抗逆基因庫增加了資源，對(duì)于提高植物的抗逆性研究具有重要意義。

附圖說明

圖1是比拉底白刺總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是NbCIPK25基因完整開放閱讀框克隆的PCR結(jié)果圖；

圖3是NbCIPK25基因的表達(dá)載體圖；

圖4是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在含0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl培養(yǎng)基上萌發(fā)4天和10天的狀態(tài)圖；

圖5是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在含0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl培養(yǎng)基上萌發(fā)4天的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖；

圖6是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在分別添加0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上處理14天的生長(zhǎng)狀態(tài)圖；

圖7是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在分別添加0mM NaCl, 100mM NaCl和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上處理14天的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)圖；

圖8是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在分別添加0mM, 100mM, 150mM, 200mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)3天的狀態(tài)圖；

圖9是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在分別添加0mM, 100mM, 150mM, 200mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)3天的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)圖；

圖10是NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥在分別添加0mM和150mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上處理4天的生長(zhǎng)狀態(tài)和根數(shù)、葉數(shù)及根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1

以比拉底白刺的葉片為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)成cDNA，設(shè)計(jì)相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，測(cè)序并分析。確定為目的序列后，依據(jù)該序列設(shè)計(jì)RACE引物，PCR獲取5’和3’序列，測(cè)序分析后，拼接得到NbCIPK25全長(zhǎng)序列。依據(jù)全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得全長(zhǎng)片段，與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，再次測(cè)序和分析，確定為全長(zhǎng)目的片段。在目的片段兩端添加酶切位點(diǎn)。表達(dá)載體pBI121雙酶切后，在T4連接酶的作用下與目的片段相連。重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105和GV3101中，等待擬南芥適齡后，利用花絮浸泡法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過抗生素篩選及PCR檢測(cè)鑒定獲取T1代，T2代及T3代純合轉(zhuǎn)基因植株，然后對(duì)純合轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行抗旱耐鹽性對(duì)比分析。具體如下：

（1）總RNA的提取

以比拉底白刺的葉片為材料，按照NORGEN試劑盒（Norgen Biotek）的操作步驟進(jìn)行RNA提取，所使用的試劑和耗材均處理使其無RNA酶。比拉底白刺葉片總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，條帶較清晰；測(cè)定總RNA的吸光度，OD₂₆₀/OD₂₈₀值為2.02，OD₂₆₀/OD₂₃₀為1.91，可用作基因克隆。

RNA提取的具體過程為：在0.1%DEPC溶液過夜處理的研缽中加入液氮進(jìn)行充分磨樣，然后取800μL Lysis Solution于樣品中進(jìn)行勻漿后轉(zhuǎn)移至2mL新管。12000rpm離心2min，取上清移至新管中。加入等體積的70%乙醇，渦旋混勻。將混合液移至柱子中（下接2mL收集管），離心1min，倒掉濾液，放回收集管。加入400μL Wash Solution ，離心1min，棄濾液，放回收集管。加入DNaseI工作液，12000rpm離心1min，將濾液吸回柱子上，25-30℃靜置15min。加入400μL Wash Solution，12000rpm離心1min，棄濾液。再次加入400μL Wash Solution，12000rpm離心1min，棄濾液。將柱子放回收集管，12000rpm離心2min，棄收集管。將柱子放入1.5mL管子中加入50μLElution Solution。先200~2000rpm離心2min，再12000rpm離心1min，體積不足50μL，再用14000rpm離心1min。

（2）cDNA的獲得

以提取的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，所使用的是Invitrogen公司的SuperScript? III First-Strand Synthesis Kit。RNA使用量為1μg，具體過程為：配置反應(yīng)液（1μg RNA，1μL Primer（OligodT），1μL 10mM dNTP mix，DEPC-TreatedWater，up to 10μL），短暫低速離心后，65℃ 5min，立即置于冰上1~2min。向上一步的管中加入試劑（2μL 1 0×RT Buffer，4μL 25mM MgCl₂，2μL 0.1M DTT，1μLRNaseOUT（40U/μL），1μLSuperScript III RT），置于PCR儀上，反應(yīng)程序?yàn)?0℃ 50min，85℃ 5min。將上一步的反應(yīng)液離心，每管中加入1μL的RNase H ，37℃ 20min。

（3）目的基因的同源克隆

根據(jù)比拉底白刺的部分轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過NCBIblast進(jìn)行比對(duì)，利用Oligo7設(shè)計(jì)特異性引物，克隆獲得NbCIPK25基因片段，然后進(jìn)行連接載體、轉(zhuǎn)化大腸桿菌、目的序列測(cè)序和序列分析，確定為目的基因。克隆引物，PCR體系和PCR程序如下所示。

NbCIPK25片段克隆引物為：

CIPK25 forward primer：5'-AACAAGGATAAAGTGAAGAAGGAAGT-3'，

CIPK25 reverse primer：5'-CCTGACAAAACTTAACATACTCCAAG-3'。

PCR反應(yīng)體系（20μL）為：2μL 10×PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10×dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μL Forward primer（10uM/L）、1μL Reverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性5min，55℃退火30s，72℃延長(zhǎng)1min20s，35個(gè)循環(huán)。

（4）目的基因5’端和3’端序列克隆

利用Oligo7設(shè)計(jì)RACE引物，進(jìn)行CIPK25基因3’末端和5’末端的克隆，切膠回收獲得目的片段，然后與載體pMD19-T連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆，測(cè)序和序列分析，確定獲得NbCIPK25基因的兩個(gè)末端序列后，拼接得到NbCIPK25基因全長(zhǎng)序列。RACE引物，PCR反應(yīng)體系和程序如下所示。

RACE引物為：

CIPK25:3’race primer A：5’-CAATTCCGGCCATCATGCGTCTCCCCT-3'，

CIPK25:3’race primer B：5'-AGGTTACAGGGGAAATTCGAGGGGAGG-3'，

CIPK25:3’race primer C：5'-GAAGTTGCGGTGGTGGAATTCTCGAAGT-3'，

CIPK25:5’race primer A：5’-GTATCGGCTTTGGCTCCGTCGTATCC-3’，

CIPK25:5’race primer B：5’-ACTGTGTGTGGAGGAGCCCGTCGTTG-3’，

CIPK25:5’race primer C：5’- ATCGACGGCGCTGATCAACTGCTGG-3’，

RACE A item 的PCR反應(yīng)體系（20μL）為：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10′dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLCIPK25:3’/ 5’race primer A（10uM/L）、1μL10′Universal Primer A Mix、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

RACE A item 的PCR反應(yīng)程序：95℃變性5min，69℃/66℃退火（3’end/5’end）30s，72℃延長(zhǎng)（3’end/5’end）50s/45s，35循環(huán)。

RACE B和C item 的PCR反應(yīng)體系（20μL）為：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、2μL dNTP、0.4μL Kode、0.6μL Universal Primer A Mix、0.6μLCIPK25:3’/ 5’race primer B/C、1μLDiluent of race A product、12.2μL ddH₂O。

RACE B和C item 的PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min，98℃變性10s，67℃/66℃/69℃/68℃（3’race B /3’raceC/5’raceB/5’raceC）退火30s，68℃延伸30s/30s/40s/30s（3’race B /3’race C/5’race B/5’race C），35個(gè)循環(huán)。

（5）基因全長(zhǎng)獲取

根據(jù)CIPK25基因全長(zhǎng)序列，利用Oligo7設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因克隆引物，PCR及切膠回收獲得NbCIPK25全長(zhǎng)基因，與pMD19-T連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌，經(jīng)過測(cè)序分析，再次確定為完整CIPK25基因。比拉底白刺的CIPK25基因全長(zhǎng)為1925bp，命名為NbCIPK25，具體序列如SEQ ID NO.1所示，開放閱讀框（ORF）序列長(zhǎng)度為1356bp，所表達(dá)的蛋白序列包括452個(gè)氨基酸，如SEQ ID NO.2所示。圖2為NbCIPK25基因含完整ORF的克隆結(jié)果。全長(zhǎng)基因克隆的引物，PCR反應(yīng)體系及程序具體如下：

全長(zhǎng)基因克隆引物為：

CIPK25:wl forward primer：5'-ATGGCGGAGGAGGATAAAC-3'，

CIPK25:wl reverse primer：5'-AACTTCCACAGTCATCTCATCTC-3'，

PCR反應(yīng)體系（20μL）為：2μL 10′PCR Buffer、1.2μL Mg²⁺（25mM/L）、0.4μL 10′dNTP、0.1μL Tag（5.0U/ul）、1μLForward primer（10uM/L）、1μLReverse primer（10uM/L）、1μL Template cDNA（100ng/ul）、13.3μL ddH₂O。

PCR反應(yīng)程序：95℃變性5min，57℃退火30s，72℃延長(zhǎng)2mins，35個(gè)循環(huán)。

實(shí)施例2基因功能驗(yàn)證

構(gòu)建35S：CIPK25表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入野生型哥倫比亞擬南芥中，觀察比拉底白刺NbCIPK25基因是否能增強(qiáng)擬南芥的抗旱耐鹽性，比較轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的表型差異，分析比拉底白刺CIPK25基因的功能。

1）載體的構(gòu)建

本發(fā)明所用大腸桿菌菌株為E. coli JM109（寶生物工程（大連）有限公司購(gòu)入）；表達(dá)載體為pBI 121（Biovector Co.,LTD公司購(gòu)入）。限制性內(nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs（NEB）。T4連接酶購(gòu)自Takara。

具體過程如下：

1.通過PCR向CIPK25基因片段上下游分別添加XbaI和SmaI酶切位點(diǎn)，PCR體系及反應(yīng)條件同全長(zhǎng)擴(kuò)增，引物分別是：

NbCIPK25F+XbaⅠ：5'-GCTCTAGAATGGCGGAGGAGGATAAAC-3'，

NbCIPK25R+SmaⅠ：5'-TCCCCCGGGAACTTCCACAGTCATCTCATCTC-3'，

Forward restricted site of XbaⅠ：5' -T∧CTAGA-3'，

Reverse restricted site ofSmaⅠ：5' -CCC∧GGG-3'，

2.PCR產(chǎn)物測(cè)序正確后，在T4連接酶的作用下，可進(jìn)行載體的構(gòu)建。使用XbaⅠ和SmaⅠ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切反應(yīng)處理pBI 121表達(dá)載體。

雙酶切反應(yīng)（20μL）體系及步驟：2μL CutSmart buffer、0.5μLXbaⅠ、1μgpBI121質(zhì)粒、ddH₂O補(bǔ)足20μL；37℃水浴，反應(yīng)4h；加入0.5μLSmaⅠ，酶切反應(yīng)4h；1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離；用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（AXYGEN）進(jìn)行回收并純化酶切產(chǎn)物，溶于20μL的TE緩沖液中。相同操作從克隆載體上獲取目的基因。

3.檢測(cè)所回收的酶切產(chǎn)物濃度，按連接體系加入各試劑（目的片段分子數(shù)：載體分子數(shù)=3:1~5:1），16℃過夜連接。25μL連接反應(yīng)體系為：2.5μL T4 DNA ligase buffer（10×）、5μL酶切的表達(dá)載體、15.5μL酶切的PCR產(chǎn)物、2μL T4 DNA ligase、ddH₂O補(bǔ)足25μL。

4.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109超感細(xì)胞，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜；使用全長(zhǎng)引物進(jìn)行菌液PCR，以篩選陽性克隆，之后用AxyPrep Plasmid MiniprepKit（AXYGEN）提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。同時(shí)測(cè)序檢測(cè)載體構(gòu)建過程中是否發(fā)生突變或者缺失現(xiàn)象。構(gòu)建表達(dá)載體如圖3所示。

2）農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

1.本發(fā)明使用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101（ Biovector Co.,LTD公司購(gòu)入）。采用的是液氮凍融法將構(gòu)建好的pBI121+NbCIPK25表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。具體過程為：1）冰浴融化GV3101感受態(tài)細(xì)胞，加入至少100ng回收純化的表達(dá)載體質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴20~30 min；2）液氮速凍l min，37℃熱擊3 min，迅速置于冰上1~2min；3）加入800 μL無抗生素的LB培養(yǎng)基，28℃，200 rpm復(fù)蘇3.5h；4） 4000 rpm離心3 min，吸掉700μL培養(yǎng)基；5）混勻剩余菌液，涂抹于添加50 mg.L^-1卡納霉素的固體LB培基上；6） 28℃倒置培養(yǎng)30~48h；7）PCR檢測(cè)陽性克隆，4℃保存陽性克隆備用。

2.待種植的健康狀態(tài)的擬南芥生長(zhǎng)至開花。將PCR檢測(cè)的陽性克隆，搖菌至OD₆₀₀為0.8時(shí)，進(jìn)行擬南芥花器官浸泡轉(zhuǎn)化。具體過程如下：1）將菌液5000 rpm，5 min離心，收集菌體，用5%蔗糖溶液懸?。?）在浸泡前，加入SilwetL-77，濃度為0.05%（500 μL/L），晃出泡沫；3）將擬南芥的地上部分在農(nóng)桿菌懸浮溶液中浸泡30 sec，期間輕輕晃動(dòng)，4）將浸過的擬南芥平躺在托盤里，用保鮮膜覆蓋保濕，錫箔紙密封避光24h；5）揭開錫箔紙，正常條件下培養(yǎng)，當(dāng)種子成熟時(shí)停止?jié)菜?/p>

3.收獲種子進(jìn)行干燥，滅菌后用卡那霉素篩選T1代種子，篩選培養(yǎng)基：1/2MS+卡那霉素50mg/L+頭孢200mg/L。

4.篩選獲得的陽性植株移至土里繼續(xù)培養(yǎng)，收取T1代擬南芥種子后，繼續(xù)進(jìn)行篩選獲得T2代植株。然后，收取T2代擬南芥植株的種子后，繼續(xù)進(jìn)行篩選，鑒定純合T3代株系。

3）轉(zhuǎn)NbCIPK25基因擬南芥耐鹽性試驗(yàn)

取4個(gè)純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系和野生型擬南芥各50粒種子分別放在含有0mM，100mM和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，種子春化2-3天后放于光下萌發(fā)，4天后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。4個(gè)純合轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥株系分別命名為OX-1，OX-2，OX-3，OX-4和WT。六次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。萌發(fā)4天和10天的表型如圖4所示，萌發(fā)4天的萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖5所示。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，萌發(fā)四天后，在0mM NaCl環(huán)境中，轉(zhuǎn)NbCIPK25基因的4個(gè)過表達(dá)株系的種子萌發(fā)率與WT的種子萌發(fā)率差異較明顯，轉(zhuǎn)基因株系分別比WT的萌發(fā)率高3.53%，4.80%，4.90%和5.39%。在100mMNaCl環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因株系分別比WT的萌發(fā)率高53.00%，50.06%，53.10%和54.62%，呈極顯著性差異（P<0.01）。在150mM鹽處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系分別比WT高38.92%，53.96%，55.50%和51.40%，其中OX-2和OX-3與WT之間差異極顯著（P<0.01）。從鹽萌發(fā)結(jié)果可知，NbCIPK25可以提高擬南芥種子在鹽脅迫環(huán)境中的萌發(fā)率。

轉(zhuǎn)基因植株和WT種子在1/2MS培養(yǎng)上萌發(fā)生長(zhǎng)1周后，每個(gè)株系取30株轉(zhuǎn)移至分別添加0mM，100mM和150mM NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的生長(zhǎng)表型。三次重復(fù)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行。生長(zhǎng)表型如圖6所示。觀察轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)，可知NbCIPK25在正常條件下會(huì)促進(jìn)植株的根生長(zhǎng)。在100mM和150mMNaCl環(huán)境下，NbCIPK25可以植物促進(jìn)擬南芥葉片及根部的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出比WT更好的生長(zhǎng)狀態(tài)。圖7為轉(zhuǎn)基因擬南芥及野生型擬南芥的根長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

4）NbCIPK25轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性試驗(yàn)

將三個(gè)純合轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子和WT擬南芥種子種在分別添加了0mM,，100mM，150mM和 200mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，萌發(fā)3天后，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖8、9所示，萌發(fā)第3天時(shí)，在含0mM甘露醇的培養(yǎng)基，三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系比WT的萌發(fā)率分別高49%，43%和45%，且差異極顯著。甘露醇濃度在100mM和150mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系比WT株系的萌發(fā)率高，但OX-2與WT的差異不明顯。當(dāng)甘露醇濃度為200mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)率比野生型分別高78%，73%和72%，均呈差異極顯著性（P<0.01）。

將OX-1轉(zhuǎn)基因擬南芥和WT種子在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)一周后，每個(gè)株系各取60株轉(zhuǎn)移到分別添加0mM和150mM甘露醇的1/2MS培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)4天后，觀察擬南芥生長(zhǎng)狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)根數(shù)量，葉片數(shù)量及根長(zhǎng)數(shù)據(jù)。

結(jié)果如圖10所示，在0mM甘露醇環(huán)境下處理4天后，轉(zhuǎn)基因擬南芥OX-1的根長(zhǎng)比WT的長(zhǎng)19%，差異極顯著（P<0.01），葉片數(shù)量及根數(shù)和WT無明顯差異；在150mM甘露醇環(huán)境下處理4天后，轉(zhuǎn)基因擬南芥OX-1的根長(zhǎng)比WT的長(zhǎng)29%，差異極顯著（P<0.01），轉(zhuǎn)基因擬南芥OX-1的根數(shù)和葉片數(shù)量分別比WT多42%和20%，差異極顯著（P<0.01）。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林業(yè)大學(xué)

<120> 一種比拉底白刺N(yùn)bCIPK25基因及其表達(dá)蛋白和應(yīng)用

<130> 100

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1925

<212> DNA

<213> Nitrariatangutorum

<400> 1

cccttaaaaa ccaaaaccaa aaccaaaacc aaaccaagca caataccagg ttctacaatg 60

gccttaaatc aaagagtccc cttcgttatg cctttccatc ctcagatcaa aacctcactt 120

gggaaacttt ccttcaatat tcccagaaat aatatcaacc actctcagtc aacaatccat 180

ggagtccaat agagtcttac gaagttcccc cctttcttca accaaaatct taaaaccctt 240

ttgtaatttt ttacagtagc ccttaagaag aagaaaggat cgaattttga ttcgaaagtt 300

tggagattta gggcttgttc tcaatggcgg aggaggataa acatatgttg ttcgggaagt 360

atgagatggg gagattgctt gggaagggca ctttcgccaa agtctatcac gggaagaaca 420

tcgtttctgg ggaaagtgtc gccattaaag tgatcaacaa ggataaagtg aagaaggaag 480

tgatgatgga gcaaatcaag agagaaatct ccgttatgcg gctcgctcgt catccgaacg 540

tcgtcgagtt gaaagaggtc atggcgacga agaccaagat attttttatg atggagtacg 600

tcaagggcgg cgaactcttc gccaaagtcg ccaagggcaa aatgagcgaa gatcttgccc 660

gtaaatattt ccagcagttg atcagcgccg tcgatttctg tcacagccgc ggcgtctccc 720

accgagatct gaaaccggag aatctgctct tggacgaaaa cgaggatctc aaaatctccg 780

atttcggtct ctcggctctg ccggaacatt tacgcaacga cgggctcctc cacacacagt 840

gcgggacgcc tgcttacgtg gcgccggagg ttttaaggaa aaaaggatac gacggagcca 900

aagccgatac atggtcctgt ggagtgattt tatatgtgct cctcgccgga ttcttaccgt 960

ttcaggatga gaatctgatg aagatgtacc ggaaaatttt caaagcagaa tttgaatttc 1020

cgccgtggtt ttcgacggat gcgaagcgtt tgatctccag acttctaatc cctgatccag 1080

aacggagaat tacaattccg gccatcatgc gtctcccctg gttccggaag gatttaacgc 1140

agacgacgtc gtttgcgatg gaagaacctg ctgaaattga aaaaacagag gaagatataa 1200

acgactcagc ccgtaagagt accaaaacga cgtcgccgaa gttctttaac gcgttcgaat 1260

ttatctcatc gatgtcgtcg ggatttgatt tctctagcct gttcgagaac acgagaaaat 1320

caggatcgat gttcacgtcg aagtgctcgg cgagtggtat tatggagaaa atcgaaggag 1380

tcggaaacgc gatgaatttc aaagtgtcga aactgaagga tttcaaagtg aggttacagg 1440

ggaaattcga ggggaggaaa gggcggctgg ccgtgaccgc ggaagtatac gaggtggcgg 1500

cggaagttgc ggtggtggaa ttctcgaagt cggctggaga taccttggag tatgttaagt 1560

tttgtcagga agatgttagg ccggcgttga aagacattgt ttggacatgg caaggtgaca 1620

atgttgtcgg taactgtaac ggtaataaaa ctgagggaga tgagatgact gtggaagttt 1680

gagtggtaat ttcgcagtgg tgaaaacatg acatgaacct ctttaggatt tttgtcttaa 1740

gaaaaagtat tttgtgattc gtgcttttag ttttggtttt tggggaaact tggtttaatg 1800

agccctttgt aaatagtttg tgtttactgc atcagttgga acttggaagc aatgtggttg 1860

tagaaaacgt gaacttccaa tttaaactaa tattttgaaa gtaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920

aaaaa 1925

<210> 2

<211> 452

<212> PRT

<213> Nitrariatangutorum

<400> 2

Met Ala Glu Glu Asp Lys His Met Leu Phe Gly Lys Tyr Glu Met Gly

1 5 10 15

Arg Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Ala Lys Val Tyr His Gly Lys Asn

20 25 30

Ile Val Ser Gly Glu Ser Val Ala Ile Lys Val Ile Asn Lys Asp Lys

35 40 45

Val Lys Lys Glu Val Met Met Glu Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Val

50 55 60

Met Arg Leu Ala Arg His Pro Asn Val Val Glu Leu Lys Glu Val Met

65 70 75 80

Ala Thr Lys Thr Lys Ile Phe Phe Met Met Glu Tyr Val Lys Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Phe Ala Lys Val Ala Lys Gly Lys Met Ser Glu Asp Leu Ala

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Ser Ala Val Asp Phe Cys His Ser

115 120 125

Arg Gly Val Ser His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Asn Glu Asp Leu Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Pro

145 150 155 160

Glu His Leu Arg Asn Asp Gly Leu Leu His Thr Gln Cys Gly Thr Pro

165 170 175

Ala Tyr Val Ala Pro Glu Val Leu Arg Lys Lys Gly Tyr Asp Gly Ala

180 185 190

Lys Ala Asp Thr Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Tyr Val Leu Leu Ala

195 200 205

Gly Phe Leu Pro Phe Gln Asp Glu Asn Leu Met Lys Met Tyr Arg Lys

210 215 220

Ile Phe Lys Ala Glu Phe Glu Phe Pro Pro Trp Phe Ser Thr Asp Ala

225 230 235 240

Lys Arg Leu Ile Ser Arg Leu Leu Ile Pro Asp Pro Glu Arg Arg Ile

245 250 255

Thr Ile Pro Ala Ile Met Arg Leu Pro Trp Phe Arg Lys Asp Leu Thr

260 265 270

Gln Thr Thr Ser Phe Ala Met Glu Glu Pro Ala Glu Ile Glu Lys Thr

275 280 285

Glu Glu Asp Ile Asn Asp Ser Ala Arg Lys Ser Thr Lys Thr Thr Ser

290 295 300

Pro Lys Phe Phe Asn Ala Phe Glu Phe Ile Ser Ser Met Ser Ser Gly

305 310 315 320

Phe Asp Phe Ser Ser Leu Phe Glu Asn Thr Arg Lys Ser Gly Ser Met

325 330 335

Phe Thr Ser Lys Cys Ser Ala Ser Gly Ile Met Glu Lys Ile Glu Gly

340 345 350

Val Gly Asn Ala Met Asn Phe Lys Val Ser Lys Leu Lys Asp Phe Lys

355 360 365

Val Arg Leu Gln Gly Lys Phe Glu Gly Arg Lys Gly Arg Leu Ala Val

370 375 380

Thr Ala Glu Val Tyr Glu Val Ala Ala Glu Val Ala Val Val Glu Phe

385 390 395 400

Ser Lys Ser Ala Gly Asp Thr Leu Glu Tyr Val Lys Phe Cys Gln Glu

405 410 415

Asp Val Arg Pro Ala Leu Lys Asp Ile Val Trp Thr Trp Gln Gly Asp

420 425 430

Asn Val Val Gly Asn Cys Asn Gly Asn Lys Thr Glu Gly Asp Glu Met

435 440 445

Thr Val Glu Val

450

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25 forward primer序列

<400> 3

aacaaggata aagtgaagaa ggaagt 26

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25 reverse primer序列

<400> 4

cctgacaaaa cttaacatac tccaag 26

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer A序列

<400> 5

caattccggc catcatgcgt ctcccct 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer B序列

<400> 6

aggttacagg ggaaattcga ggggagg 27

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:3'race primer C序列

<400> 7

gaagttgcgg tggtggaatt ctcgaagt 28

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer A序列

<400> 8

gtatcggctt tggctccgtc gtatcc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer B序列

<400> 9

actgtgtgtg gaggagcccg tcgttg 26

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:5'race primer C序列

<400> 10

atcgacggcg ctgatcaact gctgg 25

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:wl forward primer序列

<400> 11

atggcggagg aggataaac 19

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> CIPK25:wl reverse primer序列

<400> 12

aacttccaca gtcatctcat ctc 23

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NbCIPK25F+XbaⅠ序列

<400> 13

gctctagaat ggcggaggag gataaac 27

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NbCIPK25R+SmaⅠ序列

<400> 14

tcccccggga acttccacag tcatctcatc tc 32

<210> 15

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Forward restricted site of XbaⅠ序列

<400> 15

tctaga 6

<210> 16

<211> 6

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Reverse restricted site ofSmaⅠ序列

<400> 16

cccggg 6