本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是人肺正常組織及肺癌組織類(lèi)器官培養(yǎng)體系，屬于細(xì)胞培養(yǎng)或組織培養(yǎng)技術(shù)。本發(fā)明還包括了利用培養(yǎng)得到的肺癌組織構(gòu)建小鼠動(dòng)物模型的方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是目前發(fā)病率及死亡率第一的惡性腫瘤，肺組織/肺癌組織細(xì)胞原代培養(yǎng)及肺癌動(dòng)物模型是研究肺癌發(fā)生、發(fā)展及治療等的重要工具。傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)使得培養(yǎng)的細(xì)胞在體外環(huán)境下逐漸失去其在體內(nèi)原有狀態(tài)，其形態(tài)、生物功能、遺傳等方面的表現(xiàn)和人體內(nèi)細(xì)胞差異極大，不能夠滿(mǎn)足現(xiàn)有的對(duì)于人肺癌醫(yī)學(xué)研究需要。體外3d培養(yǎng)條件下使用成熟人體細(xì)胞培養(yǎng)人體組織類(lèi)器官(organoid)，這種類(lèi)器官可在體外表現(xiàn)出與體內(nèi)細(xì)胞相似的遺傳物質(zhì)以及結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，并可以在體內(nèi)和體外被順利誘導(dǎo)為具有正常功能的組織細(xì)胞?？茖W(xué)家已成功在體外3d培養(yǎng)條件下使用成熟人源組織細(xì)胞培養(yǎng)出肝臟、小腸等組織類(lèi)器官。這些類(lèi)器官細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下保持與體內(nèi)細(xì)胞相似的遺傳物質(zhì)，并且具有形態(tài)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，可以在體內(nèi)外被順利誘導(dǎo)為具有正常功能的對(duì)應(yīng)組織細(xì)胞。這一技術(shù)可以為研究提供充足的遺傳穩(wěn)定、均一的體外培養(yǎng)的組織細(xì)胞，并將可能對(duì)直接研究基因在人體細(xì)胞中的作用提供巨大的幫助。目前還未有關(guān)于肺組織及肺癌組織類(lèi)器官培養(yǎng)的方法，成功在體外構(gòu)建肺組織及肺癌組織類(lèi)官培養(yǎng)體系，可以為我們提供充足的遺傳穩(wěn)定、均一的體外培養(yǎng)人源肺正常細(xì)胞或肺癌細(xì)胞，將對(duì)肺及肺癌研究提供巨大的幫助。另外，當(dāng)前常用于科學(xué)研究的肺癌動(dòng)物模型主要分為三類(lèi)，包括基因工程小鼠模型、移植瘤模型以及人源異種移植瘤模型(pdx，patientderivedxenograftmodel)，如表1所示。表1肺癌動(dòng)物模型由于小鼠腫瘤基因組研究結(jié)果距離直接用于指導(dǎo)人類(lèi)腫瘤基因組學(xué)研究還有較大距離；而細(xì)胞系移植瘤模型則局限于細(xì)胞系與人源腫瘤細(xì)胞從基因及生物學(xué)功能等方面差異；pdx模型雖然部分彌補(bǔ)了上述兩種模型的缺陷，且也是當(dāng)前較為流行的研究人源腫瘤生物學(xué)特征或藥物篩選及鑒定的主要方法，但仍存在局限，由于皮下移植的原因，傳統(tǒng)pdx模型無(wú)法提供肺組織原位微環(huán)境，進(jìn)而可能導(dǎo)致人源腫瘤在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中相關(guān)生物學(xué)特征丟失，無(wú)法模擬人體內(nèi)的情況；另一方面，構(gòu)建pdx模型對(duì)人源肺癌細(xì)胞數(shù)量有一定的要求(每只小鼠需要5*10^5個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)組織塊)，而目前臨床腫瘤標(biāo)本非常珍貴，一些特殊的臨床標(biāo)本如穿刺標(biāo)本等小標(biāo)本可供實(shí)驗(yàn)研究的組織細(xì)胞量較少，可能無(wú)法滿(mǎn)足模型構(gòu)建需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中缺少遺傳穩(wěn)定、均一的體外肺組織/肺癌細(xì)胞培養(yǎng)方法，所存在的對(duì)于肺癌發(fā)病機(jī)理、肺癌治療藥物研究限制的問(wèn)題，提供一種人肺正常組織和/或肺癌組織培養(yǎng)方法。成功采用3d培養(yǎng)技術(shù)在體外構(gòu)建肺組織及肺癌組織類(lèi)官培養(yǎng)體系，為實(shí)驗(yàn)研究提供充足的遺傳穩(wěn)定、均一的，與人體細(xì)胞高度一致的體外培養(yǎng)細(xì)胞，將對(duì)肺及肺癌研究提供巨大的幫助。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：一種體外培養(yǎng)人正常肺組織及肺癌組織類(lèi)器官的方法，包括獲取新鮮的人源肺組織細(xì)胞，膠原酶消化為單細(xì)胞；體外3d培養(yǎng)條件培養(yǎng)人肺癌組織類(lèi)器官。本發(fā)明中應(yīng)用了3d培養(yǎng)技術(shù)，在體外環(huán)境中培養(yǎng)得到了具有遺傳穩(wěn)定、均一的肺組織、肺癌組織細(xì)胞。結(jié)合對(duì)于人肺組織細(xì)胞體外培養(yǎng)具有重要意義的培養(yǎng)條件，成功實(shí)現(xiàn)了肺組織、肺癌組織的活性培養(yǎng)，且具有非常接近人體內(nèi)肺組織、肺癌細(xì)胞組織的活性特點(diǎn)，對(duì)于有關(guān)于肺及肺癌的研究試驗(yàn)的基礎(chǔ)條件提供了可靠的實(shí)驗(yàn)原料，能夠?qū)崿F(xiàn)促進(jìn)科學(xué)研究的作用。進(jìn)一步，所述體外培養(yǎng)人正常肺組織及肺癌組織類(lèi)器官的方法，獲取新鮮的人源肺癌組織，膠原酶消化為單細(xì)胞，與基質(zhì)膠混合后使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。進(jìn)一步，所述條件培養(yǎng)基含有以下成分：b27、n-acetylcysteine、egf、noggin、r-spondin1、a83-01、fgf10、nicotinamide、y-27632*、wnt3a、glutamax、n2、gastin中的一種或多種。優(yōu)選的至少必須含有其中的fgf10，r-spondin1，noggin，wnt3a，a83-01，b27/n2。進(jìn)一步，所述體外培養(yǎng)人正常肺組織及肺癌組織類(lèi)器官的方法，亦稱(chēng)人肺正常組織和/或肺癌組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：(1)取肺組織和/或肺癌組織剪碎，優(yōu)選在冰上剪碎或同等低溫環(huán)境剪碎，或同等低溫環(huán)境機(jī)械破碎。肺組織和/或肺癌組織來(lái)源于合法途徑的實(shí)驗(yàn)室提供，或者肺癌治療患者的檢測(cè)分析樣/留樣，或者已有的實(shí)驗(yàn)室培育的用于研究的肺癌細(xì)胞，可以是任意合法途徑得到的肺組織、肺癌組織等。(2)取剪碎的組織塊，膠原酶消化處理，優(yōu)選在gentalmacs全自動(dòng)組織處理器上用膠原酶重懸。具體的：用膠原酶重懸剪碎的組織塊，用gentalmacs全自動(dòng)組織處理器在ctube中運(yùn)行humanlung(人肺)及humantumor(人腫瘤)程序1；優(yōu)選的，剪碎的組織塊用量為0.5-1克，膠原酶的用量為10ml。所述gentlemacs為全自動(dòng)組織處理器，可以使用其他同類(lèi)的處理儀器進(jìn)行相應(yīng)的消化分散處理。(3)將膠原酶處理后的組織塊，在36-38℃繼續(xù)消化處理10-30min。優(yōu)選為37℃搖床上進(jìn)行消化處理，消化時(shí)間優(yōu)選20min。優(yōu)選搖床速度為100-300rpm，最好是220rpm，搖床上完成消化使得組織細(xì)胞充分分散開(kāi)來(lái)。(4)將經(jīng)過(guò)消化的溶液轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)組織處理器gentalmacs上。優(yōu)選地，在gentalmacs上，運(yùn)行humanlung及humantumor程序2；(5)步驟4處理后的溶液，在36-38℃繼續(xù)消化處理5-20min。優(yōu)選37℃、220rpm搖床處理，處理時(shí)間優(yōu)選為10min。(6)將步驟5處理好的含有肺組織細(xì)胞的液體用80-130μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，優(yōu)選100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾；過(guò)濾后，加入8-15mldmem/f12終止消化，優(yōu)選加入10mldmem/f12終止消化；離心去除上清液，優(yōu)選離心參數(shù)為2-10℃，100-300g，3-8min離心，例如4℃、200g、5min離心處理去除上清液。(7)去除紅細(xì)胞，優(yōu)選使用紅細(xì)胞裂解液重懸。更優(yōu)選用5ml紅細(xì)胞裂解液在冰上裂解2-5min，優(yōu)選5min。(8)離心去除上清液；優(yōu)選離心溫度2-8℃，100-300g離心3-10min。例如4℃，200g，離心5min。離心以后去除了紅細(xì)胞裂解液以及被裂解液破壞的紅細(xì)胞，得到純凈的肺組織細(xì)胞。(9)加入dmem/f12重懸，優(yōu)選加入10mldmem/f12重懸；然后離心去除上清液，優(yōu)選2-10℃，100-300g，3-8min離心去除上清液，最好是4℃，200g，5min離心，去除上清。(10)細(xì)胞計(jì)數(shù)，混合martrigel，20000細(xì)胞每40μl，滴于48孔板孔中。最好是滴于各個(gè)板孔的正中，避免細(xì)胞培養(yǎng)液滴入孔板孔時(shí)接觸孔壁，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況可以選用其他規(guī)格的孔板，不影響發(fā)明實(shí)現(xiàn)。(11)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，36-38℃，3-8％co2環(huán)境下，凝固martrigel。優(yōu)選在37℃，5％co2環(huán)境下凝固。優(yōu)選地，凝固時(shí)間為10-20min。(12)每孔加入150μl細(xì)胞培養(yǎng)基，優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)基是條件培養(yǎng)基，36-38℃、3-8％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；優(yōu)選在37℃，5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(13)每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)出人肺組織類(lèi)器官或者細(xì)胞群。更換的培養(yǎng)基同步驟12中的細(xì)胞培養(yǎng)基，優(yōu)選為條件培養(yǎng)基。本發(fā)明的上述人肺組織/肺癌組織的培養(yǎng)方法，通過(guò)將肺組織/肺癌組織經(jīng)過(guò)機(jī)械破碎，消化分散，除去紅細(xì)胞，加入適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基最終實(shí)現(xiàn)了體外培養(yǎng)肺細(xì)胞及肺癌細(xì)胞形成類(lèi)器官的目的。而在培養(yǎng)的過(guò)程中，可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的成分，實(shí)現(xiàn)對(duì)于肺組織細(xì)胞的3d培養(yǎng)控制，實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官的構(gòu)建，細(xì)胞增殖的同時(shí)自然分化形成類(lèi)器官組織。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述條件培養(yǎng)基的成分如下：本發(fā)明的肺組織/肺癌組織培養(yǎng)方法選用上述特別準(zhǔn)備的條件培養(yǎng)基，可以更好的應(yīng)用于肺組織/肺癌組織的培養(yǎng)需要，實(shí)現(xiàn)3d培養(yǎng)，收集得到類(lèi)器官，反應(yīng)出肺組織/肺癌組織的活性特點(diǎn)，應(yīng)用于不同的研究。本發(fā)明的另一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中基于基因工程小鼠模型或人源皮下移植瘤模型，在基因?qū)用?、腫瘤微環(huán)境、腫瘤發(fā)展及病理生理等方面與人源腫瘤相差較大，提供一種更接近人源肺癌特征、符合臨床研究需求的肺癌模型。實(shí)現(xiàn)構(gòu)建的動(dòng)物模型具有人源、原位的特點(diǎn)，接近人肺癌組織的生物學(xué)特性，能夠大規(guī)模高一致性的構(gòu)建動(dòng)物模型的方法。為了實(shí)現(xiàn)第二個(gè)發(fā)明目的，提供了以下技術(shù)方案：一種肺癌動(dòng)物模型構(gòu)建方法，包括以下步驟：(1)獲取新鮮的人源肺癌組織，膠原酶消化為單細(xì)胞，與基質(zhì)膠混合后在48孔板中使用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到人肺癌組織類(lèi)器官?？梢允侨缟纤龇谓M織/肺癌組織的類(lèi)器官培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)得到的類(lèi)器官，也可以是其他方法進(jìn)行培養(yǎng)得到的類(lèi)器官(目前尚未有人公布過(guò))。本發(fā)明主要采用上述方法培養(yǎng)的肺組織/肺癌組織類(lèi)器官。(2)將人肺癌組織類(lèi)器官，原位注射到免疫缺陷的小鼠肺組織中，得到人源、原位肺癌的小鼠動(dòng)物模型。優(yōu)選地，通過(guò)注射將人肺癌組織注射到免疫缺陷的小鼠肺組織中，注射方便簡(jiǎn)單，精確度高，能夠有效的一致的將類(lèi)器官輸送到目標(biāo)位點(diǎn)。主要是結(jié)合了上述3d培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的高活性肺癌組織類(lèi)器官，所以經(jīng)過(guò)注射到免疫缺陷的小鼠肺組織中，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的動(dòng)物模型構(gòu)建。其中，對(duì)于肺癌組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)同上述的類(lèi)器官培養(yǎng)技術(shù)。上述的小鼠動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，基于體外3d培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的大量的高度一致性的肺癌類(lèi)器官進(jìn)行原位注射，體外3d培養(yǎng)的肺癌組織細(xì)胞具有較高的活性，在原位注射以后可以分化形成人源、原位肺腫瘤，非常接近人體內(nèi)肺癌發(fā)生情況，可以更好的應(yīng)用于肺癌研究工作。進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟1培養(yǎng)得到的人肺癌組織類(lèi)器官，觀察肺癌類(lèi)器官生長(zhǎng)特征，建立完善的肺癌類(lèi)器官培養(yǎng)體系。進(jìn)一步優(yōu)選地，對(duì)步驟1培養(yǎng)得到的人肺癌組織類(lèi)器官，培養(yǎng)并擴(kuò)增數(shù)量，形成一致性好的人肺癌組織類(lèi)器官材料。進(jìn)一步優(yōu)選地，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌類(lèi)器官后定期采用microct成像技術(shù)觀察小鼠肺部腫瘤形成情況，優(yōu)選為，每3-4周進(jìn)行microct觀察。更優(yōu)選第8周進(jìn)行ct觀測(cè)。進(jìn)一步優(yōu)選地，在免疫缺陷的小鼠接受人肺癌組織類(lèi)器官注射，定期檢測(cè)，待腫瘤形成后，優(yōu)選3個(gè)月后，處死小鼠，收集小鼠肺組織，通過(guò)免疫熒光、h&e染色等手段檢測(cè)腫瘤形成狀況及腫瘤的來(lái)源。進(jìn)一步，試驗(yàn)開(kāi)始之前，向倫理委員會(huì)申請(qǐng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同意書(shū)，本發(fā)明的主要目的是造動(dòng)物模型，在造動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中涉及到動(dòng)物倫理，所以需要向倫理委員會(huì)申請(qǐng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同意書(shū)，為倫理科學(xué)研究的基礎(chǔ)先決條件保障。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明結(jié)合肺組織及肺癌組織細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了適宜的3d培養(yǎng)條件，培養(yǎng)得到的細(xì)胞群分化出類(lèi)器官的形態(tài)，更加接近于人體內(nèi)的肺組織及肺癌組織。本發(fā)明將3d培養(yǎng)得到的人肺癌組織類(lèi)器官原位移植到免疫缺陷的小鼠肺部，構(gòu)建人源原發(fā)肺癌腫瘤動(dòng)物模型，非常接近人類(lèi)肺癌的生物學(xué)特點(diǎn)，具有較高的研究?jī)r(jià)值。并且，由于采用體外3d培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)擴(kuò)增規(guī)模，小鼠動(dòng)物模型的數(shù)量更容易擴(kuò)大，動(dòng)物模型相互之間具有高度的一致性，非常有利于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究需要。附圖說(shuō)明：圖1是原代肺及肺癌類(lèi)器官培養(yǎng)流程示意圖圖2是新鮮肺組織通過(guò)膠原酶解離為單細(xì)胞后第2、6、14天(第3代)在matrixgel中生長(zhǎng)情況圖3是肺正常組織類(lèi)器官h&e染色(上圖：40x；下圖：100x)圖4是新鮮肺癌組織通過(guò)膠原酶解離為單細(xì)胞后第10天在matrixgel中生長(zhǎng)情況圖5是通過(guò)免疫熒光檢測(cè)肺組織類(lèi)器官中nkx2.1、ki67的蛋白表達(dá)情況。圖6是通過(guò)q-pcr檢測(cè)人肺組織類(lèi)器官與肺組織中nkx2.1、sftpc、hopx、ncam、syn等的基因表達(dá)相對(duì)水平；圖7小鼠動(dòng)物模型構(gòu)建流程。圖8是肺癌組織類(lèi)器官原位注射后3個(gè)月，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)小鼠肺組中cd298的蛋白表達(dá)情況。(cd298僅標(biāo)記人源細(xì)胞)圖9是肺癌組織類(lèi)器官原位注射后3個(gè)月，通過(guò)microct檢測(cè)小鼠肺組織成瘤情況，及相應(yīng)肺組織h&e染色。具體實(shí)施方式本發(fā)明中的部分英文縮寫(xiě)解釋如下：dmem：是一種應(yīng)用十分廣泛的培養(yǎng)基，可用于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，購(gòu)買(mǎi)自gibco公司。dmem/f12：是f12培養(yǎng)基和dmem培養(yǎng)基按照1：1結(jié)合，稱(chēng)為dmem/f12培養(yǎng)基。綜合了f12含有較豐富的成分和dmem含有較高濃度養(yǎng)分的優(yōu)點(diǎn)。購(gòu)買(mǎi)自gibco公司。martrigel，從富含胞外基質(zhì)蛋白的ehs小鼠腫瘤中分離出，其主要成分由層粘連蛋白，ⅳ型膠原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等組成，還包含生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等。購(gòu)買(mǎi)自bd公司。b27，即b27補(bǔ)充劑，市售產(chǎn)品，可用于配制培養(yǎng)基。b27補(bǔ)充劑以50倍的液體濃縮液提供，除其它成分外其包含生物素、膽固醇、亞油酸、亞麻酸、黃體酮、腐胺、視黃醇、視黃醇乙酸酯、亞硒酸鈉、三碘甲狀腺原氨酸(t3)、dl-α-生育酚(維生素e)、白蛋白、胰島素以及轉(zhuǎn)鐵蛋白。購(gòu)自lifetechnologies公司。n-acetylcysteine：n-乙酰半胱氨酸，購(gòu)買(mǎi)自sigma公司。egf，表皮生長(zhǎng)因子，市售產(chǎn)品，購(gòu)買(mǎi)自r&d公司。noggin，細(xì)胞生長(zhǎng)蛋白成分，市售產(chǎn)品，購(gòu)買(mǎi)自peprotech公司。r-spondin1，人細(xì)胞生長(zhǎng)編碼蛋白，市售產(chǎn)品，購(gòu)買(mǎi)自peprotech公司。a83-01，tgf-β抑制劑，購(gòu)買(mǎi)自tocrisbioscience公司。fgf10，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，購(gòu)買(mǎi)自peprotech公司。nicotinamide，煙酰胺，購(gòu)買(mǎi)自sigma公司。y-27632*，rock特異性通路阻斷劑。購(gòu)買(mǎi)自abmolebioscience公司。wnt3a，wnt激動(dòng)劑，細(xì)胞中激活tcf/lef-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄的因子，購(gòu)買(mǎi)自peprotech公司。glutamax，市售細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，購(gòu)自：gibco公司。n2，n2補(bǔ)充劑以100倍的液體濃縮液提供，其包含500μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白，500μg/ml牛胰島素，0.63μg/ml黃體酮，1611μg/ml腐胺和0.52μg/ml亞硒酸鈉。購(gòu)自lifetechnologies公司。gastrin，胃泌素，購(gòu)買(mǎi)自sigma公司。tryple，用于解離貼壁哺乳動(dòng)物細(xì)胞的重組消化酶，購(gòu)買(mǎi)自gibco公司。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供對(duì)于培養(yǎng)得到的肺組織和/或肺癌組織的傳代方法。為了提供足夠的肺組織/肺癌組織的類(lèi)器官進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)物模型構(gòu)建，需要建立起傳代穩(wěn)定的肺組織/肺癌組織類(lèi)器官，本發(fā)明的以下方案具有優(yōu)良的穩(wěn)定性，方便準(zhǔn)備大量屬性相同的類(lèi)器官。一種肺組織、肺癌組織體外培養(yǎng)的傳代培養(yǎng)方法，屬于組織或類(lèi)器官的傳代培養(yǎng)，包括以下步驟：(1)將培養(yǎng)2周左右的類(lèi)器官，收集培養(yǎng)皿中的類(lèi)器官。收集類(lèi)器官的重量為實(shí)驗(yàn)計(jì)量方便選用，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要調(diào)整放大實(shí)驗(yàn)的比例關(guān)系。(2)用tryple重懸消化類(lèi)器官，36-38℃消化5-20min；優(yōu)選3mltryple重懸類(lèi)器官，37℃消化15min。(3)加入dmem/f12終止消化；優(yōu)選加入5mldmem/f12終止消化。經(jīng)過(guò)重懸處理，恢復(fù)類(lèi)器官中細(xì)胞的分散性，為擴(kuò)增培植提供原始細(xì)胞。(4)離心去除上清液，優(yōu)選離心過(guò)程為2-8℃，100-300g離心3-20min；最好是200g4℃離心5min。(5)加入martrigel重懸，滴于48孔板孔中。優(yōu)選的加入適量的martrigel試劑進(jìn)行重懸處理。優(yōu)選地，martrigel先在冰上熔化，然后加入到步驟4處理好的細(xì)胞液中。(6)轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在36-39℃，3-8％co2環(huán)境下，凝固martrigel。最好是放置培養(yǎng)皿至37℃(5％co2)環(huán)境中10min，凝固martrigel。使martrigel在體溫溫度完成相轉(zhuǎn)變，形成凝膠樣轉(zhuǎn)化。(7)每孔加入150μl條件培養(yǎng)基，在36-39℃，3-8％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。條件培養(yǎng)基的成分和制備肺組織/肺癌組織過(guò)程中應(yīng)用的條件培養(yǎng)基成分相同/一致。(8)每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)出人肺組織類(lèi)器官或者細(xì)胞群?；谝呀?jīng)培養(yǎng)得到的人肺組織/肺癌組織類(lèi)器官，進(jìn)行分散處理，重新配置成培養(yǎng)的細(xì)胞原料，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，得到相應(yīng)的組織或類(lèi)器官材料，更好的擴(kuò)大人體肺組織及肺癌組織的培養(yǎng)，滿(mǎn)足不同的科學(xué)研究需要。上述傳代培養(yǎng)方法能夠很好的保持肺組織及肺癌組織的活性，傳代培養(yǎng)的類(lèi)器官相互之間的差異小，一致性好，適合各種醫(yī)學(xué)研究應(yīng)用需要。下面結(jié)合試驗(yàn)例及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本
發(fā)明內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1肺組織及肺癌組織類(lèi)器官培養(yǎng)按照如圖1所示的工藝順序進(jìn)行3d培養(yǎng)肺組織/肺癌組織類(lèi)器官。取肺組織及肺癌組織冰上剪碎，加入10ml膠原酶重懸，在gentalmacsctube膠原酶中運(yùn)行humanlung及humantumor程序1。轉(zhuǎn)移至37℃、220rpm搖床消化20min。使用gentalmacs運(yùn)行humanlung及humantumor程序2。轉(zhuǎn)移至37℃、220rpm搖床消化10min，用100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，濾液加入10mldmem/f12終止消化，離心(4℃，200g，5min)，去除上清。取5ml紅細(xì)胞裂解液重懸，冰上裂解紅細(xì)胞5min。在4℃離心機(jī)中，200g離心5min，去除上清液。加入10mldmem/f12重懸，4℃、200離心5min，去除上清液。得到獨(dú)立的肺組織細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，混合martrigel，20,000細(xì)胞每40μl，滴于48孔板孔正中，放置培養(yǎng)皿至37℃(5％co2)10min，凝固martrigel。每孔加入150μl條件培養(yǎng)基，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。取分離后的單細(xì)胞在培養(yǎng)第2、6、14天的時(shí)候，進(jìn)行顯微鏡觀察，如圖2所示。新鮮肺組織單細(xì)胞在matrixgel中的生長(zhǎng)狀態(tài)良好。將制備得到的肺組織及肺癌組織冷凍切片，進(jìn)行nkx2.1、ki67及dapi染色，在顯微鏡下觀察，可見(jiàn)圓形的細(xì)胞團(tuán)，細(xì)胞nkx2.1、ki67染色陽(yáng)性，表明3d體外培養(yǎng)肺組織及肺癌組織具有肺組織/肺癌組織的一般特點(diǎn)。h&e染色可見(jiàn)其為多細(xì)胞組成的中空或?qū)嵭牡挠薪M織極性的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。對(duì)比例關(guān)于培養(yǎng)基普通培養(yǎng)基：采用現(xiàn)有的普通培養(yǎng)基(dmem+10％fbs)3d條件下培養(yǎng)的分散的原代肺組織細(xì)胞，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，結(jié)果肺組織細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞附著在培養(yǎng)皿底部，與一般細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果類(lèi)似，無(wú)法形成有結(jié)構(gòu)的、多細(xì)胞成分的類(lèi)器官。低fgf10濃度(100ng/ml)條件培養(yǎng)基：采用低fgf10濃度(100ng/ml)條件培養(yǎng)基在3d條件下中培養(yǎng)原代肺組織細(xì)胞，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對(duì)比本發(fā)明中的全培養(yǎng)基，低濃度f(wàn)gf10培養(yǎng)條件下肺組織類(lèi)器官形成較緩慢，q-pcr檢測(cè)肺組織相關(guān)基因表達(dá)發(fā)現(xiàn)其中神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)基因水平低于來(lái)源的肺組織細(xì)胞，且限制肺組織類(lèi)器官傳代代數(shù)(短暫傳代2-3代)。無(wú)wnt3a條件培養(yǎng)基：采用不添加wnt3a的條件培養(yǎng)基(對(duì)照本發(fā)明所述的條件培養(yǎng)基進(jìn)行配制)在3d條件下中培養(yǎng)原代肺組織細(xì)胞，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對(duì)比本發(fā)明中的全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)條件下肺組織類(lèi)器官形成較緩慢、形成率低，部分細(xì)胞分化或死亡，對(duì)肺組織類(lèi)器官傳代培養(yǎng)有限制。無(wú)r-spondin1條件培養(yǎng)基：采用不添加r-spondin1的條件培養(yǎng)基在3d條件下中培養(yǎng)原代肺組織細(xì)胞，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對(duì)比本發(fā)明中的全培養(yǎng)基，該培養(yǎng)條件下肺組織類(lèi)器官較難形成，部分細(xì)胞分化貼壁生長(zhǎng)或凋亡；即使部分細(xì)胞培養(yǎng)獲得類(lèi)器官，但仍無(wú)法進(jìn)行傳代實(shí)驗(yàn)。對(duì)比分析了多種不同的培養(yǎng)基的應(yīng)用情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示現(xiàn)有的普通培養(yǎng)基或者缺少某些關(guān)鍵成分的條件培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果顯示條件培養(yǎng)基對(duì)于肺組織的體外3d培養(yǎng)具有較為重要的影響，是控制實(shí)現(xiàn)類(lèi)器官的3d培養(yǎng)以及穩(wěn)定傳代的重要影響因素。最好是能夠針對(duì)性的進(jìn)行準(zhǔn)備，做到精確配制、現(xiàn)配現(xiàn)用。實(shí)施例2肺組織及肺癌組織類(lèi)器官培養(yǎng)取肺組織及肺癌組織冰上剪碎，加入10ml膠原酶重懸，在gentalmacsctube膠原酶中運(yùn)行humanlung及humantumor程序1。轉(zhuǎn)移至37℃、220rpm搖床消化15min。使用gentalmacs運(yùn)行humanlung及humantumor程序2。轉(zhuǎn)移至37℃、220rpm搖床消化10min，用100μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，濾液加入10mldmem/f12終止消化，離心(4℃，200g，6min)，去除上清。取5ml紅細(xì)胞裂解液重懸，冰上裂解紅細(xì)胞6min。在4℃離心機(jī)中，200g離心5min，去除上清液。加入10mldmem/f12重懸，4℃、200離心7min，去除上清液。細(xì)胞計(jì)數(shù)，混合martrigel，20,000細(xì)胞每40μl，滴于64孔板孔正中，放置培養(yǎng)皿至37℃(5％co2)12min，凝固martrigel。每孔加入150μl條件培養(yǎng)基，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。其中，條件培養(yǎng)基配方如下：細(xì)胞因子肺正常組織類(lèi)器官肺癌組織類(lèi)器官b2750x稀釋50x稀釋n-acetylcysteine1mm1mmegf50ng/ml50ng/mlnoggin100ng/ml100ng/mlr-spondin1250ng/ml(或30％條件培養(yǎng)基)250ng/ml(或30％條件培養(yǎng)基)a83-01200nm200nmfgf10500ng/ml500ng/mlnicotinamide10mm10mmy-27632*10um10umwnt3a25ng/ml(或10％條件培養(yǎng)基)25ng/ml(或10％條件培養(yǎng)基)glutamax100x稀釋100x稀釋n2100x稀釋100x稀釋gastrin1nm1nm實(shí)施例3類(lèi)器官傳代收集實(shí)施例2培養(yǎng)皿中的類(lèi)器官，3mltryple重懸類(lèi)器官，37℃消化10min。加入5mldmem/f12終止消化，200g、4℃離心5min，根據(jù)細(xì)胞量加入適量martrigel重懸，滴于48孔板孔正中。放置培養(yǎng)皿至37℃(5％co2)10min，凝固martrigel。然后，每孔加入150μl條件培養(yǎng)基，37℃、5％co2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每間隔2-3天更換一次培養(yǎng)基。得到傳代的人肺組織及肺癌組織傳代類(lèi)器官。試驗(yàn)例1類(lèi)器官傳代相關(guān)實(shí)驗(yàn)1.病理h&e染色：對(duì)培養(yǎng)的肺正常組織培養(yǎng)類(lèi)器官進(jìn)行h&e染色，如圖3所示，肺組織類(lèi)器官為多細(xì)胞組成，空心或?qū)嵭臓?，具有良好的活性特征?.在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的肺癌組織細(xì)胞，如圖4所示，通過(guò)膠原酶解離為單細(xì)胞后肺癌組織細(xì)胞在matrixgel中生長(zhǎng)狀況良好，第10天展示的情況反應(yīng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)非常成功。3.收集類(lèi)器官，滴入事先準(zhǔn)備好的oct包埋劑中，-80℃冰凍后切片(染色常規(guī))，鑒定細(xì)胞來(lái)源及相關(guān)蛋白表達(dá)。免疫熒光染色nkx2.1及ki67陽(yáng)性，證實(shí)組織中的細(xì)胞來(lái)源于人肺組織，且處于分裂增殖活躍狀態(tài)如圖5所示。4.q-pcr：常規(guī)收取類(lèi)器官，提取rna，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行q-pcr，檢測(cè)肺組織相關(guān)基因表達(dá)情況。如圖6所示，結(jié)果顯示培養(yǎng)的類(lèi)器官表達(dá)人肺組織nkx2.1、sftpc、hopx、ncam、syn等相關(guān)基因。實(shí)施例4小鼠肺癌動(dòng)物模型構(gòu)建如圖7所示的流程，將實(shí)施例1培養(yǎng)的人肺癌組織類(lèi)器官原位注射免疫缺陷小鼠左肺組織中，觀察小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)，于第8周采用microct成像技術(shù)觀測(cè)小鼠肺部腫瘤形成情況。3個(gè)月后(根據(jù)microct成像觀察結(jié)果調(diào)整，如圖9所示)收集小鼠肺，通過(guò)免疫熒光及h&e染色等手段檢測(cè)腫瘤的形成及其來(lái)源，如圖8、9所示，小鼠肺部形成了人源、原位的肺癌組織。當(dāng)前第1頁(yè)12