本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及苤藍(lán)基因及其在培育紫色微型番茄中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于富含番茄紅素和β-胡蘿卜素等活性物質(zhì)，因而具有抗氧化和預(yù)防癌癥功能的番茄是一種廣受歡迎的世界性蔬菜。原產(chǎn)南美洲的番茄大約在16世紀(jì)起就開始成為一種全球性的重要作物。從拉丁美洲引種到歐洲的番茄最早是作為觀賞植物來栽培的。經(jīng)過全世界育種工作者長(zhǎng)期對(duì)番茄種質(zhì)的發(fā)掘與創(chuàng)制，番茄的種質(zhì)資源得到了極大地豐富。作為一種番茄突變體,微型番茄(micro-tom)保留了普通番茄的模式植物特征,且植株矮小、生命周期短,有利于節(jié)省室內(nèi)空間、水費(fèi)需要量小,因而更適合用于觀賞植物的培育。目前用于觀賞植物培育的微型番茄葉片和果實(shí)色彩較為單一，從而限制了微型番茄作為觀賞花卉的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。傳統(tǒng)育種一般通過雜交來培育新品種，而該方法周期長(zhǎng)、耗資多、育種效果并不理想且目標(biāo)難以預(yù)期。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上內(nèi)容，本發(fā)明獨(dú)辟蹊徑，通過大量、繁雜的試錯(cuò)和篩選工作，選用來自苤藍(lán)的特定基因，成功將其導(dǎo)入微型番茄中，意外發(fā)現(xiàn)，外源基因在微型番茄中成功表達(dá)，進(jìn)而得到了紫色微型番茄。

本發(fā)明的目的之一在于提供兩個(gè)苤藍(lán)基因bopap2和bott8；苤藍(lán)bopap2基因，核苷酸序列如seqidno.3所示；苤藍(lán)bott8基因，核苷酸序列如seqidno.6所示。

本發(fā)明的目的之二在于提供含苤藍(lán)基因bopap2和/或bott8的重組載體，如含有兩個(gè)苤藍(lán)基因bopap2和bott8的基因共表達(dá)載體；優(yōu)選的，所述的基因共表達(dá)載體是以pbin121載體為骨架載體，在多克隆酶切位點(diǎn)處插入依次連接的camv35s啟動(dòng)子、bopap2開放閱讀框、nos終止子、nos終止子、bott8開放閱讀框和camv35s啟動(dòng)子而構(gòu)建成的。

所述基因共表達(dá)載體的制備方法，作為示例，可包括如下步驟：

a.以含有seqidno.3的bopap2基因的重組質(zhì)粒為模板，以seqidno.7和seqidno.8為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用saci和xbai進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的pbi121載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bopap2；

b.以含有seqidno.6的bott8基因的重組質(zhì)粒為模板，以seqidno.9和seqidno.10為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用saci和xbai雙酶切，再與經(jīng)同樣雙酶切的pbi121載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bott8；

c.以重組質(zhì)粒pbi121::bopap2為模板，以seqidno.11和seqidno.12為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用ecori酶切，再與經(jīng)同樣酶切的pbi121::bott8載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bott8::bopap2，即為雙基因表達(dá)載體。

所述含seqidno.3的重組質(zhì)粒，作為示例，可由如下方法制備：提取苤藍(lán)幼葉總rna，再以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板，以seqidno.1和seqidno.2為引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd-t載體連接，得含seqidno.3的重組質(zhì)粒。

所述含seqidno.6的重組質(zhì)粒，作為示例，可由如下方法制備：提取苤藍(lán)幼葉總rna，再以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板，以seqidno.4和seqidno.5為引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與pmd-t載體連接，得含seqidno.6的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的目的之三在于提供含有所述重組載體(優(yōu)選為基因共表達(dá)載體)的微生物轉(zhuǎn)化體，其可通過用相應(yīng)的重組質(zhì)粒(如pbi121::bott8::bopap2)轉(zhuǎn)化受體制備得到，受體可為農(nóng)桿菌如農(nóng)桿菌lba4404，作為所述微生物轉(zhuǎn)化體的制備示例，其制備方法包括如下步驟：

a、通過低溫cacl2處理的方法制備lba4404感受態(tài)細(xì)胞

b、將重組質(zhì)粒pbi121::bott8::bopap2與lba4404感受態(tài)細(xì)胞混勻

c、通過凍融法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞

d、將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物涂布在含抗生素(如利福平+鏈霉素+卡那霉素)的yeb固體平板培養(yǎng)基

e、28℃倒置培養(yǎng)直至形成大小合適的單菌落

f、挑取多個(gè)單菌落，用含有抗生素(如利福平+鏈霉素+卡那霉素)的yeb液體培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)

g、提取震蕩培養(yǎng)得到的菌株的質(zhì)粒，酶切提取的質(zhì)粒，鑒定得到含有pbi121::bott8::bopap2重組質(zhì)粒的工程菌株。

本發(fā)明的目的之四在于提供所述的bopap2和/或所述的bott8、含其的所述重組載體、或含其的所述微生物轉(zhuǎn)化體用于下述至少一種用途：

1)上調(diào)微型番茄基因sldfr和/或slans的表達(dá)水平；

2)提高微型番茄中花青素和/或花色苷的含量；

3)培育紫色微型番茄品種。

所述bopap2或所述bott8，均通過兩基因彼此聯(lián)用的形式，實(shí)現(xiàn)上述用途，比如bopap2與bott8形成前述的重組載體，或進(jìn)一步形成前述的微生物轉(zhuǎn)化體。

所述上調(diào)sldfr和/或slans的表達(dá)水平，和/或，提高花青素和/或花色苷的含量，可表現(xiàn)在微型番茄的下述至少一處部位：幼葉、成熟葉、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及莖。

所述紫色微型番茄品種，含義如本領(lǐng)域常規(guī)理解，如相比導(dǎo)入所述苤藍(lán)基因前的微型番茄，在下述至少一處部位表現(xiàn)地更紫：幼葉、成熟葉、幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及莖。也可通過前述表達(dá)水平上調(diào)(sldfr等)和/或含量提高(花青素等)來確證獲得本品種。作為示例，其最典型特征的是：果實(shí)為紫色。

本發(fā)明還提供了培育所述紫色微型番茄的方法，包括將所述的苤藍(lán)基因bott8和權(quán)利要求2所述的苤藍(lán)基因bopap2導(dǎo)入微型番茄(常規(guī)野生型即可)中共表達(dá)；所述共表達(dá)的實(shí)現(xiàn)方式可為苤藍(lán)基因bopap2與bott8形成前述的重組載體(如基因共表達(dá)載體)，或形成前述的微生物轉(zhuǎn)化體；

導(dǎo)入微型番茄的方法，可包括如下步驟：

a、制備含有微生物轉(zhuǎn)化體的懸浮液

b、切取番茄子葉獲得番茄外植體

c、將經(jīng)過預(yù)處理的番茄外植體浸泡于所述微生物轉(zhuǎn)化體的懸浮液中進(jìn)行侵染

d、將侵染后的外植體在ms固體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)和篩選，直至脫分化長(zhǎng)出具有卡那霉素抗性的再生芽

e、將所述具有卡那霉素抗性的再生芽切下，轉(zhuǎn)入含有卡那霉素的生根培養(yǎng)基中，得到能夠生根的陽性株系

f、對(duì)陽性株系進(jìn)行pcr鑒定篩選，得到轉(zhuǎn)基因的紫色微型番茄株系。

作為導(dǎo)入微型番茄的方法的更具體示例，本發(fā)明的方法包括如下步驟：

a、制備含有pbi121::bott8::bopap2重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌工程菌懸浮液

b、制備無菌的微型番茄種子并培養(yǎng)于ms/2固體培養(yǎng)基中(ms/2含義即本領(lǐng)域常稱的培養(yǎng)基成分中“大量元素減半,其余組分用量不變”)

c、切取對(duì)應(yīng)的番茄子葉獲得番茄外植體

d、用含有激素(如激動(dòng)素和2,4-d的復(fù)合激素)的ms液體培養(yǎng)基浸泡處理番茄外植體1h

e、吸干殘留液體，將外植體放于含激素(如吲哚乙酸+玉米素的復(fù)合激素)的ms固體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)1d

f、將經(jīng)過預(yù)處理的外植體浸泡于農(nóng)桿菌工程菌懸浮液中10min進(jìn)行侵染

g、吸干殘留菌液，將外植體放于原來的ms固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d

h、將外植體插入含有多種抗生素和激素的ms固體篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)

i、將長(zhǎng)出的抗性愈傷組織繼代培養(yǎng)，直至脫分化長(zhǎng)出具有卡那霉素抗性的再生芽

j、將一定長(zhǎng)度的再生芽切下轉(zhuǎn)入含有卡那霉素的生根培養(yǎng)基中，能夠生根的株系即為陽性株系

k、對(duì)陽性株系進(jìn)行pcr鑒定篩選，得到轉(zhuǎn)基因番茄株系。

鑒定可通過檢測(cè)pbi121::bott8::bopap2載體中的報(bào)告基因nptii或番茄內(nèi)參基因slcac的表達(dá)情況確定。

另需說明的是，本發(fā)明所涉質(zhì)?；蛭⑸镙d體，均可購買得到，也可自制。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明獨(dú)辟蹊徑，通過大量、繁雜的試錯(cuò)和篩選，最終選用了分離獲得的兩個(gè)來自苤藍(lán)基因的bopap2和bott8，利用這兩個(gè)基因開放閱讀框構(gòu)建了雙基因共表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入微型番茄(micro-tom)，經(jīng)多水平驗(yàn)證確認(rèn)，所得的轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中外源基因bopap2和bott8均得到顯著表達(dá)，整個(gè)植物都呈現(xiàn)花青素的顯著積累，成功獲得了富含花青素的轉(zhuǎn)基因微型番茄新品種，這對(duì)于高等植物基因工程領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，是非常難以預(yù)料的；

而與傳統(tǒng)育種方法相比，本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，定向且高效地激活了轉(zhuǎn)基因番茄植株中花青素的合成，為微型番茄的觀賞品種改良做出了有益的探索，也為其他觀賞植物的育種提供了參考和借鑒，所得的富含花青素的彩色微型番茄具有良好的市場(chǎng)前景和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)路線圖和優(yōu)點(diǎn)更加明晰，以下內(nèi)容將結(jié)合附圖以對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的細(xì)致描述，其中：

圖1為重組質(zhì)粒pbi121::bott8::bopap2構(gòu)建示意圖。

圖2為苤藍(lán)bott8和bopap2基因pcr產(chǎn)物凝膠電泳分析圖，其中a為bopap2基因全長(zhǎng)的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；b為bott8基因全長(zhǎng)的瓊脂糖凝膠電泳分析圖；dna分子量標(biāo)準(zhǔn)(marker)如右側(cè)泳道所示。

圖3為重組質(zhì)粒酶切產(chǎn)物凝膠電泳分析圖，其中a為重組質(zhì)粒pbi121::bopap2雙酶切(saci和xbai)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中泳道1表示marker，泳道2表示酶切產(chǎn)物；b為重組質(zhì)粒pbi121::bott8雙酶切(saci和xbai)產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析圖，其中泳道1表示酶切產(chǎn)物，泳道2表示未酶切的質(zhì)粒，泳道3表示marker。

圖4為rt-qpcr檢測(cè)nptii報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因番茄植株中的表達(dá)情況(縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)的wt表示非轉(zhuǎn)基因番茄，t1、t2、t3、t4和t5為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因番茄株系，slcac為內(nèi)參基因)。

圖5為外源基因bott8和bopap2在轉(zhuǎn)基因微型番茄陽性植株中的表達(dá)情況分析(縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)的wt表示非轉(zhuǎn)基因番茄，t1、t2、t3、t4和t5為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因番茄株系，slcac為內(nèi)參基因)；其中a為bopap2在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達(dá)情況分析；b為bott8在轉(zhuǎn)基因番茄陽性植株中的表達(dá)情況分析。

圖6為野生微型番茄和轉(zhuǎn)基因微型番茄陽性植株表性分析。a表示轉(zhuǎn)基因微型番茄植株發(fā)育后期果實(shí)表型，其中未成熟的果實(shí)呈現(xiàn)紫色，而成熟果實(shí)呈現(xiàn)為黑紫色；b表示野生型微型番茄植株發(fā)育后期果實(shí)表型，其中未成熟的果實(shí)呈現(xiàn)青綠色，而成熟果實(shí)呈現(xiàn)為橙紅色；c為轉(zhuǎn)基因微型番茄植株幼苗期表型；d為野生型微型番茄植株幼苗期表型；e表示不同發(fā)育時(shí)期花中的花青素積累情況，上半部分表示的為野生型材料，上半部分表示的為轉(zhuǎn)基因材料；f表示果實(shí)成熟期果皮中的花青素積累情況，上半部分表示的為野生型材料，上半部分表示的為轉(zhuǎn)基因材料。

圖7為花青素在轉(zhuǎn)基因微型番茄不同株系的果皮中的合成情況分析(縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá)水平，橫坐標(biāo)的wt表示wt為非轉(zhuǎn)基因番茄，t1、t2、t3、t4和t5為獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因番茄株系)。其中a為不同轉(zhuǎn)基因番茄株系的果皮中花青素總含量的分析測(cè)定；b為sldfr在不同轉(zhuǎn)基因番茄株系的果皮中的表達(dá)情況分析；c為slans在不同轉(zhuǎn)基因番茄株系的果皮中的表達(dá)情況分析。

具體實(shí)施方式

以下內(nèi)容為結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行的細(xì)致描述。優(yōu)選實(shí)施例中若并未注明實(shí)驗(yàn)的方法和具體條件，通常按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版，j.薩姆布魯克(sambrook.j.)，d.w.拉塞爾著；黃培堂等譯科學(xué)出版社，2008年)中所述的條件或者制造商所推薦的條件。

本發(fā)明中使用的番茄品種為微型番茄(micro-tom)。pmd-t載體為寶生物(takara)公司產(chǎn)品，pbi121載體和根癌農(nóng)桿菌lba4404為本實(shí)驗(yàn)室保存；rnaiso、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、taqdna聚合酶、primestarmaxdna聚合酶均為大連寶生物公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶為thermofisher公司產(chǎn)品；t4dna連接酶位promega公司產(chǎn)品；dna提取試劑盒與pcr產(chǎn)物純化試劑盒為omega公司產(chǎn)品。

一、苤藍(lán)基因bopap2全長(zhǎng)序列克隆

提取紫苤藍(lán)幼葉總rna，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以oligodt為引物合成cdna。然后根據(jù)brassicadatabase數(shù)據(jù)庫中甘藍(lán)基因pap2序列，設(shè)計(jì)克隆引物bopap2c-f和bopap2c-r，引物序列如下：

bopap2c-f：5'-gacgtctagacttatattatatatcgctgg-3'(seqidno.1)；

bopap2c-r：5'-tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca-3'(seqidno.2)；

以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板，以bopap2c-f和bopap2c-r為引物，pcr擴(kuò)增苤藍(lán)bopap2基因全長(zhǎng)，pcr反應(yīng)體系為：5×pcrbuffer5μl、dntps(10μmeach)1.0μl、bopap2c-f和bopap2c-r(10μm)引物各1.0μl、模板(cdna)1.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o15.5μl、共25μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，62℃退火15秒，72℃延伸30秒，共30個(gè)循環(huán)。pcr反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析拍照，如圖2a所示。而后將產(chǎn)物采用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(omega)回收純化，將純化的dna產(chǎn)物與pmd-t載體連接，獲得重組質(zhì)粒pmd-t::bopap2。將上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得836bp的苤藍(lán)bopap2全長(zhǎng)序列(seqidno.3)。

二、苤藍(lán)基因bott8全長(zhǎng)序列克隆

提取紫苤藍(lán)幼葉總rna，然后根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以oligodt為引物合成cdna。然后根據(jù)brassicadatabase數(shù)據(jù)庫中甘藍(lán)基因tt8序列，設(shè)計(jì)克隆引物bott8c-f和bott8c-r，引物序列如下：

bott8c-f：5'-cgtctctagaatggatgaat-3'(seqidno.4)；

bott8c-r：5'-atcagagctcttagaatctaggaa-3'(seqidno.5)；

以反轉(zhuǎn)錄生成的cdna為模板，以bott8c-f和bott8c-r為引物，pcr擴(kuò)增苤藍(lán)bott8基因全長(zhǎng)序列，pcr反應(yīng)體系如下：5×pcrbuffer5μl、dntps(10μmeach)1.0μl、bott8c-f和bott8-r(10μm)引物各1.0μl、模板(cdna)1.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o15.5μl、共25μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，54℃退火15秒，72℃延伸50秒，共30個(gè)循環(huán)。pcr反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析成像，結(jié)果如圖2b所示。而后將pcr產(chǎn)物用pcr產(chǎn)物純化試劑盒(omega)回收純化，將純化的dna片段與pmd-t載體連接，獲得重組質(zhì)粒pmd-t::bott8。將上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，獲得1600bp的苤藍(lán)bott8全長(zhǎng)序列(seqidno.6)。

三、構(gòu)建bott8和bopap2基因的共表達(dá)載體

根據(jù)pbi121載體的多克隆位點(diǎn)和獲得的bott8和bopap2基因序列，設(shè)計(jì)構(gòu)建含bott8和bopap2基因的共表達(dá)載體引物，具體序列如下：

bomyb2o-f：5'-gacgtctagacttatattatatatcgctgg-3'(seqidno.7)，下劃線標(biāo)注部分為xbai酶切位點(diǎn)。

bomyb2o-r：5'-tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca-3'(seqidno.8)，下劃線標(biāo)注部分為saci酶切位點(diǎn)。

bott8o-f：5'-cgtctctagaatggatgaattaagtattatacc-3'(seqidno.9)，下劃線標(biāo)注部分為xbai酶切位點(diǎn)。

bott8o-r：5'-atcagagctcttagaatctaggaactagagttt-3'(seqidno.10)，下劃線標(biāo)注部分為saci酶切位點(diǎn)。

orf-f：5'-cggaattcgcaggtccccagattagc-3'(seqidno.11)，下劃線標(biāo)注部分為ecori酶切位點(diǎn)。

orf-r：5'-acgccagggttttcccagtcacga-3'(seqidno.12)。

以pmd-t::bopap2重組質(zhì)粒為模板，以bomyb2o-f和bomyb2o-r為引物，配置pcr反應(yīng)體系如下：5×pcrbuffer10μl、dntps(10μmeach)2.0μl、bott8c-f和bott8-r(10μm)引物各2.0μl、模板(cdna)2.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o31.5μl、共50μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增pcr產(chǎn)物為兩側(cè)分別帶有xbai和saci酶切位點(diǎn)的bopap2全長(zhǎng)序列；試劑盒純化后用saci和xbai酶切，再與經(jīng)過同樣酶切處理的pbi121載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bopap2，將上述質(zhì)粒進(jìn)行saci和xbai酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖3a。酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

以pmd-t::bott8重組質(zhì)粒為模板，以bott8o-f和bott8o-r為引物，配置pcr反應(yīng)體系如下：5×pcrbuffer10μl、dntps(10μmeach)2.0μl、bott8o-f和bott8o-r(10μm)引物各2.0μl、模板(cdna)2.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o31.5μl、共50μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，66℃退火15秒，72℃延伸60秒，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增pcr產(chǎn)物為兩側(cè)分別帶有xbai和saci酶切位點(diǎn)的bott8全長(zhǎng)序列；試劑盒純化后用saci和xbai酶切，再與經(jīng)過同樣酶切處理的pbi121載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bott8，將上述質(zhì)粒進(jìn)行saci和xbai酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖3b。酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

以pbi121::bopap2重組質(zhì)粒為模板，以orf-f和orf-r為引物，配置pcr反應(yīng)體系如下：5×pcrbuffer10μl、dntps(10μmeach)2.0μl、orf-f和orf-r(10μm)引物各2.0μl、模板(cdna)2.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o31.5μl、共50μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸120秒，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增pcr產(chǎn)物為兩側(cè)分別帶有xbai和saci酶切位點(diǎn)的bopap2全長(zhǎng)序列；試劑盒純化后用saci和xbai酶切，再與經(jīng)過同樣酶切處理的pbi121載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bopap2，將上述質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

以pmd-t::bopap2重組質(zhì)粒為模板，以bomyb2o-f和bomyb2o-r為引物，配置pcr反應(yīng)體系如下：5×pcrbuffer10μl、dntps(10μmeach)2.0μl、bott8c-f和bott8-r(10μm)引物各2.0μl、模板(cdna)2.0μl、primestarmaxdna聚合酶0.5μl，ddh2o31.5μl、共50μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為：然后98℃變性15秒，64℃退火15秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增pcr產(chǎn)物為包含35s啟動(dòng)子，bopap2全長(zhǎng)序列和nos終止子的序列，在pcr產(chǎn)物5’端和靠近3’端的內(nèi)側(cè)帶有ecori內(nèi)切酶點(diǎn)；試劑盒純化后用ecori酶切，再與經(jīng)過同樣酶切處理的pbi121::bott8載體連接，獲得重組質(zhì)粒pbi121::bott8::bopap2，該載體的構(gòu)建路線圖見圖1。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

四、含苤藍(lán)bott8和bopap2基因的共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

將取-80℃保存的根癌農(nóng)桿菌lba4404接種于含有1.5％(w/w)瓊脂、50mg/l利福平和500mg/l鏈霉素的lb固體培養(yǎng)基上，28±0.5℃黑暗條件下培養(yǎng)2-3天直至長(zhǎng)出單菌落；挑取農(nóng)桿菌lba4404單菌落接種于20mlyeb液體培養(yǎng)基中(50mg/l利福平和500mg/l鏈霉素)，200rpm28℃振蕩培養(yǎng)1.5天；取1ml接種于50mlyeb液體培養(yǎng)基中(50mg/l利福平和500mg/l鏈霉素)，在200rpm轉(zhuǎn)速和28℃條件下振蕩培養(yǎng)至od600介于0.5-0.8之間。將菌液轉(zhuǎn)入無菌離心管，5000rpm轉(zhuǎn)速4℃條件下離心10min后去上清液。向離心管加入10ml預(yù)先4℃冷卻的cacl2溶液(0.1m/l)，輕柔懸浮細(xì)胞沉淀后冰上放置10min。4℃條件下5000rpm離心5min，除去上清后加入2ml預(yù)冷的cacl2溶液(含15％甘油)。輕輕懸浮菌體后將農(nóng)桿菌懸浮液分裝于無菌eppendorf管中，每管100μl液氮速凍后儲(chǔ)存于-80℃。取1μg左右的重組質(zhì)粒pbi121::bott8::bopap2加入到100ml的lba440105感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻后依次冰浴30min，-80℃放置5min，37℃水浴5min，冰浴2min，最后加入700μl的yeb液體培養(yǎng)基在28℃，200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u培2小時(shí)后涂在含50mg/l利福平，500mg/l鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb平板培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)直至形成單菌落。挑取2-3個(gè)單菌落，用含有50μg/ml利福平、500μg/ml鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基，在28±1℃和200rpm條件下震蕩培養(yǎng)1.5天至od600為2.0，提取重組質(zhì)粒，用ecori進(jìn)行酶切鑒定，陽性克隆即為pbi121::bott8::bopap2農(nóng)桿菌工程菌株，將制備好的15％甘油工程菌凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

五、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的pbi121::bott8::bopap2表達(dá)載體轉(zhuǎn)化微型番茄

將含有pbi121::bott8::bopap2的農(nóng)桿菌工程菌株接種于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5％的瓊脂、50μg/ml利福平、500μg/ml鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb固體培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下活化2-3天直至形成單菌落，接種單菌落于20ml含有50μg/ml利福平、500μg/ml鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基中，在28±1℃、200rpm條件下培養(yǎng)1.5天，取1ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml含有50μg/ml利福平、500μg/ml鏈霉素和50μg/ml卡那霉素的yeb液體培養(yǎng)基中，在28±1℃、200rpm條件下擴(kuò)大培養(yǎng)至od600介于1.5-2.0，然后在28±1℃和5000rpm條件下離心菌液，棄上清后用新鮮的yeb液體培養(yǎng)基洗滌菌體沉淀，然后在28±1℃和3000rpm條件下離心菌液，棄上清后用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％的蔗糖、ph為5.8的ms溶液30ml重懸菌體，制得農(nóng)桿菌工程菌懸浮液。

用70％的酒精浸泡微型番茄種子30秒，無菌水沖洗3次；在用有效氯濃度為1％的naclo水溶液浸泡種子10min，無菌水沖洗6次；無菌水浸泡種子24h后播種在ms/2固體培養(yǎng)基上，在參數(shù)設(shè)置為26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至番茄子葉展平，切取對(duì)應(yīng)的番茄子葉即得到番茄外植體。將番茄外植體在ms液體培養(yǎng)基(含20μg/ml激動(dòng)素、5μg/ml2,4-d)中浸泡1h，用濾紙吸干殘留液體后放置于含3％蔗糖、0.8％瓊脂、1μg/ml吲哚乙酸、1.75μg/ml玉米素、ph為5.8的ms固體培養(yǎng)基中，26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)預(yù)培養(yǎng)1天后置于農(nóng)桿菌工程菌液中浸染10分鐘，然后放回原來的ms固體培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下暗光培養(yǎng)48小時(shí)，再轉(zhuǎn)入含有3％蔗糖、0.8％瓊脂、1.0μg/ml吲哚乙酸、1.75μg/ml玉米素、500μg/ml羧芐青霉素和100μg/ml卡那霉素、ph為5.8的ms固體培養(yǎng)基中，在26℃(16h光照強(qiáng)度5000-8000lx)/20℃(8h黑暗)條件下培養(yǎng)至形成愈傷組織與再生芽；將長(zhǎng)3-4cm的再生芽切下接入含有3％蔗糖、0.8％瓊脂、500μg/ml羧芐青霉素和50μg/ml卡那霉素、ph為5.8的ms固體培養(yǎng)基中，在26℃(16h光照強(qiáng)度5000-8000lx)/20℃(8h黑暗)條件下培養(yǎng)至生根，即為得到的轉(zhuǎn)基因微型番茄植株(t0代),繁殖得到下一代植株t1-t5。

六、轉(zhuǎn)基因微型番茄陽性株系的鑒定

1.rt-qpcr技術(shù)檢測(cè)nptii報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因番茄株系中的表達(dá)情況

根據(jù)載體pbi121::bott8::bopap2中的nptii基因和番茄內(nèi)參基因slcac序列，設(shè)計(jì)如下引物：

nptii-f：5'-gacaatcggctgctctga-3'(seqidno.13)；

nptii-r：5'-aactccagcatgagatcc-3'(seqidno.14)。

qcac-f：5'-cctccgttgtgatgtaactgg-3'(seqidno.19)；

qcac-r：5'-attggtggaaagtaacatcatcg-3'(seqidno.20)。

分別提取野生番茄和不同轉(zhuǎn)基因番茄株系果實(shí)的總rna，以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板、以nptii-f和nptii-r為引物進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)分析。配置pcr反應(yīng)體系如下：2×pcrmix10μl、nptii-f和nptii-r(10μm)引物各1.0μl、模板(cdna)1.0μl、ddh2o7μl，共20μl。pcr反應(yīng)程序設(shè)置為,然后95℃變性5分鐘，然后95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒，共40個(gè)循環(huán)，緊接著pcr產(chǎn)物在60-95℃區(qū)間內(nèi)溶解曲線的繪制。最終的pcr產(chǎn)物通過測(cè)序驗(yàn)證的確為nptii基因序列，再以slcac為內(nèi)參基因計(jì)算分析nptii基因在野生番茄和不同轉(zhuǎn)基因番茄株系果實(shí)的表達(dá)量。從圖4中可以看出，nptii基因在t1-t5的株系中大量表達(dá)，野生型番茄中未見明顯的表達(dá)，可見t1-t5確實(shí)為轉(zhuǎn)基因陽性株系。

2.rt-qpcr檢測(cè)bott8和bopap2基因在轉(zhuǎn)基因微型番茄陽性株系中的表達(dá)

根據(jù)苤藍(lán)bott8和bopap2基因序列序列，設(shè)計(jì)如下引物：

qbopap2-f：5'-ttccttgctcttataccacacc-3'(seqidno.15)；

qbopap2-r：5'-gtcagcttctgccatgccatta-3'(seqidno.16)；

qbott8-f：5'-cgtgcttgatggcgttt-3'(seqidno.17)；

qbott8-r：5'-acttcgggtggttgtgga-3'(seqidno.18)。

分別提取野生番茄和不同轉(zhuǎn)基因番茄株系果實(shí)的總rna，以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板、分別以qbopap2-f和qbopap2-r，qbott8-f和qbott8-r，qcac-f和qcac-r為引物進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)分析。結(jié)果如圖5所示，在轉(zhuǎn)基因微型番茄果實(shí)中，qbopap2和qbott8基因都呈現(xiàn)高水平表達(dá)，而在野生材料中未見明顯表達(dá)。這些結(jié)果說明外源基因qbopap2和qbott8成功導(dǎo)入微型番茄基因組中并獲得高效表達(dá)。

六、轉(zhuǎn)基因微型番茄表型分析

將篩選鑒定的轉(zhuǎn)基因微型番茄陽性株系和非轉(zhuǎn)基因微型番茄在溫室中按照一致的條件培養(yǎng)，主要參數(shù)設(shè)置為：26℃(16h光照)/20℃(8h黑暗)，分析轉(zhuǎn)基因微型番茄與非轉(zhuǎn)基因微型番茄植株中花青素的積累與相關(guān)的基因表達(dá)情況，結(jié)果圖6和圖7所示。

由圖6可知，花青素在轉(zhuǎn)基因微型番茄發(fā)育的幼苗期開始，就有顯著的積累(圖6c)?；ㄇ嗨貜V泛分布于包括幼葉、成熟葉，幼果、成熟果、花瓣、雄蕊以及莖等各個(gè)組織(圖6a)。與此相反，非轉(zhuǎn)基因微型番茄植株在整個(gè)發(fā)育史中均未觀察到明顯的花青素著色(圖6b和d)。此外，轉(zhuǎn)基因微型番茄果實(shí)的隨著發(fā)育的進(jìn)程逐漸由藍(lán)紫色漸變?yōu)楹谧仙?，在色彩上呈現(xiàn)出更靚麗的觀賞價(jià)值(圖6a和f)。值得一提的是，轉(zhuǎn)基因微型番茄的花瓣著色也會(huì)隨著發(fā)育進(jìn)程不斷變化(圖6f)。由此可知，紫色的轉(zhuǎn)基因微型番茄的培育有效地豐富了觀賞番茄的種質(zhì)資源。由于紫色的植株與果實(shí)具有更好的觀賞價(jià)值，從而轉(zhuǎn)基因微型番茄會(huì)具有更好的市場(chǎng)應(yīng)用前景。

為了更加細(xì)致的描述轉(zhuǎn)基因微型番茄在花青素著色上的特點(diǎn)，我們對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因微型番茄成熟果皮的花青素總量和相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了進(jìn)一步的分析。由圖7a可知，轉(zhuǎn)基因番茄成熟果皮中的花色苷鮮重總含量達(dá)到1.6mg/g，而非轉(zhuǎn)基因果皮中則未有明顯的花青素被檢測(cè)到。為了證明苤藍(lán)基因bott8和bopap2在番茄中能夠有效地激活花青素的合成，我們?cè)谵D(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因微型番茄中采用rt-qpcr檢測(cè)了花青素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。

根據(jù)番茄sldfr和slans基因序列，設(shè)計(jì)如下引物：

qsldfr-f：5'-gctggagcgatttggacttc-3'(seqidno.21)；

qsldfr-r：5'-cagccttctctgccagtatctt-3'(seqidno.22)；

qslans-f：5'-ctaagcaacggaaagtacaagagc-3'(seqidno.23)；

qslans-r：5'-cggtgacagtctcaggtaggg-3'(seqidno.24)。

分別提取非轉(zhuǎn)基因番茄和不同轉(zhuǎn)基因番茄株系成熟果皮的總rna，以反轉(zhuǎn)錄得到的cdna為模板、分別以qsldfr-f和qsldfr-r，qslans-f和qslans-r，qcac-f和qcac-r為引物進(jìn)行rt-qpcr檢測(cè)分析。結(jié)果如圖7b和c所示，相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因材料，在轉(zhuǎn)基因微型番茄成熟果皮中，sldfr和slans基因的表達(dá)水平都被顯著地上調(diào)。這些結(jié)果說明外源基因qbopap2和qbott8是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控合成基因的表達(dá)進(jìn)而激活花青素在轉(zhuǎn)基因番茄中的大量合成積累。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其做出各種改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。

<110>鄭州大學(xué)

<120>苤藍(lán)基因及其在培育紫色微型番茄中的應(yīng)用

<160>24

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gacgtctagacttatattatatatcgctgg30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca30

<210>3

<211>836

<212>dna

<213>苤藍(lán)(brassicaoleraceavar.gongylodesl.)

<400>3

gacgtctagacttatattatatatcgctggtccatggagggtatgtccaaagggttgaaa60

aaaggtgcatggattgctgaagaagataatctcttgaggcaatgcattgataagtatgga120

gaagggaaatggcaccaagttcctttaagagctggtctaaatcggtgcaggaagagttgt180

agactaagatggttgaactatttgaagccaagtatcaagagaggaaaactcaactctgat240

gaagttgatcttcttattcgccttcataagcttttaggaaacaggtggtctttaattgct300

ggtagattacccggtcggaccgccaatgacgtcaaaaattactggaacacccatttgagt360

aagaaacatgaaccaggttgtaagacccagatgaaaaagagaaacattccttgctcttat420

accacaccagcccaaaaaatcgacgttttcaaacctcgacctcgatccttaaccgttaac480

aacggctgcagccatattaatggcatgccagaagctgacattgttcctctatgccttgga540

ctcaacgacactaataatgtttctgaaaatataatcacatgtaacaaagatgatgataaa600

tttgagcttgttagtaatttaatggatggtcagaataggtggtgggaaagtttgctagat660

gagagccaagatccagctgcgctctttccagaagctacagcaacaaaaaagggcgcaacc720

tccgcgtttgacgttgagcaactttggagcctgttggatggagaaactggaacttgatta780

gtgtttccactgtttgtttgtgcttgtgtgtgacatagtgacttttgagctcatca836

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

cgtctctagaatggatgaat20

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

atcagagctcttagaatctaggaa24

<210>6

<211>1600

<212>dna

<213>苤藍(lán)(brassicaoleraceavar.gongylodesl.)

<400>6

cgtctctagaatggatgaattaagtattataccgttatggaaagtgatcggggctgagaa60

agaagagattcaagggctacttaaggcggtggtgcaatctgtggggtggacttatagtgt120

cttctggcaactttgtcctcaacgaaggaaattgttgtggagtagtggaaactataacgg180

tgcaataaagactagaaagacaactcagccggcggaagttacggctgaagaggctgcgtc240

ggaaagaagccaacagctcatggagctttacgagacgctttttgctggagaatcatcgat300

ggaagcgagggcttgcacagcactgtcgccggaggatttgacggatcctgaatggtttta360

tgtgctgtgtttcacttactctttcgaacctccttctgggatgccaggaaaggcgtatgc420

gaggaggaagcacatatggctaagtggtgcaaatgaggttgacaataaaatcttctctag480

ggctatttctgcaaagagtgccaaaattcagacagtggtttgcattcccgtgcttgatgg540

cgttttggaactaggcacaacgaacaaggtcaaagagagtgaagagtttgttgaccacat600

aaagagtttcttccacaactacccgaagtcaaacactaagcctactctttctgaacactt660

catcaacgaagagcgtgaagaagacgaagacgaagtagaagaagaagaaatgacaatgtc720

agaggagataagacttggttctcctgatgacgatgacgtctccaatcaaaatctactctc780

tgatttccatatagaagcaaccaatagtttagatacacacatggacatgatgaatctaat840

ggaggaaggcggaaattattctcagacagtatcaacacttctcatgtcacaacccaccag900

tcttctttcagattcagtttccacatcttcttacgttcaatcatcgtttatatcgtggag960

agttgagaatgtcaaagagcatcagcaatatcagcgagtggaaaaagcggcgtcttcgtc1020

gtcgcaatggatgctcaaacacataatcttgaaagttcctttcctccacgacaacactaa1080

aaataagaggctgccgcgagaagagcttaaccatgtggtggccgagcgacgcagaagaga1140

gaagctaaatgagagattcataacgttgagatcattggttccatttgtgaccaagatgga1200

taaagtctcgatccttggagacaccattgagtacgtaaaccatctttctaagaggatcca1260

tgagctggaatctactcatcacgagccaaaccaaaagcggatgcgtatcggtaagggaag1320

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cgagtaccgagatggtttattgctcaacattcttcaggtacttaaggagctaggtataga1440

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agtgagagggaagaaaccaaccattgctgaggttaaaatagccatccatcaaatcatata1560

taataataaactctagttcctagattctaagagctctgat1600

<210>7

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<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gacgtctagacttatattatatatcgctgg30

<210>8

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tgatgagctcaaaagtcactatgtcacaca30

<210>9

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgtctctagaatggatgaattaagtattatacc33

<210>10

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

atcagagctcttagaatctaggaactagagttt33

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<211>26

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<213>人工序列

<400>11

cggaattcgcaggtccccagattagc26

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<213>人工序列

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acgccagggttttcccagtcacga24

<210>13

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gacaatcggctgctctga18

<210>14

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<213>人工序列

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aactccagcatgagatcc18

<210>15

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<212>dna

<213>人工序列

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ttccttgctcttataccacacc22

<210>16

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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gtcagcttctgccatgccatta22

<210>17

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<212>dna

<213>人工序列

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cgtgcttgatggcgtttt18

<210>18

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<212>dna

<213>人工序列

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acttcgggtggttgtgga18

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<213>人工序列

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cctccgttgtgatgtaactgg21

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<212>dna

<213>人工序列

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attggtggaaagtaacatcatcg23

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<213>人工序列

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gctggagcgatttggacttc20

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<212>dna

<213>人工序列

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cagccttctctgccagtatctt22

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<213>人工序列

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ctaagcaacggaaagtacaagagc24

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cggtgacagtctcaggtaggg21