本發(fā)明涉及微流控芯片和生命醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種多通道實(shí)時(shí)熒光定量pcr微流控芯片系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

pcr(polymerasechainreaction)技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過對(duì)檢測(cè)模板進(jìn)行快速高效的擴(kuò)增復(fù)制，達(dá)到基因分析的目的。pcr技術(shù)是分子診斷的重要基礎(chǔ)，作為一種靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、食品安全、檢驗(yàn)檢疫等諸多領(lǐng)域。熒光定量pcr技術(shù)通過對(duì)與擴(kuò)增產(chǎn)物濃度相關(guān)的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)原始檢測(cè)模板濃度的定量分析，一方面既降低了傳統(tǒng)凝膠電泳帶來的假陽性風(fēng)險(xiǎn)，縮短了檢測(cè)總時(shí)間，另一方面也通過定量檢測(cè)，提高了診斷分析的準(zhǔn)確度。

隨著微流控芯片技術(shù)的不斷進(jìn)步，基于微流控芯片的熒光定量pcr系統(tǒng)也日益受到大家的關(guān)注。通過微流控芯片上集成的微型化pcr反應(yīng)腔，可以有效減少pcr反應(yīng)試劑體積，降低檢測(cè)成本，而且，由于微流控pcr芯片能夠獲取快速的升降溫速率，因此，總檢測(cè)時(shí)間也能夠被大大縮短。尤其是，基于微流控芯片的一體化微流體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，集成多個(gè)允許同時(shí)反應(yīng)的pcr反應(yīng)腔，則能夠?qū)崿F(xiàn)并行檢測(cè)，進(jìn)一步提高檢測(cè)效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)了一種基于微流控芯片的pcr擴(kuò)增及檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)已提取的核酸樣本進(jìn)行自動(dòng)快速擴(kuò)增和熒光檢測(cè)，同時(shí)避免交叉污染，并實(shí)現(xiàn)并行檢測(cè)，以節(jié)省核酸樣本的檢測(cè)時(shí)間。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，該系統(tǒng)包括微流控芯片1及配套的檢測(cè)裝置2，通過簡(jiǎn)單的操作實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)相同樣品的多靶標(biāo)，或多個(gè)不同樣品的并行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。

其中：微流控芯片1包括蓋片a、結(jié)構(gòu)片b、底片c、進(jìn)樣柱d和進(jìn)樣對(duì)接模塊e。上蓋片a上設(shè)有注樣孔a1和氣孔a2，結(jié)構(gòu)片b中設(shè)有流體溝道b1、反應(yīng)腔b2和固定臺(tái)b3，各個(gè)反應(yīng)腔b2并列布置在結(jié)構(gòu)片b的中間，流體溝道b1設(shè)置在結(jié)構(gòu)片b的端部，固定臺(tái)b3設(shè)置在結(jié)構(gòu)片b的一側(cè)；蓋片a與底片c分別封閉結(jié)構(gòu)片b的上表面和下表面，使封閉結(jié)構(gòu)片b構(gòu)成一個(gè)封閉式的芯片反應(yīng)器。進(jìn)樣柱d為階梯狀，進(jìn)樣柱d包括前置進(jìn)樣孔d1、進(jìn)樣選擇通道d2、氣孔選擇通道d3、按壓限位臺(tái)d4和密封斜凸d5，氣孔選擇通道d3為l形，前置進(jìn)樣孔d1與進(jìn)樣選擇通道d2連接后組成l形，密封斜凸d5設(shè)置在進(jìn)樣柱d的階梯連接處，按壓限位臺(tái)d4設(shè)置在進(jìn)樣柱d的底部，氣孔選擇通道d3的進(jìn)口和前置進(jìn)樣孔d1設(shè)置在進(jìn)樣柱d的上表面。進(jìn)樣對(duì)接模塊e包括進(jìn)樣柱嵌槽e1、注樣分選通道e2、氣孔分選通道e3、按壓限位槽e4和密封斜面e5，進(jìn)樣柱嵌槽e1設(shè)置在進(jìn)樣對(duì)接模塊e的中間，按壓限位槽e4設(shè)置在進(jìn)樣柱嵌槽e1的底部，氣孔分選通道e3、注樣分選通道e2沿上下位置順次設(shè)置在進(jìn)樣柱嵌槽e1的側(cè)面，密封斜面e5設(shè)置在進(jìn)樣柱嵌槽e1的頂部。

上蓋片a與進(jìn)樣對(duì)接模塊e對(duì)接，使注樣孔a1和氣孔a2分別與注樣分選通道e2和氣孔分選通道e3對(duì)接。進(jìn)樣柱d插在進(jìn)樣對(duì)接模塊e的進(jìn)樣柱嵌槽e1中，通過旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣柱d，使進(jìn)樣選擇通道d2和氣孔選擇通道d3同時(shí)對(duì)接不同的注樣分選通道e2和氣孔分選通道e3，構(gòu)成完整的注樣通道和氣體流通通道。

旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣柱d，達(dá)到分時(shí)一對(duì)多注樣的目的，同時(shí)，當(dāng)進(jìn)樣柱d旋轉(zhuǎn)到適當(dāng)角度時(shí)，按壓限位臺(tái)d4與按壓限位槽e4相互配合，使進(jìn)樣柱d能夠被按壓，按壓后密封斜凸d5和密封斜面e5的緊密配合，起到在反應(yīng)過程中密封微流控芯片1，隔離各個(gè)反應(yīng)腔b2，防止反應(yīng)試劑蒸發(fā)，避免氣溶膠污染和交叉污染的作用。

所述微流控芯片1有多組獨(dú)立的反應(yīng)腔b2，允許檢測(cè)的微流控芯片反應(yīng)腔b2的體積范圍為25μl-100μl，內(nèi)部能預(yù)先保存不同的固態(tài)pcr反應(yīng)試劑，既能夠?qū)蝹€(gè)相同樣品進(jìn)行多靶標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，也能夠?qū)Χ鄠€(gè)不同樣品實(shí)施并行檢測(cè)。反應(yīng)腔b2在檢測(cè)裝置中豎直加熱，使反應(yīng)過程產(chǎn)生的氣泡上浮到反應(yīng)腔頂部，克服氣泡對(duì)熒光檢測(cè)的干擾，確保熒光檢測(cè)的穩(wěn)定性和可靠性。進(jìn)樣對(duì)接模塊e中，對(duì)注樣孔與氣孔實(shí)施一體化統(tǒng)一控制，通過對(duì)不同工作位置的分時(shí)切換操作，實(shí)現(xiàn)微流控芯片中各個(gè)反應(yīng)腔的擴(kuò)增模板樣品注入，同時(shí)，采用旋轉(zhuǎn)和按壓的方式實(shí)現(xiàn)pcr擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，各個(gè)獨(dú)立反應(yīng)腔的完全封閉，避免交叉污染。

檢測(cè)裝置2包括溫度控制和熒光檢測(cè)兩大功能模塊，具體包括半導(dǎo)體制冷片f、導(dǎo)熱鋁板g和光纖h。溫度控制模塊采用四片半導(dǎo)體制冷片f對(duì)微流控芯片實(shí)現(xiàn)雙面加熱，單側(cè)各包括兩片半導(dǎo)體制冷片f，且兩片半導(dǎo)體制冷片f之間留有一個(gè)一定寬帶的間隙。每片半導(dǎo)體制冷片f的加熱面均貼在導(dǎo)熱鋁板g上，導(dǎo)熱鋁板g在間隙處凸起，并在該凸起上設(shè)置多個(gè)光纖斜孔g1，用于插入光纖h。熒光檢測(cè)采用透射方法，一側(cè)光纖激發(fā)，另一側(cè)接收，兩側(cè)的光纖h呈90度夾角。兩側(cè)的光纖h形成多組獨(dú)立的熒光激發(fā)和接收通道，實(shí)現(xiàn)了多通道并行檢測(cè)。

本發(fā)明溫控裝置采用內(nèi)模pid(internalmodelcontrolproportionintegralderivative，imc-pid)控制。

pid型的控制器，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、易于操作及魯棒性強(qiáng)等特點(diǎn)，在過程控制中得到了廣泛應(yīng)用。pid控制系統(tǒng)包括被控對(duì)象，檢測(cè)模塊，主控模塊，pid控制器和執(zhí)行器，五大部分節(jié)節(jié)串聯(lián)構(gòu)成閉合控制回路，檢測(cè)模塊采集被控對(duì)象的被控參數(shù)值傳遞給主控模塊，主控模塊將人為設(shè)定的目標(biāo)參數(shù)值與采集的被控參數(shù)值處理后傳給pid控制器，pid控制器通過控制算法計(jì)算出控制參數(shù)后，通過執(zhí)行器控制被控對(duì)象，使被控參數(shù)朝著目標(biāo)參數(shù)方向變化，達(dá)成控制目的。

pid控制器需要進(jìn)行參數(shù)整定，通過調(diào)整pid控制器參數(shù)，可使上述控制回路的動(dòng)態(tài)特性滿足目標(biāo)要求，達(dá)到理想的控制目標(biāo)。imc-pid簡(jiǎn)化了pid參數(shù)整定方法，使pid參數(shù)整定較傳統(tǒng)方法簡(jiǎn)單，使溫控系統(tǒng)更易獲得理想的升降溫速率與溫度控制精度，進(jìn)一步提高了pcr擴(kuò)增反應(yīng)效率。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1本發(fā)明多通道實(shí)時(shí)熒光定量pcr微流控芯片系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本系統(tǒng)微流控芯片反應(yīng)腔結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3本系統(tǒng)微流控芯片進(jìn)樣柱結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4本系統(tǒng)微流控芯片進(jìn)樣對(duì)接模塊結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5本裝置溫控和熒光檢測(cè)裝置結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6pid控制系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7一個(gè)四通道實(shí)時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)過程實(shí)例；

圖8單變量?jī)?nèi)?？刂瓶驁D；

圖9等效于經(jīng)典反饋控制的單變量?jī)?nèi)?？刂瓶驁D；

圖中：1、微流控芯片，2、溫控和熒光檢測(cè)裝置，a、蓋片，a1、注樣孔，a2、氣孔，b、結(jié)構(gòu)片，b1、流體溝道，b2、反應(yīng)腔，b3、固定臺(tái)，c、底片，d、進(jìn)樣柱，d1、進(jìn)樣孔，d2、進(jìn)樣選擇通道，d3、氣孔選擇通道，d4、按壓限位臺(tái)，d5、密封斜凸，e、進(jìn)樣對(duì)接模塊，e1、進(jìn)樣柱嵌槽，e2、注樣分選通道，e3、氣孔分選通道，e4、按壓限位槽，e5、密封斜面，f、半導(dǎo)體制冷片，g、導(dǎo)熱鋁板，g1、光纖斜孔，h、光纖。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。以下對(duì)至少一個(gè)示例性實(shí)施例的描述實(shí)際上僅僅是說明性的，決不作為對(duì)本發(fā)明及其應(yīng)用或使用的任何限制?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

除非另外具體說明，否則在這些實(shí)施例中闡述的部件和步驟的相對(duì)布置、數(shù)字表達(dá)式和數(shù)值不限制本發(fā)明的范圍。

同時(shí)，應(yīng)當(dāng)明白，為了便于描述，附圖中所示出的各個(gè)部分的尺寸并不是按照實(shí)際的比例關(guān)系繪制的。

對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)、方法和設(shè)備可能不作詳細(xì)討論，但在適當(dāng)情況下，所述技術(shù)、方法和設(shè)備應(yīng)當(dāng)被視為授權(quán)說明書的一部分。

在這里示出和討論的所有示例中，任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制。因此，示例性實(shí)施例的其它示例可以具有不同的值。

應(yīng)注意到：相似的標(biāo)號(hào)和字母在下面的附圖中表示類似項(xiàng)，因此，一旦某一項(xiàng)在一個(gè)附圖中被定義，則在隨后的附圖中不需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步討論。

實(shí)施例1

如圖7所示，本裝置的操作過程為，將微流控芯片1水平放置，將進(jìn)樣柱d插入進(jìn)樣對(duì)接模塊e上的進(jìn)樣柱嵌槽e1，旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣柱d，使進(jìn)樣選擇通道d2、氣孔選擇通道d3旋轉(zhuǎn)到指定位置，與某一通道的注樣分選通道e2和氣孔分選通道e3對(duì)接，使該通道的注樣孔a1和氣孔a2，均與外界環(huán)境導(dǎo)通，此時(shí)，進(jìn)樣柱的側(cè)壁會(huì)將未被選擇通道的注樣分選通道e2和氣孔分選通道e3暫時(shí)封閉，注樣時(shí)液體不會(huì)流入其他通道，這時(shí)使用移液槍向進(jìn)樣柱d上的前置注樣孔d1加入已提取的dna樣本，樣本通過上述結(jié)構(gòu)的注樣通道，分別經(jīng)過進(jìn)樣選擇通道d2、被選擇通道的注樣分選通道e2、注樣孔a1、流體溝道b1，到達(dá)反應(yīng)腔b2，排出的空氣順序經(jīng)過氣孔a2、氣孔分選通道e3和氣孔選擇通道d3后排出。

dna樣本進(jìn)入反應(yīng)腔后，與固化在反應(yīng)腔b2中固化的pcr試劑及引物混合，形成混合后的pcr反應(yīng)液。

當(dāng)某一通道注樣完畢，需對(duì)下一通道進(jìn)行注樣操作時(shí)，只需繼續(xù)旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣柱d選通另一通道，重復(fù)上述操作即可完成一對(duì)多注樣。

當(dāng)所有需注樣的通道均注樣完畢后，需對(duì)微流控芯片1進(jìn)行封閉。旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣柱d，使其底部的按壓限位臺(tái)d4恰好能夠嵌入進(jìn)樣對(duì)接模塊e上的按壓限位槽e5，進(jìn)樣柱d的側(cè)壁恰好將所有通道對(duì)應(yīng)的注樣分選通道e2和氣孔分選通道e3全部封閉，使得進(jìn)行pcr反應(yīng)時(shí)各反應(yīng)通道之間不會(huì)出現(xiàn)交叉污染，此時(shí)，進(jìn)樣柱d可被向下按壓一段距離，按壓后，密封斜凸d5與密封斜面e5緊密結(jié)合，將整個(gè)反應(yīng)體系與外界環(huán)境良好隔絕，避免了反應(yīng)過程中出現(xiàn)試劑蒸發(fā)，導(dǎo)致氣溶膠污染。

當(dāng)注樣操作和封閉操作都完成后，將微流控芯片1豎直插入檢測(cè)裝置2進(jìn)行pcr擴(kuò)增及熒光檢測(cè)。先將微流控芯片1通過固定臺(tái)b3懸掛于外部支架上，實(shí)現(xiàn)豎直方向的懸掛，再通過外部力將檢測(cè)裝置2的兩側(cè)與微流控芯片1壓緊，保證微流控芯片1與兩塊導(dǎo)熱鋁板g貼合緊密，熱傳導(dǎo)良好。

上述操作執(zhí)行完畢后，可通過配套的控制器及顯示器對(duì)檢測(cè)裝置2進(jìn)行控制，進(jìn)行pcr循環(huán)和實(shí)時(shí)定量熒光檢測(cè)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例舉例說明imc-pid控制。

如圖6所示，本裝置溫度控制過程如下：被控對(duì)象為導(dǎo)熱鋁板g，被控參數(shù)為導(dǎo)熱鋁板g的溫度，檢測(cè)模塊為溫度傳感器，主控模塊為單片機(jī)，控制器為imc-pid控制器，執(zhí)行器為半導(dǎo)體制冷片f。溫度傳感器檢測(cè)導(dǎo)熱鋁板g的溫度傳遞給單片機(jī)，單片機(jī)將檢測(cè)到的溫度和預(yù)設(shè)目標(biāo)溫度預(yù)處理后傳給imc-pid控制器，控制器通過控制半導(dǎo)體制冷片f兩端的電壓，控制其加熱功率，達(dá)到對(duì)導(dǎo)熱鋁板g的溫度控制。該過程中，最重要的是imc-pid控制器設(shè)計(jì)。

imc控制屬于一種魯棒控制，它的設(shè)計(jì)思路就是將對(duì)象模型與實(shí)際對(duì)象相并聯(lián)，控制器逼近模型的動(dòng)態(tài)逆，對(duì)于單變量系統(tǒng)，內(nèi)?？刂破魅槟Ｐ妥钚∠辔徊糠值哪?，并通過附加低通濾波器以增強(qiáng)系統(tǒng)的魯棒性。單變量?jī)?nèi)?？刂频慕Y(jié)構(gòu)框圖如圖8所示。

可見，在內(nèi)模控制中，內(nèi)?？刂破鱣imc(s)與內(nèi)部模型gm(s)構(gòu)成一個(gè)內(nèi)環(huán)反饋器，該反饋器等效于經(jīng)典反饋控制中的控制器gc(s)，則單變量?jī)?nèi)?？刂破骺傻刃в谝粋€(gè)經(jīng)典反饋控制器，如圖9所示。

則有：

其中：

內(nèi)?？刂破鱣imc(s)，imc：internalmodelcontrol；內(nèi)部模型gm(s)，m：model；等效的經(jīng)典反饋控制器gc(s)，c：control；s：復(fù)頻域。

這里的gc(s)可以轉(zhuǎn)化成pid控制器形式，按照內(nèi)?？刂破髟O(shè)計(jì)方法，將過程模型gm(s)分解為gm+(s)gm-(s)，其中g(shù)m-(s)包括最小相位部分，gm+(s)包含模型中不穩(wěn)定和純滯后部分。

根據(jù)理想控制，gimc(s)取gm(s)最小相位部分的逆考慮到魯棒性調(diào)節(jié)，再引入低通濾波器f(s)＝1/(λs+1)ⁿ，即令

則有：

此處λ是濾波器時(shí)間常數(shù)，n的選取與模型階數(shù)有關(guān)，目的是保證gimc(s)有理。

設(shè)半導(dǎo)體制冷器是一個(gè)二階加純滯后系統(tǒng)(sopdt)，選擇濾波器階數(shù)n＝1，并將sopdt系統(tǒng)模型的傳遞函數(shù)：

代入gimc(s)的表達(dá)式，此處gm+(s)＝e^-τs，則有：

需要對(duì)式中的純滯后項(xiàng)進(jìn)行近似，根據(jù)一階pade近似法，有為了獲得pid形式的控制器，將上式化簡(jiǎn)后與pid控制器常用的形式：

其中：

比例系數(shù)kp，p：proportion；積分時(shí)間ti，i：integral；微分時(shí)間td，d：differential；濾波器參數(shù)tf，f：filter。

將gc(s)與gpid(s)做系數(shù)對(duì)比，即可得到imc-pid控制器參數(shù)整定公式：

其中，參數(shù)t1、t2和k可通過對(duì)半導(dǎo)體制冷器施加階躍控制信號(hào)，收集其產(chǎn)生的階躍響應(yīng)數(shù)據(jù)，并使用matlab模型辨識(shí)箱進(jìn)行參數(shù)辨識(shí)獲得。τ是控制周期。上述參數(shù)，即比例系數(shù)kp、積分時(shí)間ti、微分時(shí)間td和濾波器參數(shù)tf，均只與唯一可調(diào)節(jié)量λ有關(guān)，通過實(shí)驗(yàn)測(cè)試，適當(dāng)?shù)倪x取λ，使系統(tǒng)兼顧魯棒性和控制性能，找到升降溫速度與超調(diào)量均比較理想的控制點(diǎn)，即可實(shí)現(xiàn)高速、準(zhǔn)確溫控，避免因溫度引起的非特異性擴(kuò)增，縮短pcr擴(kuò)增檢測(cè)耗時(shí)。

本發(fā)明涉及一種多通道實(shí)時(shí)熒光定量pcr微流控芯片系統(tǒng)。采用了一種便捷的操作模式，通過微流控芯片與裝置之間的相互配合，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)相同樣品的多靶標(biāo)，或多個(gè)不同樣品的并行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)。

上述附圖及具體實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，本發(fā)明并不局限于此。在由本發(fā)明權(quán)利要求所限定的發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行細(xì)微的改變均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。如微流控芯片的材質(zhì)、形狀及尺寸，溫度控制和熒光檢測(cè)裝置的加熱方法和熒光檢測(cè)方法等。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解實(shí)現(xiàn)上述實(shí)施例的全部或部分步驟可以通過硬件來完成，也可以通過程序來指令相關(guān)的硬件完成，所述的程序可以存儲(chǔ)于一種計(jì)算機(jī)可讀存儲(chǔ)介質(zhì)中，上述提到的存儲(chǔ)介質(zhì)可以是只讀存儲(chǔ)器，磁盤或光盤等。

本發(fā)明的描述是為了示例和描述起見而給出的，而并不是無遺漏的或者將本發(fā)明限于所公開的形式。很多修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯然的。選擇和描述實(shí)施例是為了更好說明本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，并且使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明從而設(shè)計(jì)適于特定用途的帶有各種修改的各種實(shí)施例。