番茄抗白粉病基因快速鑒定的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是借助于番茄測序全基因組序列，利用植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信 息學(xué)和候選基因策略等方法快速鑒定番茄白粉病基因，主要涉及到番茄全基因組序列的下 載，候選基因的鑒定，基因的比對，聚類等手段，進(jìn)而鑒定出白粉病基因，屬于植物生物技術(shù) 科學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 番茄別名西紅柿、洋柿子，是茄科茄屬的一種植物。果實營養(yǎng)豐富，具有特殊風(fēng)味。 可以生食、煮食、加工制成番茄醬、汁或整果館藏。番茄是全世界栽培最為普遍的果菜之一。 番茄味甘、酸，性涼，微寒。能清熱止渴，養(yǎng)陰，涼血，歸肝、胃、肺經(jīng)。具有生津止渴，健胃消 食，清熱解毒，涼血平肝，補(bǔ)血養(yǎng)血和增進(jìn)食欲的功效?？芍慰诳剩秤徽竦榷喾N疾病。番 茄白粉病是由番茄白粉病菌引起的一種嚴(yán)重的寄生型真菌病害，在師姐范圍廣泛傳播。白 粉病菌主要侵染番茄葉片，影響植物光合作用，通常會造成番茄減產(chǎn)30%?50%，嚴(yán)重威 脅番茄生產(chǎn)。發(fā)病初期，葉面出現(xiàn)白色霉點，散生，后逐漸擴(kuò)大成白色粉斑，并互相連和為大 小不等的白粉斑，嚴(yán)重時整個葉面被白粉所覆蓋。葉柄、莖部、果實等部位也會染病，病部表 面出現(xiàn)白色狀霉斑。通常，病害的防治主要靠噴灑殺菌劑，但長期使用藥物會導(dǎo)致環(huán)境污染 和病菌生理小種變異，因此推廣抗病品種是最安全有效的方法。
[0003]ML0基因是植物中特異的一類基因，它對植物的抗病過程起負(fù)調(diào)控作用。研究者最 早發(fā)現(xiàn)ML0基因?qū)Π追鄄】剐允鞘加?937-1938年，由德國人在埃塞俄比亞采集了很多品 種的大麥，其中的兩個株系對白粉病菌（Blumeria.graminisf.sp.hexleiBgh)所有已知的 生理小種都具有高效抗性。進(jìn)一步研究表明，大麥中ML0基因的隱性突變mlo可以使大麥 對幾乎所有已知大麥白粉病菌的生理小種產(chǎn)生持久、廣譜的抗性。最近，研究發(fā)現(xiàn)番茄，豌 豆、擬南芥、薔薇、辣椒、百脈根等很多植物的白粉病基因都是ML0型抗病基因控制。因此挖 掘植物中的ML0型抗病基因?qū)χ参锟拱追鄄∮N具有重要的意義。目前，常用挖掘抗病基 因常用的方法有圖位克隆，轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等方法。但是由于番茄的基礎(chǔ)研究不夠深入，因此利 用這些方法不僅時間長而且很難準(zhǔn)確地克隆這些基因。
[0004] ML0是人們發(fā)現(xiàn)的第一個抗病基因。由于長期的進(jìn)化過程中使植物形成了使自身 免受病原物的侵害，一系列抗病相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控。Mlo基因就是植物抗病基因中的 重要成員，該基因最初在大麥中被發(fā)現(xiàn)，這類基因在植物中編碼一個七次跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋 白家族，可能起到與G蛋白偶聯(lián)受體類似的功能。它們的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位和序列多樣 化與動物和真菌的G蛋白偶聯(lián)受體很相似。野生型ML0基因是大麥抗白粉病的負(fù)調(diào)控因子， 可賦予大麥對白粉菌的廣譜抗性。已有的研究表明，ML0基因在許多作物里呈家族形式，具 有多個家族成員，其中擬南芥中有15個家族成員。在玉米中發(fā)現(xiàn)至少有9個。在水稻中有 12個家族成員，由于其他植物的全基因組測序上作的滯后等因素，在大麥，小麥、蓮藕、辣椒 等作物上相對很少有ML0家族其它成員被發(fā)現(xiàn)。白粉病是由白粉菌引起的真菌性病害，白 粉菌能侵染650多種單子葉植物和9000多種雙子葉植物。
[0005] 植物比較基因組學(xué)（comparativegenomics)又稱比較遺傳學(xué)，是指在不同物種之 間利用共同的標(biāo)記構(gòu)建圖譜或?qū)Σ煌锓N基因組相應(yīng)部分（或全部）區(qū)域進(jìn)行測序，比較 它們之間的基因數(shù)目、相對位置、結(jié)構(gòu)關(guān)系等，以揭示不同物種之間的基因家族成員數(shù)目和 排列順序的異同。一般來講，比較基因組學(xué)主要包括兩個方面：基于遺傳圖譜的宏觀共線性 和基于物理圖譜或測序的微觀共線性。利用模式植物基因組與其它植物基因組之間編碼順 序上和結(jié)構(gòu)上的同源性，克隆其他植物基因，揭示基因功能和分子機(jī)制，闡明物種進(jìn)化關(guān)系 及基因組的內(nèi)在結(jié)構(gòu)。植物比較基因組學(xué)的重要性在于它把不同的學(xué)科、不同的生物種類 聯(lián)系在一起，架起了基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究之間的橋梁?？绶N、跨屬、跨界的基因組比較對我 們了解基因及基因組的結(jié)構(gòu)、基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及DNA變化如何導(dǎo)致生物多樣性等有 十分重要的意義。
[0006] 本專利所采用的方法及思路：模式植物擬南芥基因組研究已經(jīng)揭示了ML0型基因 的功能，利用基因其順序上的同源性克隆番茄ML0型抗病基因，根據(jù)模式植物擬南芥實驗 系統(tǒng)上的優(yōu)越性和已知ML0型抗病基因的特點，快速"捕捉"番茄抗白粉病基因。本專利介 紹了以番茄全基因組序列為前提，結(jié)合比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、基因組學(xué)、生物信息學(xué)和候 選基因策略等知識，快速挖掘白粉病基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種通過結(jié)合植物比較基因組學(xué)、植物遺傳學(xué)、基因組學(xué)和 生物信息學(xué)等知識，快速挖掘番茄抗白粉病基因。其結(jié)果一方面可用于番茄白粉病基因緊 密連鎖分子標(biāo)記的開發(fā)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種，另一方面也為其他作物白粉病基因 鑒定提供參考依據(jù)。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 主要原理：第一個植物抗白粉病基因（ML0)是從大麥中克隆的，研究發(fā)現(xiàn)此基因 是一類特殊的抗病基因，不同于先前克隆的大多數(shù)NBS(nucleotide-bindingsite)類型抗 病基因；隨后，研究者相繼從番茄、擬南芥、豌豆、辣椒、百脈根等植物中克隆了白粉病基因， 研究發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的都是ML0型抗病基因。隨后，眾多研究者通過多次試驗證實ML0 型抗病基因已經(jīng)成為植物特有的一類抗白粉病基因。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物ML0類型基因是一 個基因家族；而且對來源于不同物種的ML0基因家族進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，不同物 種中抗白粉病基因總是聚類一起，成為一類，這一類ML0基因都具有抗白粉病基因序列的 典型特征。番茄基因組測序的完成為挖掘白粉病基因提供了一條便利途徑。因此，可以借 助于已經(jīng)測序的番茄全基因組中ML0基因家族和已經(jīng)克隆的ML0白粉病基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān) 系以及對于維持白粉病基因ML0重要功能的氨基酸保守性來鑒定番茄白粉病基因。
[0011] 主要步驟如下：
[0012] 1)番茄全基因組序列的下載及其ML0型基因的采集
[0013] 首先從番爺測序基因組數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net/)下載番爺全基因組 序列；使用"DNAT00LS"軟件對獲得的番茄全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫，然后用 pfam數(shù)據(jù)庫（蛋白家族數(shù)據(jù)庫，http://pfam.janelia.org/search/sequence)中的隱馬爾 可夫模型（HMM)對ML0結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列與已建立的番茄全基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn) 行Blastp(E-value= 0. 001)序列比對，初步篩選出候選基因序列。其次，利用已經(jīng)公布的 MLO型基因序列，對番茄基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對，獲得候選基因序列。
[0014] 2)番茄ML0型基因家族的鑒定
[0015] 將上述結(jié)果中得到的同源氨基酸序列的候選基因，通過Pfam(E-valUe= 1.0)進(jìn) 行分析，去除無'ML0'結(jié)構(gòu)域的基因序列（圖1)。再將候選抗病基因序列通過MEGA3. 1軟 件提供的ClustalW工具（多序列比對程序）進(jìn)行多序列比對，去除重復(fù)序列。
[0016] 3)通過植物ML0型基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系鑒定候選的番茄ML0型白粉病基因
[0017] 由于先前的研究已經(jīng)證明，雙子葉植物ML0型白粉病基因位于植物ML0基因系統(tǒng) 發(fā)育樹同一區(qū)組，因此在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中，我們把擬南芥的ML0型基因家族和一些其 他作物的ML0型抗白粉病基因和番茄ML0型基因一起聚類分析，以獲得候選的番茄抗白粉 病基因（圖2)。
[0018] 4)番茄白粉病基因與已知的植物ML0白粉病基因的比對
[0019] 利用Bi〇XM2. 6軟件將番茄候選的ML0型白粉病基因和擬南芥、豌豆、大麥的ML0 白粉病基因的氨基酸序列轉(zhuǎn)換成Fasta格式的文件，將這些文件導(dǎo)入BioEdit7. 0軟件，運 用此軟件中Clustal軟件進(jìn)行多序列比對，揭示候選白粉病基因重要氨基酸殘基及區(qū)域的 保守性。從而進(jìn)一步鑒定番茄候選的白粉病基因（圖3)。
[0020] 本發(fā)明的積極效果：
[0021] 1)縮短了番茄白粉病基因挖掘周期，有利于白粉病基因的快速鑒定。采用常規(guī)方 法（圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等）挖掘抗白粉病基因不僅耗時耗力、效率低，且難以成功。本 發(fā)明基于植物比較基因組學(xué)、遺傳學(xué)、生物信息學(xué)方法快速挖掘番茄白粉病基因，不僅可以 縮短時間，還可以提高白粉病基因鑒定效率。
[0022] 2)番茄是全世界重要蔬菜之一。由于番茄遺傳基礎(chǔ)狹窄，種質(zhì)資源多樣性低，因此 通過常規(guī)的分子標(biāo)記（RAPD、ISSR、SSR、AFLP等）鑒定番茄白粉病基因比較困難。通過鑒 定的候選白粉病基因開發(fā)相應(yīng)的共分離功能性標(biāo)記（SNP、SCAR等），可以快速的用于抗病 基因的分子標(biāo)記輔助選擇，準(zhǔn)確性高。
[0023] 3)多抗性育種材料的創(chuàng)制?；谛妈b定的白粉病基因開發(fā)的功能性分子標(biāo)記，結(jié) 合已經(jīng)定位的其他抗病基因的分子標(biāo)記，進(jìn)行多抗性育種材料的創(chuàng)制，可以縮短育種年限， 提_育種效率。
[0024] 4)為闡述番茄抗白粉病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。番茄抗白粉病基因的鑒定，通過轉(zhuǎn) 基因技術(shù)、RNAi、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virusinducedgenesilencing，VIGS)技術(shù)等研究 抗白粉病的分子機(jī)制提供了基因資源，有利于快速闡述番茄抗白粉病的作用機(jī)理。
【附圖說明】
[0025] 圖1番茄ML0基因的鑒定；
[0026] 本圖顯示的是16個ML0型基因鑒定結(jié)果，每一個基因都含有一個'ML0'保守結(jié)構(gòu) 域。
[0027] 圖2植物ML0基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析及其番茄ML0型白粉病基因的鑒定；
[0028] 擬南芥是植物科學(xué)研究的模式植物，在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹中，擬南芥的15個ML0型 基因（其中3個基因是白粉病基因：AtML002,AtML006和AtML012)、番茄抗白粉病基因 6頂11))、大麥白粉病基因〇1讀11))和豌豆的白粉病基因（?說11))被選擇用來和番茄此0型 基因聚類分析。共鑒定出5個番茄候選的MLO型白粉病基因。圖中斜體標(biāo)記的基因就是候 選番茄白粉病基因。
[0029] 圖3番茄ML0型白粉病基因的比對分析；
[0030] 5個番茄白粉病基因與大麥（HvMLO)、豌豆（PsMLO)、擬南芥白粉病基因（AtML002， AtML006和AtML012)進(jìn)行比對，鑒定白粉菌侵染有重要作用的氨基酸殘基和