本申請為國際申請pct/us2011/044172進入中國國家階段的中國專利申請(申請?zhí)枮?01180042808.0，申請日為2011年7月15日，發(fā)明名稱為“靶向于鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的人源化抗體及相關組合物和方法”)的分案申請。

相關申請

本申請要求于2010年7月15日提交的美國臨時申請?zhí)?1/364,698的權益。以上申請的全部內容都通過引用并入本文。

背景技術：

患有重度慢性關節(jié)炎癥的患者遭受嚴重的關節(jié)退化(包括骨和軟骨的破壞)，這導致了長期疼痛、畸形、關節(jié)功能的喪失、運動能力下降以及預期壽命縮短。關節(jié)炎癥與關節(jié)中細胞和炎性物質的數(shù)量增加有關，這些細胞和炎性物質引起了刺激、軟骨的磨損以及關節(jié)內襯(jointlining)的腫脹。已知幾種不同的自身免疫性疾病觸發(fā)了關節(jié)中不當?shù)幕蛘`定向的炎癥，從而在患有這些疾病的個體的關節(jié)中導致慢性炎癥。常見的炎性關節(jié)病癥包括類風濕性關節(jié)炎、銀屑病性關節(jié)炎、萊特爾氏綜合征以及強直性脊柱炎。

類風濕性關節(jié)炎(ra)是最常見的炎性關節(jié)炎形式，其據(jù)估計影響到美國人口的大約1％，或者說大約210萬美國人。ra是一種慢性疾病，其特征在于關節(jié)的內襯或滑膜的炎癥，并且隨著時間推移會導致嚴重的骨和軟骨的損害。與男性相比，ra在女性中更為常見，并且多達3％的女性在她們的一生中可能發(fā)生類風濕性關節(jié)炎。目前，ra的病因還未知。

ra可以引起長期的關節(jié)損害，導致慢性疼痛、功能喪失以及失能。此外，最近的研究表明，患有ra的人，特別是其疾病沒有得到良好控制的那些人，可能具有更高的心臟病、中風以及發(fā)生纖維化(尤其是肺纖維化)的風險。

肺纖維化，包括特發(fā)性肺纖維化和放射誘導的纖維化，以及由吸煙、化學品接觸、硬皮病、結節(jié)病、治療性輻射、ra或狼瘡引起的纖維化，折磨著全球5,000,000名患者，以及美國的超過500,000名個體。特發(fā)性肺纖維化的5年死亡率約為80％，僅在美國每年就導致40,000例死亡。目前在美國或歐洲對于特發(fā)性肺纖維化還沒有已得到批準的療法。

因此，由ra和其他炎癥性狀況引起的纖維化和慢性關節(jié)炎癥是國際性的衛(wèi)生負擔。存在著開發(fā)用于預防和治療這些和其他病癥的新藥的需要。

技術實現(xiàn)要素：

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及特異性結合哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的人源化抗體，該抗體包含含有選自seqidno：61、seqidno：63、seqidno：65、seqidno：67和seqidno：69的氨基酸序列的抗體重鏈可變區(qū)。在一個具體的實施方式中，該人源化抗體拮抗哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質。在進一步的實施方式中，該人源化抗體包含含有seqidno：69的抗體重鏈可變區(qū)。

在另一實施方式中，本發(fā)明涉及特異性結合哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的人源化抗體，其包含含有seqidno：69的抗體重鏈可變區(qū)和含有seqidno：71的抗體輕鏈可變區(qū)。在一個具體的實施方式中，該人源化抗體拮抗哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質。

在另一實施方式中，本發(fā)明提供了治療需要的哺乳動物受試者(例如，人)中鈣粘著蛋白-11介導的病癥(例如，炎性關節(jié)病癥)的方法。該方法包括對該受試者施用治療有效量的特異性結合哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域并拮抗哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質的人源化抗體，從而在該受試者中產(chǎn)生期望的治療效果。在一個具體的實施方式中，該人源化抗體包含含有seqidno：69的抗體重鏈可變區(qū)。在優(yōu)選的實施方式中，鈣粘著蛋白-11介導的病癥是類風濕性關節(jié)炎。

在又另一實施方式中，本發(fā)明涉及包含特異性結合哺乳動物鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的人源化抗體和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一個具體的實施方式中，該人源化抗體包含含有seqidno：69的抗體重鏈可變區(qū)。在進一步的實施方式中，該藥物組合物進一步包含第二藥劑，諸如緩解疾病的抗風濕病藥或抗炎藥。

本發(fā)明提供了對于治療人的由鈣粘著蛋白-11介導的炎癥和其它狀況具有改善的療效的新藥劑和療法。

附圖簡要說明

本專利或申請文件包含至少一個彩繪附圖。帶有彩色附圖的本專利或專利申請公開的副本將根據(jù)請求并支付必要的費用后由專利局提供。

圖1a是示出了使用抗cad-11抗體23c6、13c2以及27f3來檢測鈣粘著蛋白-11-ec1-5-fc融合蛋白(見實心箭頭)的蛋白質印跡。這些抗體并不識別也存在于該膜上的鈣粘著蛋白-11-ec1-fc以及鈣粘著蛋白-11-ec1/2-fc融合蛋白(關于印跡上鈣粘著蛋白-11-ec1-fc和鈣粘著蛋白-11-ec1/2-fc蛋白的位置見空心箭頭)。

圖1b是描繪了如通過elisa測定的，公開的鈣粘著蛋白-11抗體13c2、23c6以及5f82與人cad-11-ec1-5-fc融合蛋白的結合，而不與cad-11-ec1-fc融合蛋白結合的圖。相比之下，ec1抗體h1m1與cad-11-ec1-fc融合蛋白以及cad-11-ec1-5-fc融合蛋白兩者都結合。

圖2是參與鈣粘著蛋白結合的人cad-11(seqidno：3)、mn-cad(seqidno：4)以及cad-8(seqidno：5)的ec1結構域的前34個氨基酸的氨基酸序列比對。包含延伸至鈣粘著蛋白反受體的口袋中的殘基的供體序列通過在序列的左側一半加下劃線來表示，并且該口袋序列的殘基通過在seqidno：3中的序列的右側一半加下劃線來表示。

圖3是描繪了如通過elisa所測定的，鈣粘著蛋白-11結合fab與人cad-11ec1結構域肽以及cad-11-ec1-fc融合蛋白結合，但不與cad-8或mn-cadec1結構域肽結合的圖?？寺?證明了與cad-11ec1結構域肽以及融合蛋白的明顯結合，而不與mn-cad或cad-8ec1結構域肽結合。

圖4是描繪來自體外cad-11細胞聚集分析的數(shù)據(jù)的圖。加入到培養(yǎng)基中的cad-11拮抗劑，例如由抗cad-11抗體13c2制備的fab，或不同濃度的針對鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的前35個氨基酸的抗鈣粘著蛋白-11ec1fab(標示為ec1fab克隆7)，阻止了cad-11介導的431-d-11細胞的聚集?？光}粘著蛋白-11ec1fab(克隆7)在從0.3μg/ml至10μg/ml范圍內的所有測試濃度下抑制了a-431-d-11表皮樣癌細胞的聚集。相比之下，由13c2抗鈣粘著蛋白-11抗體制備的fab僅在10μg/ml的濃度下抑制細胞聚集。

圖5是描繪來自第二體外cad-11細胞聚集分析的數(shù)據(jù)的圖。431-d-11細胞的聚集在加入sme培養(yǎng)基(標示為對照)、不同濃度的含有與人igg2鉸鏈域、ch2和ch3結構域融合的cad-11的ec1結構域的融合蛋白(標示為cad-11-ec1-fc)、不同濃度的針對鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的前35個氨基酸的抗鈣粘著蛋白-11ec1fab(標示為cad-11ec1fab)或不同濃度的對照抗綠色熒光蛋白(抗-gfp)fab(標示為gfpfab)之后40分鐘顯示。抗鈣粘著蛋白-11ec1fab(克隆7)在3μg/ml、1μg/ml和0.1μg/ml的濃度下抑制表達cad-11的431-d-11細胞的聚集。ec1-fc融合蛋白在3μg/ml的濃度下抑制431-d-11細胞的聚集。相比之下，抗-gfpfab在任何測試濃度下都沒有顯著地抑制細胞聚集。

圖6是描繪使用體外細胞聚集試驗，各種抗鈣粘著蛋白-11ec1fab對cad-11介導的細胞聚集的抑制的圖，這些抗鈣粘著蛋白-11ec1fab對單獨的cad-11(ec1fab克隆7和克隆4)、cad-11和cad-8(ec1fab克隆6)或者cad-11和mn-cad(ec1fab克隆5)具有結合特異性。相對于對照(d-11sme；左柱)，所測試的所有fab均抑制431-d-11細胞的聚集。

圖7是描繪使用體外細胞聚集試驗，抗-cad-11fab對cad-11介導的細胞聚集的抑制的圖，這些抗-cad-11fab對單獨的cad-11(ec1fab克隆7)或cad-11和mn-cad(ec1fab克隆8)具有結合特異性。所測試的fab的特異性在各fab名稱旁邊的括號中示出。相對于gfp特異性的對照fab(左柱)，這兩種鈣粘著蛋白特異性fab均抑制細胞聚集(中間柱和右柱)。

圖8示出了人cad-11-ec1-higg2-fc1融合蛋白(cad-11-ec1-fc)的核苷酸(dna)序列(seqidno：6)。這種人鈣粘著蛋白-11胞外域的序列以斜體示出，bglii位點加下劃線，并且編碼人igg2-fc1區(qū)的序列以黑體字母示出。

圖9示出了人cad-11-ec1-higg2-fc1融合蛋白(cad-11-ec1-fc)的氨基酸序列(seqidno：7)。人鈣粘著蛋白-11胞外域的序列以斜體示出，由bglii位點編碼的序列加下劃線，并且人igg2-fc1區(qū)的序列以黑體字母示出。

圖10是已經(jīng)用考馬斯藍染色的sds聚丙烯酰胺凝膠的圖像，其示出了在使用蛋白a柱從細胞培養(yǎng)基純化后，分別對應于純化的cad-11-ec1-higg2-fc1(中間泳道)以及cad-11-ec1/2-higg2-fc1(右側泳道)融合蛋白的單體形式的顯著強條帶。分子量標準在左側泳道中示出。

圖11是示出了使用與辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián)的抗人igg抗體來檢測人cad-11-ec1-higg2-fc1(中間泳道)以及cad-11-ec1/2-higg2-fc1(右側泳道)融合蛋白的蛋白質印跡。在各個泳道中所觀察到的顯著條帶對應于融合蛋白的單體形式的位置。由于不完全的還原條件，融合蛋白的二聚體形式的位置也是可見的(見較低強度的更高分子量的條帶)。分子量標準在左側泳道中示出。

圖12是描繪與未經(jīng)處理的細胞相比cadd-11-ec1-fc融合蛋白以及小鼠抗-cad-11抗體13c2在所示濃度下抑制表達cad-11的人成纖維細胞樣滑膜細胞向基質膠小室(matrigelplug)內的侵入(標記為侵入)的圖。數(shù)據(jù)從兩個獨立實驗合并。

圖13a和b是描繪來自兩個體外cad-11細胞聚集試驗的數(shù)據(jù)的圖。表達cad-11的431-d-11細胞的聚集百分比在加入sme培養(yǎng)基(標示為對照)或cad-11融合蛋白之后的40分鐘顯示。圖13a示出了在不同濃度的包含與人igg2鉸鏈域、ch2和ch3結構域融合的cad-11的5個胞外域的融合蛋白(標示為cad-11-ec1-5-fc)的存在下對聚集的抑制。圖13b示出了不同濃度的包含與人igg2鉸鏈域、ch2和ch3結構域融合的cad-11的n末端胞外域(ec1結構域)的融合蛋白(標示為cad-11-ec1-fc)或cad-11-ec1-5-fc的聚集抑制。

圖14a-c示出了人鈣粘著蛋白-11cdna序列(seqidno：1；見genbank登錄號nm001797)。

圖15示出了人鈣粘著蛋白-11蛋白質序列(seqidno：2；見genbank登錄號np001788)。

圖16是顯示了如通過elisa所測定的，在來自肽4雜交瘤(hl)的培養(yǎng)基或對照雜交瘤培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)中的抗體與包含cad-11、cad-8或mn-cad的ec1-2結構域的蛋白質的結合水平的曲線圖。

圖17a-c是描繪細胞染色強度(mfi；平均熒光強度)的代表性圖，以該細胞染色強度作為h14抗體與表達cad-11的431-d-11細胞的結合的量度。

圖17d-f是描繪相對于圖17a-c缺乏431-d細胞染色(mfi；平均熒光強度)的代表性圖，其表明不存在h14抗體與cad-11陰性細胞結合。

圖17g-i是描繪細胞染色強度(mfi；平均熒光強度)的代表性圖，以該細胞染色強度作為h1m1抗體與表達cad-11的431-d-11細胞的結合的量度。

圖18a是描繪如按照細胞染色強度(mfi；平均熒光強度)所測量的，在不同抗體濃度下，h14抗體與表達cad-11的細胞結合以及不存在h14與cad-11陰性對照細胞的結合的圖。

圖18b是顯示了根據(jù)細胞染色強度(mfi；平均熒光強度)所測量的，在不同抗體濃度下，h1m1抗體與表達cad-11的細胞結合以及不存在h1m1與cad-11陰性對照細胞的結合的曲線圖。

圖19a是顯示了如通過elisa所測定的，在不同的抗體濃度下，h14抗cad-11抗體與cad-11和cad-8ec1結構域肽的結合程度的曲線圖。

圖19b是顯示了如通過elisa所測定的，在不同的抗體濃度下，不存在h14抗cad-11抗體與cad7、mncad、cad9、cad18、cad20或cad24ec1結構域肽的結合的曲線圖。

圖20是顯示了如通過elisa所測定的，在不同的抗體濃度下，h1m1抗cad-11抗體與cad-11、cad-8、cad-7、mn-cad、cad-9、cad-18、cad-20和cad-24ec1結構域肽的結合的曲線圖。

圖21a是描繪如通過elisa所測定的，h1m1抗cad-11抗體與各種cad-11ec1結構域肽免疫原(pep1、pep2、pep3和pep4)以及cad-11ec1結構域融合蛋白(efl)和人igg對照(fc段)的結合程度的圖。

圖21b是描繪如通過elisa所測定的，h14抗cad-11抗體與各種cad-11ec1結構域肽免疫原(pep1、pep2、pep3和pep4)以及cad-11ec1結構域融合蛋白(efl)和人igg對照(fc段)的結合程度的圖。

圖22是顯示人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的前37個氨基酸的序列以及由肽1-4的各肽所包含的該序列的部分的示意圖。位于肽3上游的肽2和肽4共有的氨基酸殘基在加框區(qū)中突出顯示。直接參與cad-11與cad-11結合的氨基酸加下劃線。

圖23a是示出了用對照同種型抗體處理的聚集的表達cad-11的細胞的大團塊的照片。

圖23b是示出了h1m1處理的表達cad-11的細胞的小細胞團的照片，這些小細胞團不進一步形成圖23a中所觀察到的大團塊。

圖23c是示出了未經(jīng)處理的親本cad-11陰性細胞保持為單一或雙重細胞的組的照片。

圖24a是示出了具有聚集細胞的大團塊的cad-11表達細胞的培養(yǎng)物的照片。

圖24b是示出了在用h14cad-11ec1結構域抗體處理之后表達cad-11的細胞的培養(yǎng)物的照片，相對于圖24a中所示，該培養(yǎng)物主要具有單細胞，具有小而稀少的細胞簇。

圖25是顯示了相對于未經(jīng)處理的對照小鼠，在用劑量逐漸增加的h1m1抗cad-11抗體處理的小鼠中抑制與關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹的曲線圖。

圖26是顯示了相對于未經(jīng)處理的對照小鼠，在每隔一天用0.3mg的h14或h1m1抗cad-11抗體處理的小鼠中抑制與關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹的的曲線圖。

圖27是示出了與未經(jīng)處理的對照相比，在小鼠模型中用0.3mg的h1m1或h14抗體進行處理延遲了關節(jié)炎的發(fā)展的曲線圖。

圖28是顯示了來自肽3雜交瘤(hl)的包含抗體的培養(yǎng)基或對照雜交瘤培養(yǎng)基(培養(yǎng)基)與cad-11、cad-8和mn-鈣粘著蛋白的ec1-2結構域或cad-11ec1-fc融合蛋白的結合程度的曲線圖。

圖29是顯示了來自肽3雜交瘤的抗cad-11抗體與表達人cad-11蛋白質的細胞(見箭頭)以及表達neos的非cad-11表達的對照細胞的結合程度的曲線圖。圖30a是描繪與培養(yǎng)基一起孵育的成纖維細胞樣滑膜細胞(fls)的照片。細胞聚集物和通過細胞突關聯(lián)的細胞是可見的。

圖30b是描繪與30μg/ml的對照抗體一起孵育的fls的照片。細胞聚集物和通過細胞突關聯(lián)的細胞是可見的。

圖30c是描繪與30μg/mlh1m1抗體一起孵育的fls的照片?？梢姷缴倭考毎奂锖图毎?。

圖31是顯示了相對于包括結合在ec1區(qū)外的其他cad-11抗體在內的對照，在與h1m1抗體接觸后，對fls向基質膠包被的膜內侵入的抑制的曲線圖。

圖32是顯示了相對于對照，在施用h1m1抗體后，kbn小鼠關節(jié)炎模型中關節(jié)腫脹的抑制的曲線圖。

圖33描繪了h1m1可變重鏈核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。cdr定義和蛋白質序列編號依據(jù)kabat。cdr核苷酸序列和蛋白質序列以灰色示出。

圖34描繪了h1m1可變輕鏈核苷酸序列和推斷的氨基酸序列。cdr定義和蛋白質序列編號依據(jù)kabat。cdr核苷酸序列和蛋白質序列以灰色示出。

圖35a-h描繪了在h1m1/syn0012人源化抗cad-11抗體變體的設計中使用的5條vh鏈(a-e)(seqidno：60-69)和3條vκ鏈(f-h)(seqidno：70-75)的核苷酸序列和氨基酸序列。cdr定義和蛋白質序列編號依據(jù)kabat。cdr核苷酸序列和蛋白質序列以紅色突出顯示。

圖36是說明pantvk和pantvhg4載體的載體圖譜。pantvk和pantvhg4載體都包含整合了內含子和聚a序列的基因組dna片段。這兩個鏈的表達都由cmv啟動子驅動。重鏈載體上的dhfr小基因用于選擇。

圖37描繪了蛋白a純化的抗體的考馬斯藍染色sds-page凝膠。(a)嵌合抗cad-11ec1igg4(syn0014)；(b)人源化抗cad-11抗體變體(sdp011-sdp151)。大小標志物是預染色的蛋白質標準fermentaspageruler(目錄號sm1811)。注：sdp111未電泳。

圖38a-c是描繪抗cad-11競爭性elisa的結果的圖。相對于固定濃度的生物素化鼠syn0012抗體，測試人源化抗cad-11ec1抗體(sdp011至sdp151)的稀釋系列與重組人cad-11融合蛋白的結合。生物素化的抗體的結合隨著測試抗體和對照抗體的量的增加而減少。a：sdp011至sdp051：b：sdp061至sdp101：c：sdp111至sdp151。

圖39a-o是顯示了在鈣粘著蛋白交叉反應性試驗中用包含cad-11肽免疫原(各曲線中的紅線)和來自鈣粘著蛋白7、8、9、11、18、20和24的相應同源序列的肽滴定人源化抗cad-11抗體的曲線圖。肽涂覆濃度為500ng/ml。a：sdp011；b：sdp021；c：sdp031；d：sdp041；e：sdp051；f：sdp061；g：sdp071；h：sdp081；i：sdp091；j：sdp101；k：sdp111；l：sdp121；m：sdp131；n：sdp141和o：sdp151。

圖40a-d描繪了人源化抗cad-11抗體(a)sdp031(seqidno：71，65)、(b)sdp051(seqidno：71，69)、(c)sdp061(seqidno：73，61)、(d)sdp071(seqidno：73，63)的輕鏈和重鏈可變區(qū)結構域的氨基酸序列。

圖41a是顯示了在鈣粘著蛋白交叉反應性試驗中用包含cad-11肽免疫原(紅線)或來自鈣粘著蛋白7、8、9、11、18、20和24的相應同源序列的肽滴定sdp051的曲線圖。肽涂覆濃度為500ng/ml。

圖41b是顯示了在鈣粘著蛋白交叉反應性試驗中用包含cad-11肽免疫原(紅線)或來自鈣粘著蛋白8和18的相應同源序列的肽滴定sdp051的曲線圖。肽涂覆濃度為50ng/ml。

圖42是sdp051與重組人cad-11(rhcad-11)結合的傳感圖(sensogramplot)。

圖43是顯示了如通過facs(平均熒光強度(mfi))測得的，人源化抗cad-11ec1抗體sdp051和sdp071與表達cad-11的431d-11細胞的抗體濃度依賴性結合的曲線圖。還顯示出不存在與非cad-11表達的431d細胞的結合。

圖44a-c是描繪使用一種測量相對于包含相關的cad-20或cad-24(圖44a)、cad-7或cad-18(圖44b)或者cad-8或cad-9(圖44c)抗原的肽，包含cad-11抗原的肽對如通過facs(平均熒光強度(mfi))所測定的sdp051抗體結合表達cad-11的細胞的能力的影響的分析而獲得的sdp051抗體對cad-11的特異性的圖。

圖45a和圖45b是描繪使用來自25個供體的pbmc通過免疫原性時間進程t細胞分析所測定的，(a)鼠/人嵌合抗cad-11ec1抗體syn0014和(b)人源化抗cad-11ec1抗體sdp051的免疫原性的圖。將各個一式三份的樣品的結果進行平均，并通過轉換為刺激指數(shù)(si)進行標準化。示出了各個供體在各個時間點的si。用于確定si≥2.0的陽性反應的臨界值用紅線突出顯示，且標示了顯著性反應(在studentt檢驗中p＜0.05)(*)。

圖46是示出與3μg/ml劑量的同種型對照抗體(ac1-p)相比，0.3μg/ml劑量的sdp-051抑制50％的fls侵入的圖。

圖47是示出與3μg/ml劑量的同種型對照抗體(ac1-p)相比，0.3μg/ml劑量的sdp-051抑制mmp表達的圖。

圖48是說明相對于用ac1-p對照抗體處理的小鼠，在sdp051處理的小鼠中關節(jié)腫脹減輕47％的圖。

圖49是描繪對小鼠(kbn關節(jié)炎模型)施用后sdp051抗體的血清水平的圖。

圖50是描繪相對于用ac3-11p對照抗體處理的小鼠，用不同劑量的sdp051抗體處理的小鼠中踝最小厚度(anklethickness)的變化的圖(鼠kbn關節(jié)炎模型；kbn024研究)。

具體實施方式

定義

如本文所用的術語“鈣粘著蛋白-11”、“cad-11”以及“ob-鈣粘著蛋白”是指天然存在的或內源性的鈣粘著蛋白-11(例如，哺乳動物，例如人類)蛋白質，以及與天然存在的或內源性的鈣粘著蛋白-11蛋白質具有相同的氨基酸序列的蛋白質(例如，重組蛋白、合成蛋白質)。因此，在本文中可互換使用的術語“鈣粘著蛋白-11”、“cad-11”以及“ob-鈣粘著蛋白”包括通過例如在哺乳動物(例如人類、非人靈長類)中自然發(fā)生的可變剪接或其他細胞過程所產(chǎn)生的鈣粘著蛋白-11蛋白質(例如，哺乳動物、人類)的多態(tài)性變體或等位基因變體以及其他同種型。優(yōu)選地，鈣粘著蛋白-11蛋白質是具有seqidno：2(見genbank登錄號np001788和圖15)的氨基酸序列的人類蛋白質。

如本文所定義的“鈣粘著蛋白-11拮抗劑”是特異性結合鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域并抑制(例如，降低、阻止)細胞中一種或多種鈣粘著蛋白-11-介導的活性的試劑(例如，抗體、融合蛋白、肽、擬肽、小分子、核酸)。鈣粘著蛋白-11-介導的活性包括但不限于：鈣粘著蛋白-11蛋白質以同型方式與一個或多個另外的鈣粘著蛋白-11蛋白質的結合、表達鈣粘著蛋白-11的細胞的聚集、酶(例如，膠原酶、絲氨酸蛋白酶、mmp1、mmp3、mmp13)的表達或活性的誘導以及細胞因子(例如，炎性細胞因子)或生長因子(例如，il-6、il-8或rankl或trance)的誘導、表達鈣粘著蛋白-11的細胞的遷移以及表達鈣粘著蛋白-11的細胞對軟骨的破壞。在一個實施方式中，鈣粘著蛋白-11拮抗劑可以通過，例如，阻斷cad-11蛋白質(例如，在細胞的表面上表達的cad-11蛋白質)的ec1結構域中的供體序列與一個或多個其他cad-11蛋白質(例如，在另一細胞的表面上表達的一個或多個cad-11蛋白質)的ec1結構域中的口袋序列之間的相互作用來抑制鈣粘著蛋白-11蛋白質與一個或多個另外的鈣粘著蛋白-11蛋白質的結合。

如本文所用的，“特異性結合”鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的鈣粘著蛋白-11拮抗劑是指結合(例如，在生理條件下)鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的親和力(例如，結合親和力)比該鈣粘著蛋白-11拮抗劑結合另一種鈣粘著蛋白蛋白質(例如，mn-鈣粘著蛋白、鈣粘著蛋白-8)的ec1結構域的親和力大至少約5倍、優(yōu)選地至少約10倍的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。在具體實施方式中，特異性結合鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的鈣粘著蛋白-11拮抗劑與存在于seqidno：3(人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的n端部分)中的表位結合，其親和力比該鈣粘著蛋白-11拮抗劑與存在于seqidno：4(人mn鈣粘著蛋白的ec1結構域的n端部分)中的表位結合的親和力以及該鈣粘著蛋白-11拮抗劑與存在于seqidno：5(人鈣粘著蛋白-8的ec1結構域的n端部分)中的表位結合的親和力大至少約5倍、優(yōu)選地至少約10倍。

如本文所用的術語“抗體”旨在涵蓋完整抗體以及抗體片段(例如，抗體的抗原結合片段，例如fv、fc、fd、fab、fab′、f(ab′)以及dab片段)?！翱贵w”是指多克隆抗體和單克隆抗體，并且包括自然生成的以及工程化的抗體。因此，術語“抗體”包括例如：人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、靈長類源化的(primatized)抗體、鑲飾的(veneered)抗體、單鏈抗體以及結構域抗體(dab)。(參見，例如harlow等人，antibodiesalaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，1988)。

術語“表位”是指被免疫球蛋白vh/vl對常規(guī)地結合的結構單元。表位限定了針對抗體的最小結合位點，并因此代表抗體特異性的靶標。

術語“融合蛋白”是指自然生成的、合成的、半合成的或重組的單一蛋白質分子，該蛋白質分子包含兩種或多種異源多肽的全部或一部分。

術語“多肽”是指氨基酸的聚合物，且不是指特定的長度；因此，肽、寡肽以及蛋白質均包括在多肽的定義中。

如本文所用的術語“肽”是指由大約2個至大約100個氨基酸殘基組成的化合物，其中一個氨基酸的氨基通過肽鍵連接另一個氨基酸的羧基。這樣的肽在長度上通常小于約100個氨基酸殘基，并且優(yōu)選地為約10個、約20個、約30個、約40個或約50個殘基。

如本文所用的術語“擬肽”是指不是肽或蛋白質但模擬它們的結構的多個方面的分子。擬肽拮抗劑可通過常規(guī)的化學方法來制備(參見例如，damewoodj.r.“peptidemimeticdesignwiththeaidofcomputationalchemistry”reviewsincomputationalbiology，2007，第九卷，1-80頁，johnwileyandsons，inc.，newyork，1996；kazmierskiw.k.，“methodsofmolecularmedicine：peptidomimeticprotocols，”humanapress，newjersey，1999)。

如本文所定義的“療法”是指對受試者(例如，哺乳動物、人)施用特定的治療性或預防性試劑，這產(chǎn)生對于受試者而言期望的治療或預防益處。

如本文所定義的“治療方案”是指其中將一種或多種治療性或預防性試劑以特定劑量(例如，水平、用量、數(shù)量)并且按特定的時間表或以特定的間隔(例如，數(shù)分鐘、數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月)施用給哺乳動物受試者的方案。

如本文所定義的“治療有效量”是指在施用條件下足以達到期望的治療或預防效果的量，諸如但不限于，足以抑制(即降低、預防)關節(jié)中的炎癥(例如，通過抑制表達鈣粘著蛋白-11的細胞如滑膜細胞的聚集)或腫瘤的形成、生長或轉移的量。療法的效力(例如，關節(jié)中炎癥的降低和/或關節(jié)中炎癥的預防)可以通過合適的方法(例如，成像方法，如mri、nmr、ct)來確定。

鈣粘著蛋白

鈣粘著蛋白屬于ca²⁺依賴性粘附分子的大家族，其通過以同型的方式與另外的鈣粘著蛋白結合來介導細胞粘附(mjwheelock和krjohnson，ann.rev.celldev.biol.19：207-235(2003))。典型的鈣粘著蛋白是單跨膜蛋白質，其含有五個細胞外鈣粘著蛋白(ec)結構域(各個結構域的長度大約為110個氨基酸)、一個跨膜區(qū)以及一個保守的胞質結構域?；谠趀c結構域之間的同源性程度而將鈣粘著蛋白分成i型或ii型鈣粘著蛋白。ii型鈣粘著蛋白包括人鈣粘著蛋白-5、-6、-8、-11和-12及mn-鈣粘著蛋白。各個胞外域在介導細胞間結合中的作用的相對重要性并不清楚。

滑膜細胞中鈣粘著蛋白-11的活性

鈣粘著蛋白-11介導在接合的關節(jié)的滑液內襯中滑膜細胞與滑膜細胞的結合(valencia等人，j.exp.med.200(12)：1673-1679(2004)；kiener和brenner，arthritisresther.7(2)：49-54(2005))。包含與人igg2的鉸鏈-ch2-ch3結構域融合的人鈣粘著蛋白-11的所有五個細胞外鈣粘著蛋白結構域的融合蛋白在體外抑制滑膜細胞內襯的形成(kiener等人，am.j.pathol.168(2006))。另外，拮抗性的抗鈣粘著蛋白-11抗體以及包含與鼠igg2a的鉸鏈-ch2-ch3結構域融合的鼠鈣粘著蛋白-11的ec1-5的融合蛋白在類風濕關節(jié)炎的鼠模型中抑制炎癥和關節(jié)腫脹(lee等人，science315：1006-1010(2007))。

鈣粘著蛋白-11拮抗劑

本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑可以是特異性結合鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域并抑制(例如，降低、阻止)細胞中一種或多種鈣粘著蛋白-11-介導的活性的任何試劑。鈣粘著蛋白-11-介導的活性包括但不限于：在細胞表面上表達鈣粘著蛋白-11的細胞的聚集以及諸如膠原酶、絲氨酸蛋白酶、mmp1、mmp3、il-6、il-8或rankl/trance的因子的表達或分泌。該試劑尤其可以是抗體、融合蛋白、肽、擬肽、小分子或核酸。

鈣粘著蛋白-11抗體

如本文所述，與包含供體序列和cad-11的鈣粘著蛋白結合口袋的人鈣粘著蛋白-11ec1結構域的n端部分(例如seqidno：3)內的表位相結合的抗體比與該蛋白質的其他區(qū)域中的表位相結合的抗體更有效地在體外阻斷鈣粘著蛋白-11的活性(參見實施例1和2)。

因此，在一個實施方式中，本發(fā)明提供與存在于鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的n端部分中的表位相結合(例如，特異性結合)的抗體或其抗原結合片段，該n端部分包含供體序列和cad-11的鈣粘著蛋白結合口袋。術語“抗體”旨在涵蓋所有類型的多克隆抗體和單克隆抗體(例如，人抗體、嵌合抗體、人源化抗體、靈長類源化的抗體、鑲飾的抗體、單鏈抗體、結構域抗體(dab))以及抗體的抗原結合片段(例如fv、fc、fd、fab、fab′、f(ab′)、dab)。(參見，例如harlow等人，antibodiesalaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，1988)。在具體的實施方式中，cad-11ec1結構域特異性抗體是人抗體或人源化抗體。cad-11ec1結構域特異性抗體還可直接或間接地連接細胞毒性劑。

其他特異性結合cad-11蛋白質的ec1結構域的n末端部分并且抑制該cad-11蛋白質的活性的抗體或抗體片段還可以通過常規(guī)方法或其他合適的技術來產(chǎn)生、構建、工程化和/或分離。例如，可針對適當?shù)拿庖咴缰亟M哺乳動物(例如，人)鈣粘著蛋白-11ec1結構域肽(例如seqidno：3)或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)產(chǎn)生對于鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域為特異性的抗體。已經(jīng)描述了多種方法(參見，例如kohler等人，nature，256：495-497(1975)和eur.j.immunol.6：511-519(1976)；milstein等人，nature266：550-552(1977)；koprowski等人，美國專利號4,172,124；harlow，e.和d.lane，1988，antibodies：alaboratorymanual，(coldspringharborlaboratory：coldspringharbor，ny)；currentprotocolsinmolecularbiology，第2卷(增刊27，94年夏季)，ausubel，f.m.等人編著，(johnwiley&sons：newyork，ny)，第11章，(1991))。還可以通過用表達鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的細胞(例如，癌細胞/細胞系)或經(jīng)工程化以表達鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的細胞(例如，轉染的細胞)免疫合適的宿主(例如，小鼠)來產(chǎn)生抗體。(參見，例如chuntharapai等人，j.immunol.，152：1783-1789(1994)；chuntharapai等人，美國專利號5,440,021)。為了產(chǎn)生單克隆抗體，可以通過將合適的永生細胞系(例如，骨髓瘤細胞系，如sp2/0或p3x63ag8.653)與產(chǎn)生抗體的細胞進行融合來產(chǎn)生雜交瘤?？梢詮挠酶信d趣的抗原免疫的人或其他合適的動物的外周血或優(yōu)選地脾或淋巴結獲得這些產(chǎn)生抗體的細胞。融合的細胞(雜交瘤)可以使用選擇性培養(yǎng)條件來分離，并且通過有限稀釋進行克隆?？梢酝ㄟ^合適的分析方法(例如，elisa)來選擇產(chǎn)生具有期望的特異性的抗體的細胞。

抗體片段可以通過酶切割或通過重組技術而產(chǎn)生。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割可以分別產(chǎn)生fab或f(ab′)2片段。其他具有必要的底物特異性的蛋白酶也可以用于產(chǎn)生fab或f(ab′)2片段。還可以使用抗體基因產(chǎn)生多種截短形式的抗體，在該抗體基因中將一個或多個終止密碼子引入自然終止位點的上游。例如，可將編碼f(ab′)2重鏈部分的嵌合基因設計成包括編碼該重鏈的ch1結構域和鉸鏈區(qū)的dna序列。本發(fā)明和術語“抗體”也涵蓋單鏈抗體及人的、嵌合的、人源化的或靈長類源化的(cdr移植的)或鑲飾的抗體，以及嵌合的、cdr移植的或鑲飾的單鏈抗體(包含來源于不同物種的部分)等。這些抗體的各個不同部分可通過常規(guī)技術化學地接合在一起，或可以使用基因工程技術作為連續(xù)的蛋白質制備。例如，可表達編碼嵌合鏈或人源化鏈的核酸以產(chǎn)生連續(xù)的蛋白質。(參見，例如cabilly等人，美國專利號4,816,567；cabilly等人，歐洲專利號0,125,023b1；boss等人，美國專利號4,816,397；boss等人，歐洲專利號0,120,694b1；neuberger，m.s.等人，wo86/01533；neuberger，m.s.等人，歐洲專利號0,194,276b1；winter，美國專利號5,225,539；winter，歐洲專利號0,239,400b1；queen等人，歐洲專利號0451216b1；以及padlan，e.a.等人，ep0519596a1。關于靈長類源化的抗體還可參見newman，r.等人，biotechnology，10：1455-1460(1992)，且關于單鏈抗體還可參見ladner等人，美國專利號4,946,778和bird，r.e.等人，science，242：423-426(1988))。

人源化抗體可以利用標準方法或其他合適的技術使用合成或重組dna技術來產(chǎn)生。編碼人源化可變區(qū)的核酸(例如cdna)序列還可以使用pcr誘變方法進行構建，以改變編碼人或人源化鏈的dna序列，例如來自先前人源化的可變區(qū)的dna模板(參見，例如kamman，m.等人，nucl.acidsres.，17：5404(1989))；sato，k.等人，cancerresearch，53：851-856(1993)；daugherty，b.l.等人，nucleicacidsres.，19(9)：2471-2476(1991)；以及l(fā)ewis，a.p.和j.s.crowe，gene，101：297-302(1991))。使用這些或其他合適的方法，也可以容易地產(chǎn)生變體。在一個實施方式中，可以對克隆的可變區(qū)(例如dab)進行突變，并且可以選擇編碼具有期望的特異性的變體的序列(例如，從噬菌體文庫；參見，例如krebber等人，u.s.5,514,548；hoogenboom等人，wo93/06213，于1993年4月1日公布)。

可以使用產(chǎn)生或分離具有必需特異性的抗體的其他合適的方法，包括例如從文庫(例如，噬菌體展示文庫)選擇重組抗體或抗體結合片段(例如，dab)的方法，或依賴于對轉基因動物(例如，小鼠)進行免疫的方法。能夠產(chǎn)生人抗體的所有種類的轉基因動物是本領域公知的(例如，(abgenix，fremont，ca))，并可以使用合適的方法產(chǎn)生(參見，例如jakobovits等人，proc.natl.acad.sci.usa，90：2551-2555(1993)；jakobovits等人，nature，362：255-258(1993)；lonberg等人，美國專利號5,545,806；surani等人，美國專利號5,545,807；lonberg等人，wo97/13852)。

在一個實施方式中，本發(fā)明包括與存在于人cad-11的ec1結構域的約前37個氨基酸(seqidno：13)中的表位相結合的cad-11抗體。在特定實施方式中，本發(fā)明涉及與存在于seqidno：10中的表位相結合的cad-11抗體。在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及與包含seqidno：11的表位相結合的cad-11抗體。在另一個實施方式中，本發(fā)明涉及與存在于seqidno：12中的表位相結合的cad-11抗體。

在一個實施方式中，本發(fā)明涉及由雜交瘤h1m1(atcc專利保藏號pta-9699)產(chǎn)生的cad-11抗體，該雜交瘤h1m1已經(jīng)于2009年1月8日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，p.o.box1549，manassas，virginia20108，美國。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供了由雜交瘤h14(atcc專利保藏號pta-9701)產(chǎn)生的cad-11抗體，該雜交瘤h14已經(jīng)于2009年1月9日保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)，p.o.box1549，manassas，virginia20108，美國。

本發(fā)明還包括與由雜交瘤h1m1產(chǎn)生的cad-11抗體和/或由雜交瘤h14產(chǎn)生的cad-11抗體特異性地競爭結合人cad-11蛋白質或其含ec1-結構域的部分(例如，seqidno：3、10、12、13)的抗體。在特定的實施方式中，與由雜交瘤h1m1和/或雜交瘤h14產(chǎn)生的cad-11抗體特異性競爭的抗體阻斷(例如，抑制、減少、防止)由雜交瘤h1m1和/或雜交瘤h14產(chǎn)生的cad-11抗體與人cad-11蛋白質或其含ec1-結構域的部分(例如，seqidno：3、10、12、13)的結合。

此外，本發(fā)明包括對人cad-11蛋白質或其含ec1-結構域的部分(例如，seqidno：3、10、12、13)具有至少與由雜交瘤h1m1產(chǎn)生的cad-11抗體和/或由雜交瘤h14產(chǎn)生的cad-11抗體對人cad-11蛋白質或其含ec1-結構域的部分的結合親和力同樣大的結合親和力的抗體。

鈣粘著蛋白-11融合蛋白

此外，僅含有人cad-11的ec1結構域的免疫球蛋白融合蛋白(例如，與人igg的一部分相融合的人cad-11的ec1結構域)比包括cad-11的ec區(qū)的較大部分(包含所有5個ec結構域)的融合蛋白更有效地在體外抑制cad-11的活性。

鈣粘著蛋白-11拮抗劑還包括嵌合的或融合的蛋白質，這些蛋白質包含與異源蛋白質的全部或一部分有效連接的人cad-11的ec1結構域的至少約n-末端的35個氨基酸(seqidno：2)。“有效連接”表示cad-11ec1結構域的部分與該異源蛋白質同框地融合。該異源蛋白質可以與該蛋白質的n-末端或c-末端融合。例如，該融合蛋白可以是其中蛋白質序列與gst序列的c末端融合的gst融合蛋白。其他類型的融合蛋白包括但不限于酶性融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合蛋白、酵母雙雜化gal融合蛋白、聚his融合體、flag-標記的融合蛋白、gfp融合蛋白以及免疫球蛋白(ig)融合蛋白。這種融合蛋白可以幫助純化(例如，重組融合蛋白的純化)。在某些宿主細胞(例如，哺乳動物宿主細胞)中，可以通過使用異源的信號序列來增加蛋白質的表達和/或分泌。因此，在另一個實施方式中，融合蛋白在其n末端包含異源的信號序列。

ep-a-o464533公開了包含免疫球蛋白恒定區(qū)的各個不同部分的融合蛋白。fc可用于治療和診斷，并因此產(chǎn)生，例如，改善的藥代動力學性質(參見，例如ep-a0232262)。在藥物發(fā)現(xiàn)中，例如，出于用來鑒別拮抗劑的高通量篩選分析的目的，已經(jīng)將人蛋白質與fc部分進行融合(bennett等人，journalofmolecularrecognition8：52-58(1995)；johanson等人，j.biol.chem.，270(16)：9459-9471(1995))。因此，本發(fā)明還包括可溶的融合蛋白，其包含本發(fā)明的蛋白質cad-11拮抗劑以及各個亞類(例如，igg、igm、iga、ige)的免疫球蛋白的重鏈和/或輕鏈恒定區(qū)的各個不同部分。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白的優(yōu)點包括以下的一個或多個：(1)由于得到的二聚融合蛋白的二價性，增加了對多價配體的親合力，(2)更長的血清半衰期，(3)經(jīng)由fc結構域激活效應細胞的能力，(4)易于純化(例如，通過蛋白a色譜法)，(5)對cad-11的親和力以及(6)阻斷cad-11介導的活性的能力。

因此，在特定的實施方式中，cad-11拮抗劑是包含與哺乳動物免疫球蛋白的全部或一部分有效連接的鈣粘著蛋白-11蛋白質的細胞外區(qū)域的一部分的融合蛋白，該細胞外區(qū)域的部分包括ec1結構域的n-末端部分(seqidno：2的氨基酸54-90)。在特定的實施方式中，本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白不包含鈣粘著蛋白-11的細胞外區(qū)域的一部分，該細胞外區(qū)域的部分包括在seqidno：2的氨基酸1-609內所包含的所有5個ec結構域。在某些實施方式中，人鈣粘著蛋白-11細胞外區(qū)域的部分可以包括例如seqidno：2的氨基酸1-160、氨基酸1-259或氨基酸1-269。在特定的實施方式中，融合蛋白缺乏人鈣粘著蛋白-11的前導序列和原區(qū)域(pro-region)(seqidno：2的氨基酸1-53)，并且使用了異源前導序列。免疫球蛋白部分可以來自任何脊椎動物來源，如鼠，但優(yōu)選地為人免疫球蛋白。在一個實施方式中，哺乳動物免疫球蛋白是人igg2蛋白質或其部分，如人igg2的鉸鏈-ch2-ch3部分。

本發(fā)明的嵌合蛋白或融合蛋白可以通過標準的重組dna技術產(chǎn)生。例如，編碼不同的蛋白質序列(例如，cad-11ec1結構域肽和哺乳動物免疫球蛋白)的dna片段按照常規(guī)技術同框地接合在一起。在另一個實施方式中，可以通過包括自動化dna合成儀在內的常規(guī)技術合成融合基因?；蛘撸梢允褂迷趦蓚€連續(xù)的核酸片段之間產(chǎn)生互補突出端的錨定引物進行核酸片段的pcr擴增，這些片段隨后可以退火和再擴增以產(chǎn)生嵌合核酸序列(參見，ausubel等人，currentprotocolsinmolecularbiology，1992)。此外，已經(jīng)編碼融合部分(例如，gst部分、fc部分)的許多表達載體可以購買得到。可以將編碼蛋白質cad-11拮抗劑的核酸分子克隆到這種表達載體中，使得融合部分(例如，免疫球蛋白)與該蛋白質同地連接。

本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可以作為單體、二聚體、四聚體或其他多聚體(例如，聚合體)提供。例如，融合蛋白的免疫球蛋白部分的可變域可以通過例如以下方式連接在一起以形成多價配體：提供在各個v結構域的c末端的鉸鏈區(qū)以及在該鉸鏈區(qū)中的半胱氨酸之間的二硫鍵；或提供在該結構域的c末端的各具有半胱氨酸的重鏈，這些半胱氨酸由二硫鍵連接在一起；或產(chǎn)生v-ch和v-cl以產(chǎn)生fab形式；或使用肽接頭(例如，gly4ser接頭)以產(chǎn)生二聚體、三聚體以及進一步的多聚體。例如，可將這樣的配體連接至包含ch2和ch3結構域中的一個或兩個且任選地含有鉸鏈區(qū)的抗體fc區(qū)。例如，作為連接至fc區(qū)的單一核苷酸序列的編碼配體的載體可以用于制備這類配體(例如，通過表達)。

本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可與包括但不限于聚乙二醇(peg)或其衍生物的多聚體(例如，聚甲基乙二醇)、放射性核素、細胞毒性劑和藥物的其他部分偶聯(lián)，并且隨后用于體內療法。放射性核素的實例尤其包括²¹²bi、¹³¹i、¹⁸⁶re和⁹⁰y。放射性核素通過局部照射細胞來發(fā)揮它們的細胞毒性效應，從而導致各種不同的細胞內損害，正如放射治療領域內所知的。可與融合蛋白偶聯(lián)的細胞毒性藥物包括但不限于，柔紅霉素、多柔比星、氨甲蝶呤以及絲裂霉素c。細胞毒性藥物干擾關鍵的細胞過程，包括dna、rna以及蛋白質合成。關于本領域已知的這些類別的藥物及其作用機制的更加充分的闡述，參見goodman，a.g.等人，goodmanandgilman′sthepharmacologicalbasisoftherapeutics，第8版，macmillanpublishingcol，1990，katzung，編，basicandclinicalpharmacology，第5版，768-769頁，808-809頁，896頁，appletonandlange，norwalk，conn。

如本文所用的術語“免疫球蛋白融合蛋白”包括本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白的片段。這樣的片段意圖包含于本發(fā)明的范圍內。例如，一旦分子被分離，它們就可以用蛋白酶進行切割以產(chǎn)生仍然能夠結合人cad-11的ec1結構域的片段。

肽拮抗劑

本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑還可以是與鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域結合的肽。該肽可以包含任何合適的l-氨基酸和/或d-氨基酸，例如常見的α-氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸)、非-α-氨基酸(例如，β-丙氨酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、肌氨酸、抑胃酶氨酸)以及不常見的氨基酸(例如，瓜氨酸、同型瓜氨酸、同型絲氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、鳥氨酸)。肽上的氨基、羧基和/或其他官能團可以是游離的(例如，未修飾的)或用合適的保護基保護的。用于氨基和羧基的合適的保護基以及用于添加或去除保護基的方法在本領域內是已知的，并公開于，例如green和wuts，“protectinggroupsinorganicsynthesis”，johnwileyandsons，1991中。肽的官能團也可以使用本領域已知的方法進行衍生化(例如，烷基化)。

如果需要，cad-11肽拮抗劑可以包含一種或多種修飾(例如，氨基酸接頭、?；?、乙?；?、酰胺化、甲基化、末端修飾(例如，環(huán)化修飾))。肽還可以包含化學修飾(例如，n-甲基-α-氨基取代)。此外，肽拮抗劑可以是已知的和/或天然存在的肽的類似物，例如具有保守氨基酸殘基置換的肽類似物。這些修飾可以改善肽的各種性質(例如，溶解度、結合)，包括其鈣粘著蛋白-11拮抗劑活性。

作為肽類的cad-11拮抗劑可以是線性的、分支的或環(huán)狀的，例如具有包括幾個酰胺鍵的雜原子環(huán)狀結構的肽。在特定的實施方式中，肽為環(huán)肽。這些肽可以由本領域技術人員使用標準技術產(chǎn)生。例如，肽可以通過酶切或化學切割從天然蛋白質衍生或去除，或者可以通過適當?shù)姆椒ɡ绻滔嚯暮铣?例如，梅里菲爾德型合成(merrifield-typesynthesis))進行合成(參見，例如bodanszky等人“peptidesynthesis”，johnwiley&sons，第2版，1976))。作為鈣粘著蛋白-11拮抗劑的肽還可以利用例如重組dna方法或其他合適的方法產(chǎn)生(參見，例如sambrookj.和russelld.w.，molecularcloning：alaboratorymanual，第3版，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，newyork，2001)。

肽可以合成并集合到包含少許至許多離散分子種類的文庫中。這類文庫可使用組合化學的方法來產(chǎn)生，并且可以使用任何合適的方法進行篩選以確定該文庫是否包含具有期望的生物活性的肽。然后，可以使用合適的方法分離這類肽拮抗劑。

擬肽拮抗劑

鈣粘著蛋白-11拮抗劑還可以是擬肽。例如，可以制備與肽具有相同的官能團的多糖。例如，可通過在其結合或將要結合靶分子的環(huán)境中建立肽試劑的三維結構來設計擬肽。擬肽包含至少兩種組分：一個或多個結合部分以及骨架或支持結構。

結合部分是將與靶分子(例如，與cad-11的ec1結構域中的氨基酸)進行反應或形成復合物(例如，通過疏水相互作用或離子相互作用)的化學原子或基團。例如，擬肽中的結合部分可以與肽或蛋白質拮抗劑中的結合部分相同。結合部分可以是以與肽拮抗劑中的結合部分相同或相似的方式與受體反應的原子或化學基團。例如，計算化學可用于設計鈣粘著蛋白-11蛋白質的ec1結構域的供體序列的肽模擬物，例如其可以結合cad-11蛋白質的ec1結構域中的口袋序列。適合用于針對肽中的堿性氨基酸設計擬肽的結合部分的實例包括含氮基團，如胺類、銨類、胍類以及酰胺類或磷鎓類。適合用于針對酸性氨基酸設計擬肽的結合部分的實例包括，例如羧基、低級烷基羧酸酯、磺酸、低級烷基磺酸酯或者亞磷酸或其酯。

支持結構是當與該一個或多個結合部分結合時提供該擬肽的三維構型的化學實體。支持結構可以是有機的或無機的。有機支持結構的實例包括多糖、有機合成聚合物的聚合體或寡聚體(如聚乙烯醇或聚交酯)。優(yōu)選的是支持結構具有基本上與該肽骨架或支持結構相同的大小和輪廓。這可以通過計算或測量肽和擬肽的原子和鍵的大小而確定。在一個實施方式中，肽鍵的氮可以用氧或硫代替，例如形成聚酯骨架。在另一個實施方式中，羰基可以用磺酰基或亞磺?；?，從而形成聚酰胺(例如，聚磺酰胺)?？梢灾苽湓撾牡姆聪蝓０?例如，用一個或多個-conh-基團替代-nhco-基團)。在又另一個實施方式中，肽骨架可以用聚硅烷骨架代替。

這些化合物可以通過已知的方法制備。例如，聚酯擬肽可以如下制備：用羥基取代氨基酸上對應的α-氨基從而制備羥酸，并順序酯化該羥酸，任選地封閉堿性和酸性側鏈以使副反應最小化。合適的化學合成路線的確定通?？稍诖_定化學結構時容易地確認。

可以合成擬肽并且將其集合至包含少許至許多離散分子種類的文庫中。這類文庫可以使用公知的組合化學方法來產(chǎn)生，并可進行篩選以確定該文庫是否包含一種或多種具有期望的活性的擬肽。然后，可以通過合適的方法分離這類擬肽拮抗劑。

小分子拮抗劑

鈣粘著蛋白-11拮抗劑還可以是小分子。小分子的實例包括：有機化合物、有機金屬化合物、無機化合物，以及有機、有機金屬或無機化合物的鹽。小分子中的原子通常通過共價鍵和/或離子鍵連接在一起。有機小分子中的原子的排列可以呈現(xiàn)為鏈(例如，碳-碳鏈或碳-雜原子鏈)，或者可以呈現(xiàn)為含有碳原子的環(huán)，例如苯或多環(huán)體系，或碳與雜原子的組合，即雜環(huán)，如嘧啶或喹唑啉。盡管小分子可以具有任意分子量，但它們通常包括小于約5,000道爾頓的分子。例如，這類小分子可以小于約1000道爾頓，并且優(yōu)選地小于約750道爾頓，或更優(yōu)選地小于約500道爾頓。小分子及其他非肽的鈣粘著蛋白-11拮抗劑可以在自然界中找到(例如，鑒定、分離、純化)和/或合成產(chǎn)生(例如，通過傳統(tǒng)的有機合成、生物介導的合成或其組合)。參見，例如ganesan，drugdiscov.today7(1)：47-55(2002年1月)；lou，drugdiscov.today，6(24)：1288-1294(2001年12月)。天然存在的小分子的實例包括但不限于，激素、神經(jīng)遞質、核苷酸、氨基酸、糖類、脂質以及它們的衍生物。

根據(jù)本發(fā)明的小分子鈣粘著蛋白-11拮抗劑及其生理學上可接受的鹽可以抑制鈣粘著蛋白-11蛋白質的同型結合(例如，通過直接與cad-11蛋白質的ec1結構域中的供體序列競爭結合另一鈣粘著蛋白-11的結合口袋，通過直接與cad-11蛋白質的ec1結構域中的結合口袋競爭結合另一鈣粘著蛋白-11的供體序列)。

核酸拮抗劑

本發(fā)明的cad-11拮抗劑還可以是與人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域結合的核酸分子(例如，寡核苷酸)。合適的核酸cad-11拮抗劑包括適體，該適體能夠通過經(jīng)典watson-crick堿基配對以外的相互作用以高親和力和特異性地與特定目標分子(例如，人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域)結合(tuerk和gold，science249：505(1990)；ellington和szostak，nature346：818(1990))。

適體，與通過噬菌體展示或單克隆抗體(mab)所產(chǎn)生的肽一樣，能夠特異性地與選定的靶標結合，并且通過結合阻斷它們的靶標發(fā)揮作用的能力。通過體外選擇過程從隨機序列寡核苷酸集合中產(chǎn)生，已經(jīng)針對包括生長因子、轉錄因子、酶、免疫球蛋白以及受體在內的100多種蛋白質產(chǎn)生了適體。典型的適體大小為10-15kda(30-45個核苷酸)，以亞納摩爾的親和力與其靶標結合，并區(qū)分密切相關的靶標(例如，通常不與來自相同基因家族的其他蛋白質結合)。一系列的結構研究已表明，適體能夠利用在抗體-抗原復合體中驅動親和力和特異性的相同類型的結合相互作用(氫鍵鍵合、靜電互補性、疏水接觸、空間排斥等等)。

可以使用在例如美國專利號5,475,096和美國專利號5,270,163中所述的被稱為“指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化”(selex)的標準過程來產(chǎn)生和鑒定與目標靶標(例如，人cad-11蛋白質的ec1結構域)相結合的適體。

鈣粘著蛋白-11拮抗劑的鑒定

可以在化學化合物和/或文庫(例如，化學物質、肽、核酸文庫)的篩選，例如高通量篩選中來鑒定具有鈣粘著蛋白-11結合特異性的試劑，包括小分子。

例如，可通過篩查可購買到的組合抗體文庫(dyaxcorp.，morphosysag)來鑒定特異性結合人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的抗體。適合的組合抗體文庫和篩查這些文庫的標準方法描述于hoet等人，naturebiotechnology23(3)：344-348(2005)以及rauchenberger等人，j.biol.chem.278(40)：38194-38205(2003)中，其內容通過引用并入本文。這些文庫或分子的集合也可以使用眾所周知的化學方法進行制備。

或者，例如，可以通過用ec1蛋白質結構域或ec1肽連同佐劑一起免疫小鼠從而破壞對該抗原的耐受性來鑒定特異性結合人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的鼠抗體?？梢葬槍ζ谕奶禺愋院突钚院Y選這些抗體，之后使用已知的技術進行人源化以產(chǎn)生用于治療人類疾病的合適的試劑。

可以從眾多可以獲得的化學化合物文庫中鑒定化合物或小分子，這些文庫來自，例如國家癌癥研究所的化學資源庫(thechemicalrepositoryofthenationalcancerinstitute)和分子文庫小分子資源庫(pubchem)，以及哈佛大學化學和細胞生物學研究所的文庫，以及其他可以從商業(yè)來源(例如chembridge，peakdale，cerep，maybridge，bionet)獲得的文庫。這類文庫或分子的集合也可以使用眾所周知的化學方法(如眾所周知的組合化學方法)進行制備。可以對文庫進行篩查以鑒定結合和抑制鈣粘著蛋白-11的化合物。

經(jīng)鑒定的化合物可以用作先導化合物以便使用公知的藥物化學方法來進一步多樣化。例如，可以制備并針對鈣粘著蛋白-11結合和/或抑制活性篩選作為先導物的結構變體的化合物的集合。這可以導致產(chǎn)生將化合物的結構與生物活性聯(lián)系起來的構效關系?？砷_發(fā)具有合適的結合和抑制活性的化合物以用于進一步的體內應用。

可進一步評估結合鈣粘著蛋白-11的試劑的鈣粘著蛋白-11拮抗劑活性。例如，包含鈣粘著蛋白-11蛋白質的組合物可用于篩選或結合試驗中以檢測和/或鑒定結合并拮抗鈣粘著蛋白-11蛋白質的試劑。適合使用的組合物包括，例如天然表達鈣粘著蛋白-11蛋白質的細胞(例如，滑膜細胞)、這些細胞的提取物以及重組鈣粘著蛋白-11蛋白質。

結合鈣粘著蛋白-11蛋白質的試劑可以在競爭性結合試驗中鑒定，例如，其中評估測試試劑抑制鈣粘著蛋白-11與參比試劑的結合的能力。該參比試劑可以是全長的cad-11蛋白質或其包含ec1結構域的部分。該參比試劑可以用適當?shù)臉擞浳?例如，放射性同位素、表位標記、親和性標記(例如，生物素和抗生物素蛋白或鏈霉親和素)、自旋標記、酶、熒光基團、化學發(fā)光基團、染料、金屬(例如金、銀)、磁珠)進行標記，并且可以確定在該試驗中使鈣粘著蛋白-11蛋白質達到飽和所需的標記參比試劑的量。可以使用合適的對照(例如，未標記的試劑、單獨的標記物)來確定在鈣粘著蛋白-11蛋白質與測試試劑之間復合物形成的特異性。

測試試劑抑制參比試劑與鈣粘著蛋白-11蛋白質之間復合物形成的能力可以確定為標記參比試劑的特異性結合的50％抑制所需要的測試試劑的濃度(ic50值)。特異性結合優(yōu)選地定義為總結合(例如，在復合物中的總標記物)減去非特異性結合。非特異性結合優(yōu)選地定義為在過量的未標記參比試劑存在下所形成的復合物中仍可檢測出的標記物的量。適合使用于該方法中的參比試劑包括特異性結合鈣粘著蛋白-11的分子和化合物，例如結合鈣粘著蛋白-11的抗體。

拮抗鈣粘著蛋白-11蛋白質的試劑可以通過篩選具有拮抗(降低、阻止、抑制)鈣粘著蛋白-11的一種或多種活性(例如結合活性(例如，同型的cad-11結合))的能力的試劑來鑒定。這些活性可以使用合適的體外或體內分析方法來評估。對于鈣粘著蛋白-11活性的示例性分析方法先前已經(jīng)有所描述(patel，sd，等人，cell124：1255-1268(2006)；lee等人，science315：1006-1010(2007))。

一旦鑒定了鈣粘著蛋白-11拮抗劑，就可以例如使用設計用于測量與鈣粘著蛋白-11相關的特定生物學功能或性質的基于細胞的分析來評估該鈣粘著蛋白-11拮抗劑干擾(例如，降低、抑制、陰止)細胞中與鈣粘著蛋白-11活性相關的一種或多種生物學功能或性質的能力。已知與鈣粘著蛋白-11的表達和/或活性相關的生物學功能和性質包括但不限于，細胞粘附、細胞遷移、細胞侵襲、細胞分選、細胞凝聚(cellcondensation)、細胞重排、組織完整性和結構的維持、細胞增殖的接觸抑制以及癌(例如，腫瘤)細胞的惡性轉化(kiener和brenner，arthritisresther.7(2)：49-54(2005))。此外，cad-11拮抗劑在此證明為抑制滑膜細胞產(chǎn)生活性mmp。用于評估鈣粘著蛋白的一種或多種生物學功能的合適的分析方法為本領域技術人員所知(參見，例如patel，sd等人，cell124：_1255-1268(2006))，并且包括，例如本文所描述的細胞聚集試驗(見示例，材料與方法部分)。

治療方法

不希望受任何一種理論所束縛，據(jù)信同型鈣粘著蛋白結合需要cad-11的ec1結構域的大約前35個氨基酸(例如，約33至約37個氨基酸)，并且特異性結合cad-11的該區(qū)域的試劑可以有效地抑制cad-11分子之間的結合。因此，這些試劑可用于治療和預防與細胞(例如，滑膜細胞)中cad-11的表達或活性相關的病癥(例如，炎性疾病、纖維化、癌癥)。因此，本發(fā)明的一個方面涉及用于治療哺乳動物受試者中鈣粘著蛋白-11介導的病癥的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的結合人鈣粘著蛋白-11ec1結構域肽(seqidno：3)的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。

如本文所用的，“鈣粘著蛋白-11介導的病癥”是指涉及表達鈣粘著蛋白-11蛋白質的細胞或由該細胞介導的(例如，引起的)疾病、病癥或狀況?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法治療的鈣粘著蛋白-11介導的病癥包括但不限于，炎性疾病(例如，炎性關節(jié)病癥)、纖維化病癥(例如，皮膚纖維化、肺纖維化)以及癌癥。

使用本發(fā)明的方法，可以通過施用一定量的本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑(例如，抗體、融合蛋白、小分子、核酸、肽、擬肽)來治療哺乳動物(例如，人)的鈣粘著蛋白-11介導的病癥，該量足以通過例如抑制細胞的聚集、或抑制細胞的遷移、或抑制表達鈣粘著蛋白-11的細胞(例如，滑膜細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞)表達活性蛋白酶或炎性分子而提供治療益處。

因此，本發(fā)明的一個方面涉及用于治療哺乳動物受試者的炎性疾病的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。炎性疾病通常以促炎性分子(例如，炎性細胞因子和生長因子)的表達以及免疫細胞(例如，巨噬細胞、單核細胞、淋巴細胞、漿細胞、白細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、t細胞)的激活為特征。炎性疾病包括，例如，炎性關節(jié)病癥、炎性腸病(例如，克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎)、銀屑病、皮炎(例如，濕疹)、腎淀粉樣變性、腎小球腎炎、脈管炎、盆腔炎性疾病、慢性前列腺炎、graves眼病。在特定的實施方式中，炎性疾病為自身免疫性疾病。

在特定的實施方式中，本發(fā)明涉及用于治療哺乳動物受試者的炎性關節(jié)病癥的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。炎性關節(jié)病癥可以是與接合關節(jié)的細胞(例如，滑膜細胞)中鈣粘著蛋白-11表達相關或以其為特征的任何病癥?？梢酝ㄟ^本發(fā)明治療的炎性關節(jié)病癥的實例包括但不限于，類風濕性關節(jié)炎、銀屑病性關節(jié)炎、萊特爾氏綜合征、強直性脊柱炎、幼年型慢性關節(jié)炎、慢性萊姆病以及與系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關的關節(jié)炎。在特定的實施方式中，炎性關節(jié)病癥是類風濕性關節(jié)炎。

在另一個方面，本發(fā)明涉及一種用于治療哺乳動物受試者的纖維化的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。如本文所用的術語“纖維化”是指作為修復性或反應性過程的器官或組織中過量纖維性結締組織的形成或發(fā)生。纖維化的實例包括但不限于血管纖維化(例如，與肺動脈高壓相關的血管纖維化)、腎纖維化、肝纖維化(例如，肝硬化)、皮膚/真皮纖維化(例如，硬皮病)、肺/肺部纖維化(例如，特發(fā)性肺纖維化)、骨髓纖維化、心內膜心肌纖維化、關節(jié)纖維化、間皮纖維化、眼纖維化、腸纖維化以及間質纖維化。在特定的實施方式中，纖維化是肺部或肺纖維化。在另一實施方式中，纖維化是真皮或皮膚纖維化。

不希望受任何特定理論所束縛，據(jù)信某些類型的腫瘤細胞表達鈣粘著蛋白-11，鈣粘著蛋白-11可以促進腫瘤轉移。因此，本發(fā)明的cad-11拮抗劑可用于抑制受試者中的腫瘤形成、生長和/或轉移。因此，在另一個方面，本發(fā)明涉及用于治療哺乳動物受試者的癌癥(例如，以表達cad-11的細胞為特征的癌癥)的方法，該方法包括對受試者施用治療有效量的本發(fā)明的鈣粘著蛋白-11拮抗劑。涉及到表達cad-11蛋白質的細胞的癌癥可包括，例如，白血病(例如，aml、cll、幼淋巴細胞性白血病)、肺癌(例如，小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、食管癌、胃癌、結直腸癌、腦癌(例如，星形細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細胞瘤)、膀胱癌、乳腺癌、宮頸癌、上皮癌、鼻咽癌(例如，口或喉鱗狀細胞癌)、淋巴瘤(例如，濾泡性淋巴瘤)、子宮癌(例如，惡性纖維性組織細胞瘤)、肝癌(例如，肝細胞癌)、頭頸癌(例如，頭頸鱗狀細胞癌)、腎癌、男性生殖細胞腫瘤、惡性間皮瘤、骨髓增生異常綜合征、卵巢癌、胰腺癌或膽管癌、前列腺癌、甲狀腺癌(例如，散發(fā)性濾泡性甲狀腺腫瘤)以及尿路上皮癌。

在一個方面，治療有效量的鈣粘著蛋白-11拮抗劑施用給需要的患者。將施用的鈣粘著蛋白-11拮抗劑的量(例如，治療有效量)可以由臨床醫(yī)生根據(jù)本文提供的指導及本領域已知的其他方法來確定，并且取決于幾種因素，包括例如選擇的特定藥劑、受試者的年齡、敏感性、對藥物的耐受性以及總體健康狀況。例如，對于作為抗體的cad-11拮抗劑，合適的劑量可以是每次治療約0.01mg/kg至約300mg/kg體重，并且優(yōu)選地每次治療約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約1mg/kg至約10mg/kg體重。對于小分子cad-11拮抗劑，合適的劑量可以是每次治療約0.001mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約100mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約1mg/kg體重。對于作為蛋白質或肽(線性、環(huán)狀、模擬物)的鈣粘著蛋白-11拮抗劑，合適的劑量將導致該肽的血漿濃度為約0.1μg/ml至約200μg/ml。確定對于特定的試劑、患者和癌癥的劑量完全在本領域技術人員的能力之內。優(yōu)選地，該劑量不引起或產(chǎn)生最小程度的不良副作用(例如，免疫原性反應、惡心、眩暈、胃部不適、高粘滯綜合征、充血性心力衰竭、中風、肺水腫)。

治療有效量的鈣粘著蛋白-11拮抗劑可以單獨施用或與一種或多種其他的治療劑(例如，抗炎劑、化學治療劑)聯(lián)合施用?？膳c本發(fā)明的cad-11拮抗劑聯(lián)合施用的用于治療炎性關節(jié)病癥(特別是ra)的合適的抗炎劑包括但不限于：(i)非類固醇類抗炎藥(nsaid；例如，detoprofen、雙氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenameate)、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮(nabumeone)、萘普生鈉、奧沙普秦、吡羅昔康、舒林酸、托美丁、塞來考昔、羅非考昔、阿司匹林、水楊酸膽堿、雙水楊酸酯以及水楊酸鈉和水楊酸鎂)；(ii)類固醇類(例如，可的松、地塞米松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)；(iii)dmard類，即緩解疾病的抗風濕病藥物(例如，環(huán)孢菌素、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、來氟米特、環(huán)磷酰胺、羥氯喹、柳氮磺吡啶、d-青霉胺、米諾環(huán)素和金)；或(iv)重組蛋白質(例如，(依那西普，一種可溶性的tnf受體)、(英夫利昔單抗，一種嵌合單克隆抗tnf抗體)、(阿巴西普(abatabacept)，一種可溶性的ctla4受體)、(托珠單抗，一種針對il-6受體的單克隆抗體)以及(利妥昔單抗，一種針對cd20的單克隆抗體)。

因此，鈣粘著蛋白-11拮抗劑可以作為聯(lián)合治療(例如，與一種或多種其他治療劑)的部分進行施用。cad-11拮抗劑可以在一種或多種其他治療劑之前、之后或與同時施用。在一些實施方式中，鈣粘著蛋白-11拮抗劑和其他治療劑可以作為單獨的制劑或作為聯(lián)合制劑同時地(例如，共同地)共施用。或者，這些藥劑可以作為單獨的組合物在由熟練的臨床醫(yī)生所確定的合適的時間范圍(例如，足以允許該療法的藥效疊加的時間)內順序施用。鈣粘著蛋白-11拮抗劑和一種或多種其他治療劑可以以單一劑量或以多劑量按照適于達到期望的治療效果(例如，關節(jié)炎癥的減輕和/或抑制)的順序和時間表進行施用。合適的劑量以及給藥方案可以由臨床醫(yī)生來確定，并取決于所選擇的藥劑、藥物制劑和給藥途徑、各種患者因素以及其他考慮因素。

療法的有效性(例如，關節(jié)炎癥的減輕或消除和/或關節(jié)炎癥的預防或抑制)可以通過任何合適的方法(例如，成像(mri、nmr))來確定。

根據(jù)本發(fā)明的方法，對哺乳動物受試者施用治療有效量的cad-11拮抗劑以治療炎性關節(jié)病癥。術語“哺乳動物受試者”在此定義為包括諸如靈長類(例如，人類)、牛、綿羊、山羊、馬、狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其他的?？啤⒕d羊科、馬科、犬科、貓科、嚙齒類以及鼠科物種的哺乳動物。

可通過多種途徑對哺乳動物受試者施用作為cad-11拮抗劑的試劑。例如，可通過任何合適的腸胃外或非腸胃外途徑(包括例如局部(例如，乳膏、軟膏)或經(jīng)鼻(例如，溶液、懸浮液))施用該試劑。腸胃外施用可以包括，例如關節(jié)內、肌肉內、靜脈內、心室內、動脈內、鞘內、皮下或腹膜內給藥。還可以經(jīng)口(例如，以膠囊、懸浮液、片劑或飲食形式)、經(jīng)皮、皮內、局部、通過吸入(例如，支氣管內、鼻內、經(jīng)口吸入或鼻內滴劑)、跨粘膜或經(jīng)直腸施用該試劑。視情況而定，施用可為局部給藥或全身給藥，且如果需要，可以同時使用一種以上的途徑。cad-11拮抗劑的局部施用可以通過關節(jié)內注射(例如，將試劑直接注射到關節(jié)中)來實現(xiàn)。優(yōu)選的施用模式可以根據(jù)選擇的具體試劑而發(fā)生變化。然而，對于抗體，通常優(yōu)選全身性的靜脈內或皮下給藥。

還可以通過注射至患者的腦部或體腔內，或通過使用延時釋放或持續(xù)釋放基質遞送系統(tǒng)，或通過使用膠束、凝膠和脂質體的原位遞送來實現(xiàn)遞送。霧化裝置、粉末吸入器以及霧化溶液是可用于對呼吸道施用這類制劑的代表性方法。遞送可以是體外、體內或離體的。

作為蛋白質(例如，融合蛋白)的試劑可經(jīng)由重組蛋白的體內表達來施用。可以根據(jù)適當?shù)姆椒ㄍㄟ^體細胞表達來實現(xiàn)體內表達(參見，例如美國專利號5,399,346)。此外，還可以將編碼該蛋白質的核酸引入逆轉錄病毒載體、腺病毒載體或其他合適的載體(優(yōu)選地，復制缺陷型傳染性載體)中用于遞送，或可以將其引入到能夠表達該蛋白質的轉染的或轉化的宿主細胞中用于遞送。在后一實施方式中，可以將所述細胞以有效量植入(單獨或在屏障裝置中)、注射或以其他方式引入以表達治療有效量的該蛋白質。

可以將基于核酸的鈣粘著蛋白-11拮抗劑(例如，適體)以多種方式引入到感興趣的哺乳動物受試者中。例如，核酸可以在宿主細胞中由表達載體或pcr產(chǎn)物內源性地表達，或將其包裝到合成的或工程化的組合物(例如，脂質體、聚合物、納米顆粒)中，該組合物然后可直接引入到哺乳動物受試者的血流中(通過，例如，注射、輸注)。還可使用已建立的基因治療策略和方案將抗鈣粘著蛋白-11核酸或核酸表達載體(例如，逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關以及單純皰疹病毒載體、工程化載體、非病毒介導的載體)直接引入到哺乳動物受試者中(參見，例如tochilinv.p.annurevbiomedeng8：343-375，2006；recombinantdnaandgenetransfer，officeofbiotechnologyactivities，nationalinstitutesofhealthguidelines)。

作為鈣粘著蛋白-11拮抗劑的試劑(例如，小分子)可以作為藥物組合物或生理學組合物的部分(例如作為包含鈣粘著蛋白-11拮抗劑和藥學上可接受的載體的藥物組合物的部分)施用給哺乳動物受試者。包含鈣粘著蛋白-11拮抗劑的制劑或組合物或者包含鈣粘著蛋白-11拮抗劑和一種或多種其他治療劑(例如，抗炎劑)的組合物將根據(jù)選定的施用途徑而變化(例如，溶液、乳劑或膠囊)。合適的藥用載體可以含有不與鈣粘著蛋白-11拮抗劑相互作用的惰性成分。可以采用標準的藥物配制技術，如在remington’spharmaceuticalsciences，mackpublishingcompany，easton，pa中所描述的那些技術。用于腸胃外施用的合適的藥用載體包括，例如無菌水、生理鹽水、抑菌鹽水(含有約o.9％mg/ml苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩沖鹽水、漢克斯溶液、林格氏乳酸鹽等。制劑還可以包含少量的提高活性成分的效力的物質(例如，乳化劑、增溶劑、ph緩沖劑、潤濕劑)。包封組合物的方法(如，在硬質明膠或環(huán)糊精(cyclodextran)的包衣中)是本領域已知的。為了吸入，可以將試劑溶解并載入用于施用的合適的分配器(例如，噴霧器或霧化器或加壓氣溶膠分配器)中。

藥劑可以作為中性化合物或作為鹽或酯來施用。藥學上可接受的鹽包括與游離的氨基形成的鹽，如衍生自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸或酒石酸的鹽；以及與游離的羧基形成的鹽，如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、鐵氫氧化物、異丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等的鹽。含有胺或其他堿性基團的化合物的鹽可通過例如與合適的有機酸或無機酸如氯化氫、溴化氫、乙酸、高氯酸等反應來獲得。含有季銨基團的化合物還含有平衡陰離子，如氯離子、溴離子、碘離子、醋酸根、高氯酸根等。含有羧酸或其他酸性官能團的化合物的鹽可通過與合適的堿(例如，氫氧化物堿)反應來制備。酸性官能團的鹽包含平衡陽離子，如鈉離子或鉀離子。

現(xiàn)在將通過以下實施例說明本發(fā)明，這些實施例并非旨在以任何方式進行限制。

示例

實施例1：對人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的n末端35個氨基酸內的表位具有結合特異性的fab的鑒定。

材料與方法

蛋白質印跡

通過sds-page分離蛋白質，并使用標準方法將其轉移到硝酸纖維素(nc)膜上。簡言之，用tris緩沖的生理鹽水-吐溫(tbst)(8.8g/l的nacl、0.2g/l的kcl、3g/l的tris堿、500μl/l的吐溫-20，ph調至7.4)漂洗nc膜。將該膜用溶解于tbst中的4％bsa在22℃下封閉1小時。將該nc膜用tbst漂洗3次，每次5分鐘。將小鼠抗人cad-11抗體在tbst中稀釋至0.5μg/ml，并將nc在22℃下孵育1小時。將nc膜于tbst中漂洗3次，每次5分鐘。將與辣根過氧化物酶(hrp)偶聯(lián)的山羊抗小鼠ig抗體在tbst中稀釋至1μg/ml，并且在22℃下將該nc膜在第二溶液中室溫(rt)孵育至少1小時。將該nc膜在tbst中漂洗3次，每次5分鐘。使用標準hrp方法使信號顯現(xiàn)。

elisa

將抗原(5μg/ml或50μg的cad-11-ec-1-fc或5μg/ml的鈣粘著蛋白肽)在緩沖液中稀釋并用于在4℃下涂覆平板過夜。洗滌平板，然后用pbs稀釋緩沖液(pbs中的1.5％bsa、2.5％低脂奶粉、0.1％吐溫-20)中的1.5％bsa、5％低脂奶粉封閉。然后，將平板與含有抗cad-11人fab或純化的抗cad-11人fab的細菌裂解液孵育1小時。洗滌后，施加第二抗體(1/100稀釋的cy5-偶聯(lián)的人fab)25分鐘。然后，洗滌平板并讀取產(chǎn)生的熒光。

結果

測試了三組以前報道的鈣粘著蛋白-11-特異性抗體與人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域相結合的能力。這些抗體包括在鈣粘著蛋白-11敲除或缺陷的小鼠中針對小鼠鈣粘著蛋白-11-fc融合蛋白免疫原產(chǎn)生的抗體(lee等人，science315：1006-1010(2007))、在鈣粘著蛋白-11野生型小鼠中針對已經(jīng)在cho細胞中產(chǎn)生的人鈣粘著蛋白-11-fc融合蛋白免疫原產(chǎn)生的抗體(valencia等人，j.exp.med.200(12)：1673-1679(2004))以及在鈣粘著蛋白-11野生型小鼠中針對細菌產(chǎn)生的包含人鈣粘著蛋白-11的ec1-3結構域的蛋白質而產(chǎn)生的抗體。通過蛋白質印跡分析測試這些抗體結合僅包含人cad-11的ec1結構域(鈣粘著蛋白-11-ec1-fc)、cad-11的ec1和ec2結構域(cad-11-ec1/2-fc)或cad-11的所有5個ec結構域(鈣粘著蛋白-11-ec1-5-fc)的融合蛋白的能力。在蛋白質印跡上，所測試的抗體都沒有識別ec1-fc或ec1-2-fc融合蛋白(圖1a)。然而，來自所測試的三組中每一組的抗體都識別包括細胞外結構域1至5的人cad-11-fc融合蛋白(圖1b)。這些結果表明，所測試的抗體不與人cad-11的ec1或ec2結構域結合，但卻識別該蛋白質的胞外區(qū)中其他地方的表位。

通過elisa測試了可獲得的結合表達cad-11的細胞的已公布的抗cad-11抗體13c2、23c6、5f82(lifespanscience)和283416(r&dsystems)以及cad-11ec1-結合抗體h1m1以及對照抗體mopc結合僅包含人cad-11的ec1結構域(鈣粘著蛋白-11-ec1-fc)或cad-11的所有5個ec結構域(鈣粘著蛋白-11-ec1-5-fc)的融合蛋白的能力。所測試的可獲得的已公布抗cad-11抗體都沒有識別ec1-fc(圖1b，空心柱)(在此沒有示出283416的數(shù)據(jù))。然而，結合cad-11ec1的h1m1抗體結合鈣粘著蛋白-11-ec1-fc以及鈣粘著蛋白-11-ec1-5-fc兩者(圖1b實心柱)。對照mopc抗體不結合兩種融合蛋白。這些結果表明，可獲得的已公布抗cad-11抗體不與人cad-11的ec1結構域結合，但卻識別在該蛋白質的胞外區(qū)中其他地方的表位。

為了產(chǎn)生對于人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的n末端35個氨基酸內的表位特異性的抗體，對編碼人fab的噬菌體展示文庫(morphosysag)進行篩選。使用兩種選擇標準——針對與包括人鈣粘著蛋白-11ec1結構域的前35個氨基酸的肽結合的陽性選擇，以及針對與來自兩個密切相關且高度同源的鈣粘著蛋白(鈣粘著蛋白-8和mn-鈣粘著蛋白)的ec1結構域的相應肽結合的陰性選擇——來對候選fab進行鑒別(圖2)。使用elisa來評估結合。

進行了兩次篩選。在第一次篩選中，通過elisa鑒定了96種結合鈣粘著蛋白-11ec1肽的fab克隆。七(7)種候選fab結合cad-11ec-1肽；然而，其中僅有兩種與ec-1肽和ec1-2-fc融合蛋白二者均結合。這兩種fab中的一種還與mn-cad肽相結合。因此，這7種fab克隆中僅有一種特異性結合ec1-fc融合蛋白，而不與mn-cad和鈣粘著蛋白-8ec1結構域肽結合。在第二次篩選中，觀察到了相似的結果，如此96種fab中僅有1種(克隆f9)顯示出對鈣粘著蛋白-11ec1肽和ec1-2-fc融合蛋白的特異性而不結合mn-cad和鈣粘著蛋白-8ec1結構域肽(圖3)。大多數(shù)所測試的結合cad-11ec1結構域的fab顯示出與mn-cad肽的交叉反應性，這種肽含有與cad-11的eeycar序列重疊的eeycar序列。

實施例2：結合鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的fab在體外試驗中抑制cad-11介導的細胞聚集

材料與方法

體外鈣粘著蛋白-11聚集試驗

431-d細胞在懸浮中生長，并且在正常情況下不表達任何鈣粘著蛋白且不發(fā)生聚集。已經(jīng)對431-d-11細胞進行了遺傳修飾以表達cad-11。當將431-d-11細胞在單獨的培養(yǎng)基中孵育時，它們在40分鐘內開始聚集，并且細胞團塊沉積到孔的底部，而可以測量剩余的未聚集的處于懸浮的細胞，并計算聚集的431-d-11的百分比。對于聚集試驗，使431-d-11細胞(d-11細胞)在燒瓶中生長至亞匯合狀態(tài)，之后使用0.05％胰蛋白酶加0.53mmedta將其從該燒瓶移除。將大約2×10⁶個431-d-11細胞添加到2ml的sme培養(yǎng)基(dulbecco改良eagle高葡萄糖培養(yǎng)基、0.1mhepes，ph7.4以及5u/ml的dna酶)中，并在缺乏或存在測試試劑(例如，抗體、fab、融合蛋白)的情況下將其在冰上預孵育15分鐘。與測試試劑預孵育之后，將細胞轉移至24孔板上的圓底孔中并在37℃下孵育，同時在旋轉搖床上以130rpm進行旋轉。由于細胞聚集，它們沉到孔的底部。在0min和40min時，從該孔中移取樣品中部的200μl并與25μl的8％戊二醛進行混合以固定細胞。將200μl固定的細胞樣品加入到9.8ml的庫爾特計數(shù)器等滲鹽水溶液中，并使用設定在8μm至24μm閾值的庫爾特計數(shù)器進行計數(shù)。每個樣品記錄3次細胞計數(shù)。計算在40min時與0min時間點的百分比相比細胞減少或聚集細胞的百分比。

結果

使用體外鈣粘著蛋白-11細胞聚集試驗測試了對于在鈣粘著蛋白-11ec1結構域的n末端35個氨基酸內的表位具有結合特異性的候選fab(克隆f9)(它不與mn-cad或cad-8的ec1結構域結合)抑制cad-11介導的細胞聚集的能力。該候選fab在1μg/ml或更低的濃度下顯著地抑制鈣粘著蛋白-11介導的細胞聚集(圖4和圖5)。相比之下，由與ec1/2結構域之外的cad-11胞外區(qū)中的表位相結合的13c2抗體制備的fab僅在10μg/ml的濃度下抑制鈣粘著蛋白-11的聚集，這提示與結合cad-11細胞外結構域的其他部分的抗體相比，f9fab能在更低的濃度下更有效地抑制cad-11的活性。

cad-11介導的細胞聚集也受到各種抗-鈣粘著蛋白-11ec1結構域fab的抑制，這些fab對于單獨的cad-11、cad-11和cad-8、cad-11和mn-cad或者cad-11、cad-8和mn-cad中任一是特異性的(圖6和圖7)。相對于對照樣品(例如，sme培養(yǎng)基)(圖6))，gfp特異性的fab(圖7))，測試的所有鈣粘著蛋白-ec1-結構域特異性fab都在體外抑制細胞的聚集。

實施例3：含有人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域的鈣粘著蛋白-11/免疫球蛋白融合蛋白的產(chǎn)生

使用以下寡核苷酸引物以將ecor1和bglii位點(參見分別在正向和反向引物中加下劃線的序列)引入到所擴增的產(chǎn)物中，利用在標準條件下進行的聚合酶鏈反應(pcr)，從編碼全長人鈣粘著蛋白-11cdna(克隆到invitrogen載體的not1和kpn-1位點中的人cad-11)的載體制備得到鈣粘著蛋白-11ec1區(qū)：

正向引物：

tttttttttgaattcatgaaggagaactactgtttacaagc(seqidno：8)

ecor1

反向引物：

tttttttttagatctctggaccttgacaatgaattccgacgg(seqidno：9)

bglii

用限制性內切酶ecor1和bglii消化擴增的產(chǎn)物，分離該消化產(chǎn)物并使用對應的ecor1和bglii位點將其接合到pfuse-higg2e1-fc1載體(invivogen)中。如生產(chǎn)商所述用該接合產(chǎn)物轉化top10感受態(tài)細菌(invitrogen)，并且用zeomycin選擇含有鈣粘著蛋白-11-ec1-fc質粒的細菌。將鈣粘著蛋白-11-ec1-fc質粒進行分離、測序，然后用來瞬時轉染293f細胞。收集條件化的培養(yǎng)基，并使用切向流過濾純化鈣粘著蛋白-11-ec1-fc融合蛋白(seqidno：9)，之后在50/50混合的蛋白a/蛋白g柱(在20mmhepesph7.4、137mmnacl、3mmkcl以及1mmcacl2中平衡)上分離。使用0.1m甘氨酸(ph3)和1mmcacl2將純化的鈣粘著蛋白-11-ec1-fc融合蛋白從柱上洗脫，并置于含有200μl的1mtrisph7.4和1mmcacl2的管中。然后，將含有cad-11融合蛋白的洗脫液用20mmhepes(ph7.4)、137mmnacl、3mmkcl以及1mmcacl2進行透析。通過sdspage確認蛋白質的大小(圖10)，并通過使用識別人fc區(qū)的抗體的蛋白質印跡分析(圖11)以及n末端測序(未示出)來證實其身份。使用與如上所述相似的技術和條件產(chǎn)生cad-11-ec1-2-fc。

實施例4：cad-11-ec1-fc免疫球蛋白融合蛋白在體外試驗中抑制cad-11介導的細胞聚集

材料與方法

細胞向基質膠小室中的侵入/遷移

在fls培養(yǎng)基(dulbecco改良eagle高葡萄糖培養(yǎng)基[sigma#d7777]、10％胎牛血清[benchmark#100-106]、1％青霉素-鏈霉素[gibco315140-122]、1％l-谷氨酰胺[gibco#25030]、0.5％慶大霉素[gibco#15710-064])中在基質膠ecm涂覆的轉移孔(transwell)中評估成纖維樣滑膜細胞(fls)的遷移活性。將含有1×10⁴個細胞的fls培養(yǎng)基中的人fls細胞懸液加入到對照插入物或基質膠涂覆的插入物中，所述插入物設置在含有0.750mlfls培養(yǎng)基的24孔板的孔中。然后，將這些板在37℃、5％co2氣氛下在濕潤的組織培養(yǎng)箱中孵育22個小時。

為了計算遷移的細胞的數(shù)目，通過用棉拭子擦拭而將非侵入細胞從對照插入物膜的上表面移除。重復進行使用由fls培養(yǎng)基濕潤的棉拭子的第二次擦拭。然后，將對照插入物固定，并用差異染色試劑盒[fisher#122-911]進行染色。將插入物干燥，并使用具有10×物鏡的顯微鏡在該對照插入物的4個象限中對細胞進行計數(shù)。對一式三份的插入物進行計數(shù)并將總數(shù)平均。

為了計算侵入基質膠插入物的細胞的數(shù)目，通過用棉拭子擦拭而將非侵入細胞從該基質膠插入物的表面輕輕地移除。重復進行使用由fls培養(yǎng)基濕潤的棉拭子的第二次擦拭。然后，將插入物固定，并用差異染色試劑盒[fisher#122-911]進行染色。將插入物干燥，并使用具有10×物鏡的顯微鏡在該對照插入物的4個象限中對細胞進行計數(shù)。對一式三份的插入物進行計數(shù)并將總數(shù)平均。

結果

cad-11-ec1-fc在3μg/ml的濃度下顯著地抑制細胞的聚集，而含有人cad-11的全部5個ec結構域的全長cad-11-ec1-5-fc蛋白質在100μg/ml的濃度下抑制cad-11介導的聚集(圖13)。這些數(shù)據(jù)表明，在體外試驗中，cad-11-ec1-fc免疫球蛋白融合蛋白有效地抑制cad-11介導的細胞聚集。

此外，在體外測試了cad-11-ec1-fc免疫球蛋白融合蛋白抑制人成纖維細胞樣滑膜細胞(fls)侵入基質膠小室中的能力。fls向基質膠中的侵入是一個復雜的過程，該過程涉及fls表達mmp1、mmp-3、mmp-13、絲氨酸蛋白酶及其他蛋白質以降解基質膠，以及fls向基質膠內的遷移。在單獨的試驗中，我們沒有看到對fls遷移通過正常纖維插入物的抑制。這提示ec-fc或13c2mab的作用是抑制基質膠(關節(jié)軟骨的代用品)的降解。在兩個獨立的實驗中，cad-11-ec1-fc以及鼠抗cad-11mab13c2均抑制fls向基質膠小室中的侵入。

實施例5：抗人鈣粘著蛋白-11的ec1結構域肽的抗體的產(chǎn)生

材料與方法

用0.01mg共價連接bsa的對應于人cad-11ec1結構域的前33個氨基酸(gwvwnqffvieeytgpdpvlvgrlhsdidsgdg(seqidno：10))的肽在足墊處每兩周一次對balb/c小鼠進行免疫，在一個月的時間中進行9次。這一肽在此稱為肽4。從經(jīng)免疫的小鼠得到脾，并與鼠融合伴體p3x63-ag8.653進行融合以生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。將這些雜交瘤擴增并以10、3或0.5個細胞/孔進行亞克隆，并且在elisa中針對特異性結合細菌中產(chǎn)生的含有cad-11ec1-2結構域的蛋白質的能力篩選來自雜交瘤的含有抗cad-11抗體的培養(yǎng)基。同時針對不存在與包含人cad-8和mn-鈣粘著蛋白的ec1-2結構域的蛋白質的結合來篩選來自這些肽4雜交瘤的含抗-cad-11抗體的培養(yǎng)基。在4℃下用0.05ml的0.0-0.3mg/ml的各ec1-2cad蛋白質涂覆96-孔eia板過夜，之后用鹽水緩沖液洗滌數(shù)次。然后，用0.25ml的酪蛋白-pbs緩沖液將板封閉，并用鹽水緩沖液洗滌數(shù)次。在22℃下在各個孔中將含有抗cad-11抗體的雜交瘤培養(yǎng)基純凈地孵育1小時，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl的山羊抗小鼠igg第二抗體的1/1000稀釋液加入到各個孔中，在22℃下孵育30分鐘，然后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl/孔的室溫tmb(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到各個孔中，并且使之在22℃下顯色5分鐘。用100μl的室溫的2n硫酸終止該反應，并且在wallac1420酶標儀上在450nm下讀板。

使用elisa進一步測試了h1m1和h14抗cad-11抗體針對cad-11、cad-7、cad-8、cad-20、cad-24、cad-9、cad-18以及mn-cad的ec1結構域的前33個氨基酸的特異性。合成了與cad-7、cad-8、cad-20、cad-24、cad-9、cad-18、mn-cad的區(qū)域(該區(qū)域與cad-11ec1結構域的g1-g33區(qū)域重疊)相對應的肽，并且將這些肽與生物素偶聯(lián)。將100μl的這些肽中的各肽于pbs-吐溫(0.05％)中的30ng/ml溶液在4℃下于96-孔netravidin板的各個孔中孵育2-3小時，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將各種濃度的抗cad-11抗體在各個孔中于22℃下孵育1小時，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl的山羊抗小鼠igg第二抗體的1/1000稀釋液加入到各個孔中，在22℃下孵育30分鐘，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl/孔的室溫tmb(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到各個孔中，并且使之在22℃下顯色5分鐘。用100μl的室溫的2n硫酸終止該反應，并且在wallac1420酶標儀上在450nm下讀板。

針對與表達cad-11的細胞結合的能力，對來自含有陽性抗cad-11抗體雜交瘤的孔的培養(yǎng)基進行測試。將冷凍的表達cad-11的431d細胞解凍，并且在含有ca²⁺的漢克斯平衡鹽溶液(hbss)(0.137mnacl、5.4mmkcl、0.25mmna2hpo4、0.44mmkh2po4、1.3mmcacl2、1.0mmmgso4以及4.2mmnahco)中洗滌兩次，之后以10⁶個細胞/ml重懸浮于含有ca²⁺的hbss中。用50％或16％的抗cad-11抗體培養(yǎng)基在冰上將10⁵個細胞/孔染色45min，在含有ca²⁺的hbss中洗滌兩次，用濃度為1％的與藻紅蛋白(phytoerytherin)(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)偶聯(lián)的山羊抗鼠igg第二抗體在冰上染色45分鐘，而后在含有ca²⁺的hbss中再洗滌兩次。然后，將細胞重懸浮于400μl含有ca²⁺和1％甲醛的hbss中，隨后在facscalibur(bectondickenson，franklinlakes，nj)上對pe陽性細胞進行分析。

結果

來自肽4雜交瘤的含有抗-cad-11抗體的培養(yǎng)基與cad-11ec1-2蛋白質結合(圖16，hl對cad-11)，而不與含有cad-8和mn-cad的ec1-2結構域的蛋白質結合(圖16，分別為hl對cad8和hl對mncad)。對照雜交瘤培養(yǎng)基不結合所測試的任何鈣粘著蛋白(圖16，培養(yǎng)基對cad-11、培養(yǎng)基對cad8和培養(yǎng)基對mncad)。這些數(shù)據(jù)證明了雜交瘤中針對肽4的cad-11特異性抗體的存在。

兩種肽4雜交瘤(在此稱為h1m1和h14)與表達人cad-11蛋白質的細胞結合(圖17a-c和圖17g-i)，但不與非cad-11對照431-d細胞結合(圖17d-17f)。被稱為h1m1的雜交瘤細胞系具有a.t.c.c.專利保藏號pta-9699，其已于2009年1月8日保藏。被稱為h14的雜交瘤細胞系具有a.t.c.c.專利保藏號pta-9701，其已于2009年1月9日保藏。這些雜交瘤含有體外識別肽4和表達cad-11的細胞的抗cad-11抗體。這些抗體與表達cad-11的細胞的結合顯示為用所使用的肽4抗體的量進行滴定，如在h1m1(圖18a)和h14(圖18b)的滴定相對于來自平均熒光強度(mfi)的細胞染色強度的圖中所示的。

結果表明，h1m1和h14肽4抗-cad-11抗體與cad-11的結合比所測試的任何其他鈣粘著蛋白(包括cad-7、cad-8、cad-20、cad-24、cad-9、cad-18以及mn-cad)高出100倍以上。在大多數(shù)情況下，沒有觀察到h1m1和h14抗cad-11抗體與其他鈣粘著蛋白的結合?？筩ad-11抗體h14顯示出與cad-11的強結合(圖19a)，與cad-8的結合低468倍(圖19a)，并且?guī)缀醪慌ccad-7、mn-cad、cad-9、cad-18、cad-20或cad-24結合(圖19b)。類似地，抗cad-11抗體h1m1顯示出與cad-11的強結合(圖20)，與cad-8的結合低1500倍，并且基本上不與cad-7、mn-cad、cad-9、cad-18、cad-20或cad-24結合(圖20)。

實施例6：抗cad-11ec1結構域抗體h1m1和h14結合包括氨基酸序列gpdp的cad-11ec1結構域中的表位

材料與方法

為了確定肽4cad-11ec1抗體h1m1和h14所結合的cad-11ec1結構域中的表位，將跨越ec1區(qū)的前37個氨基酸的4種不同的肽(見圖22)以elisa形式進行固定，并確定h1m1和h14抗體與這4種肽中的每一種相結合的能力。在4℃下用0.3ng/孔的肽1(cad-11ec1結構域的氨基酸g1-p18)、0.3ng/孔的肽2(cad-11ec1結構域的氨基酸g15-n34)、0.3ng/孔的肽3(cad-11ec1結構域的氨基酸v19-y37)、0.3ng/孔的免疫原肽4(cad-11ec1結構域的氨基酸g1-g33)、20ng的包括整個ec1結構域的融合蛋白(efl)或20ng的對照人ig(fc-段)將96-孔reactibind板涂覆過夜。將這些孔用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次，在22℃下用dh2o中的酪蛋白封閉3小時，之后用pbs-吐溫(0.05％)再洗滌兩次。將不同的肽4cad-11ec1結構域抗體的各個稀釋液轉移到肽或蛋白質涂覆的孔中，在22℃下孵育45min，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl的山羊抗小鼠igg第二抗體(jacksonimmunoresearch，westgrove，pa)的1/1000稀釋液加入到各個孔中，在22℃下孵育30分鐘，而后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl/孔的室溫tmb試劑加入到各個孔中，并且使之在22℃下顯色5min。用100μl的室溫2n硫酸終止反應，并且在wallac1420酶標儀上在450nm的波長下讀板。

結果

在該elisa中，正如相對于對照物提高的od450板讀數(shù)所示的，1∶11的肽4抗-cad-11抗體h1m1(圖21a)以及1∶23的肽4抗-cad-11抗體h14(圖21b)均結合肽4(pep4)免疫原以及ec1結構域融合蛋白(efl)。這些抗體均不與人igg對照(fc段)結合。此外，在該elisa中，這兩種抗體均結合肽2(pep2)，但不結合肽1(pep1)或肽3(pep3)(圖21a和圖21b)。

這些結果提示，抗cad-11ec1結構域抗體h1m1和h14結合肽2和4中的共同表位，該表位不存在于重疊的肽3中。位于肽3上游的、肽2和肽4所共有的氨基酸在圖22中所示的加框區(qū)域中突出顯示。從cad-11ec1結構域的g15開始的這4個氨基酸gpdp(seqidno：11)很可能是由h1m1和h14抗體所識別的表位的部分。

實施例7：抗cad-11ec1結構域抗體h1m1和h14在體外抑制表達cad-11的細胞的聚集

材料與方法

為了評估cad-11抗體抑制cad-11介導的細胞聚集的能力，將30μg/ml的h1m1肽4抗體與75,000個表達cad-11的a-431-d表皮樣癌細胞在24-孔圓底聚丙烯板中在0.5ml的dmem-高葡萄糖、20mmhepesph7.4、10％fcs以及10u/mldna酶中培養(yǎng)。將24-孔板放置在大約60rpm的旋轉平臺上，并在37℃下用5％co2孵育過夜。第二天，在100×(對于h1m1實驗)或40×(對于h14實驗)放大倍數(shù)下對這些板拍照，之后評估細胞的聚集。

結果

在對照同種型抗體(30μg/ml)的存在下，表達cad-11的細胞形成了大團塊(圖23a)，而親本cad-11陰性細胞保持為單一或雙重細胞群(圖23c)。h1m1處理的cad-11細胞保持為小的細胞團(圖23b)，這些細胞團沒有進一步發(fā)展以形成使用對照抗體所獲得的大團塊。

使用相同的試驗，抗cad-11抗體h14還顯示出抑制cad-11-介導的聚集。雖然表達cad-11的親本細胞形成了大的細胞簇(圖24a)，但h14抗體(圖24b)在30μg/ml的濃度下抑制聚集，因為細胞簇小而稀少。這些結果表明，抗cad-11抗體h1m1和h14在體外抑制cad-11介導的細胞聚集。

實施例8：抗cad-11ec1結構域抗體h1m1和h14在類風濕性關節(jié)炎鼠模型中在體內抑制關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹

材料與方法

研究1——在第0天和第2天給六周齡雄性c57/bl6小鼠注射150μl的kbn血清。經(jīng)kbn血清處理的小鼠接受鹽水注射(圖25，空心的三角形)或用不同劑量的h1m1抗-cad-11ec1抗體進行處理。處理方案包括：在第0天以0.5mg抗體/小鼠給藥，并且在之后每隔一天(q2d)以0.1mg抗體/小鼠(0.5mg+0.1mg)給藥(圖25，實心三角形)；在第0天以0.5mg抗體/小鼠(0.5mg)給藥(圖25，菱形)；每隔一天(q2d)以0.1mg抗體/小鼠(0.1mg+0.1mg)給藥(圖25，正方形)；或每隔一天(q2d)以0.3mg抗體/小鼠(0.3mg+0.3mg)給藥(圖25，圓形)。對照組由5只小鼠組成，而處理組由7只小鼠組成。通過每隔一天進行的卡尺測量來確定關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹。

研究2——在第0天和第2天給六周齡雄性c57/bl6小鼠注射150μl的kbn血清，之后每隔一天(q2d)用鹽水進行處理(圖26，三角形)，或用抗cad-11抗體h1m1(圖26，正方形)或h14(圖26，圓形)之一以0.3mg/劑量每隔一天進行處理。對照組由5只小鼠組成，而處理組由7只小鼠組成。通過每隔一天進行的卡尺測量來確定關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹。

結果

研究1——相對于對照小鼠，h1m1抗-cad-11抗體抑制了關節(jié)腫脹。通過每隔一天0.3mg的h1m1抗體對kbn處理的小鼠進行給藥觀察到對關節(jié)炎相關的關節(jié)腫脹的最大抑制(圖25，圓形)。

研究2——相對于對照，兩種抗cad-11抗體均抑制了關節(jié)腫脹。在這項研究中，與對照動物相比，h14抗體顯著地延遲了關節(jié)炎的發(fā)作(圖27)。在對照組中的所有小鼠到第3天都發(fā)展為關節(jié)炎，而h14處理的小鼠需要6天才使所有動物發(fā)展成關節(jié)炎。

這些研究表明，抗人cad-11的ec1結構域的抗體可以在體內抑制關節(jié)炎的發(fā)生和嚴重程度。

實施例9：抗人鈣粘著蛋白-11的另一ec1結構域肽的抗體的產(chǎn)生

材料與方法

用0.01mg共價結合bsa的對應于人cad-11ec1結構域的19個氨基酸的肽v19-y37(vlvgrlhsdidsgdgniky(seqidno：12))在足墊處每兩周一次對balb/c小鼠進行免疫，在一個月時間內進行9次。這種肽在此稱為肽3。從免疫的小鼠中得到脾臟，并與鼠融合伴體p3x63-ag8.653融合以生成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。將這些雜交瘤擴增，并針對與細菌中產(chǎn)生的對應于cad-11的ec1-2結構域的蛋白質相結合的能力來篩選來自雜交瘤的含抗cad-11抗體的培養(yǎng)基。同時，針對不存在與包含cad-8和mn-鈣粘著蛋白的ec1-2結構域的蛋白質的結合篩選來自這些肽3雜交瘤的含抗-cad-11抗體的培養(yǎng)基。在4℃下用0.05ml的0-300mg/ml的各ec1-2cad蛋白質之一或cho細胞產(chǎn)生的ec1-fc融合蛋白將96孔eia板涂覆過夜，之后用鹽水緩沖液洗滌數(shù)次。然后用0.25ml的酪蛋白-pbs緩沖液封閉板，且隨后用鹽水緩沖液洗滌數(shù)次。將含有肽3抗cad-11抗體的雜交瘤培養(yǎng)基在22℃下純凈地于各個孔中孵育1小時，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl的山羊抗小鼠igg第二抗體的1/1000稀釋液加入到各個孔中，在22℃下孵育30分鐘，之后用pbs-吐溫(0.05％)洗滌兩次。將100μl/孔的室溫tmb(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)試劑加入到各個孔中，并且使之在22℃下顯色5分鐘。用100μl的室溫的2n硫酸終止反應，并在wallac1420酶標儀上于450nm下讀板。

還測試了來自肽3雜交瘤的培養(yǎng)基與細胞上表達的人cad-11蛋白質結合的能力。將冷凍的表達cad-11的431d細胞解凍，并且在含有ca²⁺的hbss中洗滌兩次，之后以10⁶個細胞/ml重懸浮于含有ca²⁺的hbss中。用50％或16％的抗cad-11抗體培養(yǎng)基在冰上染色10⁵個細胞/孔45分鐘，在含有ca²⁺的hbss中洗滌兩次，之后用濃度為1％的與藻紅蛋白偶聯(lián)的山羊抗小鼠igg第二抗體在冰上染色45分鐘，之后在含有ca²⁺的hbss中再洗滌兩次。然后，將細胞重懸浮于400μl含有ca²⁺和1％甲醛的hbss中，隨后在facscalibur上對pe陽性細胞進行分析。

結果

來自肽3雜交瘤的含有抗-cad-11抗體的培養(yǎng)基與cad-11ec1-2蛋白質以及ec1-fc融合蛋白結合(圖28，分別為hl對cad-11以及hl對cad-11-ec1)，但不與包含cad-8和mn-cad的ec1-2結構域的蛋白質結合(圖28，分別為hl對cad8以及hl對mncad)。對照雜交瘤培養(yǎng)基不與任何鈣粘著蛋白蛋白質結合(圖28，培養(yǎng)基對cad-11、培養(yǎng)基對cad8以及培養(yǎng)基對mncad)。

來自肽3雜交瘤的抗cad-11抗體還與表達人cad-11蛋白質的細胞結合(圖29，見箭頭)，但不與表達neos的非cad-11表達的對照細胞結合。該結果證實：在這些雜交瘤中存在體外識別肽3和表達cad-11的細胞的抗cad-11抗體。

實施例10：抗cad-11ec1結構域特異性抗體h1m1在體外阻止人原代成纖維細胞樣滑膜細胞的聚集。

材料與方法

聚集試驗

在該試驗中，將人成纖維細胞樣滑膜細胞(fls)系在fls培養(yǎng)基(dmem、10％fcs、1％青霉素-鏈霉素、1％l-谷氨酰胺、0.05％慶大霉素、1％hepes)中培養(yǎng)直至90-100％匯合。試驗當天，將培養(yǎng)基從fls去除，并用0.05％的胰蛋白酶-edta將細胞從燒瓶中移出，用mm培養(yǎng)基(dmem、10％fcs、1％青霉素-鏈霉素、1％l-谷氨酰胺、0.05％慶大霉素、1％hepes)洗滌，之后用含有鈣的hbs(0.137mnacl、5.4mmkcl、0.25mmna2hpo4、0.44mmkh2po4、1.3mmcacl2、1.0mmmgso4以及4.2mmnahco)洗滌兩次。將胰蛋白酶消化的fls在mm培養(yǎng)基中重懸浮達到4×10⁴個細胞/ml，并將2×10⁴個細胞/孔置于含有單獨的培養(yǎng)基、同種型對照抗體或30μg/ml的各種抗cad-11抗體的24孔盤中。將該板在5％co2培養(yǎng)箱中孵育24小時，第二天用光學顯微鏡檢查各孔并拍照。

fls侵入試驗

為了測試h1m1抗體抑制fls侵入由多種細胞外基質蛋白質組成的基質膠的能力，采用了使用基質膠分離孔系統(tǒng)的侵入試驗。fls生物學的這種體外模型模擬fls降解并鉆入人接合關節(jié)中的軟骨中的能力。在該試驗中，將人fls細胞系在flsmm培養(yǎng)基中培養(yǎng)直至90-100％匯合。在試驗開始前一天，將fls在不含血清的fls培養(yǎng)基中進行血清饑餓24小時。試驗當天，將培養(yǎng)基從血清饑餓的fls移除，并用0.05％的胰蛋白酶-edta將細胞從燒瓶中移出，用mm培養(yǎng)基洗滌，之后用含有鈣的hbs洗滌兩次。將胰蛋白酶消化的fls在mm培養(yǎng)基中重懸浮以達到4×10⁵個細胞/ml。將制備的基質膠包被的插入物放在包含具有fcs的mm培養(yǎng)基的24孔板中，fcs作為fls的有絲分裂原。在該室的另一側，將不含抗體或含有兩倍工作濃度的處理抗體的50μl的mm培養(yǎng)基引入各孔中，該mm培養(yǎng)基中加入了50μl的4×10⁵個細胞/ml的細胞懸液。將含有fls和抗體的室在37℃的培養(yǎng)箱中孵育18小時。

24小時之后，將具有細胞的插入物在甲醇中固定，將粘附在基質膠包被的膜外面的fls用棉拭子去除，并將該膜干燥，之后用碘化丙啶(pi)于室溫下在黑暗中染色30min。去除pi染色劑并將插入物用d-葡萄糖(1mg/ml)洗滌，之后在黑暗中干燥。將膜切下并使用熒光顯微鏡在載玻片上成像，并定量遷移至膜中的fls的數(shù)目。

結果

與培養(yǎng)基或對照抗體一起孵育的fls形成了細胞聚集物和通過細胞突關聯(lián)的廣泛細胞網(wǎng)絡(圖30a和圖30b)。相反，用抗cad-11抗體h1m1處理的細胞只形成了很少的細胞聚集物和很少的連接(圖30c)。

在使用不同的原代人fls的一系列fls侵入試驗中，30μg/ml的h1m1抗體始終抑制fls向膜內的侵入。尤其是，30μg/ml劑量的h1m1與對照抗體相比抑制了80％的fls侵入。這種活性比使用結合在ec1區(qū)外的其他cad-11抗體(包括13c2抗體)觀察到的活性更高(圖31)。

實施例11：在kbn關節(jié)炎小鼠模型中h1m1抗體抑制關節(jié)腫脹

材料與方法

在kbn關節(jié)炎模型中測試了抗cad-11抗體h1m1，在該模型中，通過在第0天和第2天施用2劑75μlkbn血清來誘發(fā)疾病。從第0天開始每隔一天向7只雄性c57bl/6小鼠的組腹膜內施用10mg/kg的h1m1，并且每天監(jiān)測小鼠的關節(jié)腫脹。在踝關節(jié)處于完全屈曲位時在踝部使用帶彈簧的帶表卡尺(longislandindicatorservice，hauppauge，ny)測量關節(jié)腫脹或踝最小厚度。

結果

與對照組相比，h1m1抗體抑制了53％的關節(jié)腫脹(p＜0.001)(圖32)。

實施例12：h1m1可變結構域和互補決定區(qū)的測序

材料與方法

從產(chǎn)生h1m1的雜交瘤細胞的3個克隆(h1、h17和h27)中提取rna。對于iggvh、igmvh、igκvl和igλvl中每一種使用恒定區(qū)引物采用鼠信號序列的簡并引物池來進行rt-pcr。使用一組6個簡并引物池(ha至hf)來擴增重鏈可變(v)區(qū)rna，并對于κ簇使用一組7個簡并引物池(κa至κg)和對于λ簇使用1個簡并引物來擴增輕鏈v區(qū)mrna(見表1)。

對于所有rna樣品，從利用iggvh逆轉錄引物結合重鏈引物池b和e逆轉錄的rna獲得來自重鏈的擴增產(chǎn)物。從igκvl逆轉錄引物以及κ輕鏈引物池b、c和g獲得擴增產(chǎn)物。將來自上述各個池的pcr產(chǎn)物純化并克隆，并對于各產(chǎn)物的至少4個克隆進行測序。

對于產(chǎn)生h1m1的克隆h1、h17和h27，針對各個樣品確定單一功能性重鏈和輕鏈v區(qū)序列，并且發(fā)現(xiàn)這三種抗體是相同的(表2)。重鏈和輕鏈v區(qū)序列以及它們的cdr序列分別在圖33和圖34中示出。

來自三個h1m1雜交瘤克隆的重鏈和輕鏈v區(qū)顯示與它們的最接近的人類種系序列具有良好的同源性(分別為64％和82％)，并且單獨的框架序列在人類種系數(shù)據(jù)庫中具有接近的同源物(表2)。這種高度的同源性降低了需要深度的工程化來產(chǎn)生成功的人源化抗體的可能性。

表2：h1m1雜交瘤克隆h1、h17和h27的序列分析

^a根據(jù)kabat的cdr定義和序列編號

^b示出的種系id后為％同源性

實施例13：人源化抗cad-11抗體的產(chǎn)生

人源化抗cad-11抗體可變區(qū)序列的設計

使用swiss蛋白質數(shù)據(jù)庫得到產(chǎn)生在此所描述的鼠h1m1單克隆抗體(也稱作syn0012抗體)的抗體可變(v)區(qū)的結構模型，并進行分析以鑒定v區(qū)中重要的“限制”氨基酸，據(jù)預測該氨基酸對于syn0012/h1m1抗體的結合性質是必要的。包含在cdr中的殘基(使用kabat和chothia定義)連同多個框架殘基被認為是重要的。syn0012/h1m1抗體的vh和vκ序列均含有典型的框架殘基，且cdr1、2和3基序與許多鼠抗體相當。

從上述分析，可認為syn0012/h1m1抗體的復合人類序列可以用cdr之外的大范圍的備選殘基來構建，而在cdr序列內僅有窄選擇范圍的可能的備選殘基。初步分析表明，可以合并來自幾種人抗體的相應序列片段以產(chǎn)生與鼠syn0012/h1m1抗體序列中的cdr相似或相同的cdr。對于cdr之外和cdr側翼的區(qū)域，鑒定寬選擇范圍的人類序列片段作為人源化抗cad-11抗體v區(qū)的可能成分。

變體的設計

基于上述分析，選擇并分析可用于產(chǎn)生syn0012人源化抗cad-11抗體變體的大的初步序列片段集用于與人類mhcii類等位基因結合的肽的計算機分析(perry等人，2009)，并使用與已知抗體序列相關的t細胞表位的tcedtm(英國劍橋antitopellc的t細胞表位數(shù)據(jù)庫)(brysonc，jonestd和bakermp.predictionofimmunogenicityoftherapeuticproteins：validityofcomputationaltools.biodrugs2010，24(1)：1-8)。舍棄被鑒定為人類mhcii類的顯著非人類種系結合物的序列片段或對于tcedtm評分為顯著命中的序列片段。這產(chǎn)生縮減的片段集，并如上所述再次分析它們的組合以確保片段之間的接合不包含潛在的t細胞表位。之后將選定的片段組合以產(chǎn)生重鏈和輕鏈v區(qū)序列用于合成。對于syn0012人源化抗cad-11抗體變體，利用圖35a-35h中詳述的序列設計5個vh鏈(vh1-vh5；seqidno：61、63、65、67、69)和3個vκ鏈(vκ1-vκ3；seqidno：71、73、75)。

復合人抗體變體的構建

使用一系列經(jīng)退火、連接和pcr擴增以得到全長合成v區(qū)的重疊寡核苷酸，合成syn0012/h1m1的所有變體復合人抗體vh和vκ區(qū)基因。使用mlui和hindiii位點克隆組裝的vh變體，并使用bsshii和bamh1限制性酶切位點將組裝的vκ變體直接克隆至用于igg4(s241p)vh鏈和vκ鏈的pant表達載體系統(tǒng)(antitope，英國劍橋)中(圖36)。所有構建體都通過測序進行確認。

抗體的構建、表達和純化

將復合人源化igg4(s241p)vh和vκ鏈的所有15種組合經(jīng)由電穿孔穩(wěn)定地轉染至ns0細胞中，并使用200nm的氨甲蝶呤(sigma目錄號m8407，sigmaaldrich，uk)進行選擇。使用igg4elisa測試各種構建體的氨甲蝶呤抗性集落的igg表達水平，并選擇表達最好的細胞系，將其擴增并在液氮中冷凍。成功地產(chǎn)生了表達15種人源化抗體變體中的各種的細胞。

利用蛋白a瓊脂糖柱(gehealthcare目錄號110034-93)從ns0細胞培養(yǎng)上清液中純化被命名為sdp011(vκ1/vh1)、sdp021(vκ1/vh2)、sdp031(vκ1/vh3)、sdp041(vκ1/vh4)、sdp051(vκ1/vh5)、sdp061(vκ2/vh1)、sdp071(vκ2/vh2)、sdp081(vκ2/vh3)、sdp091(vκ2/vh4)、sdp101(vκ2/vh5)、sdp111(vκ3/vh1)、sdp121(vκ3/vh2)、sdp131(vκ3/vh3)、sdp141(vκ3/vh4)和sdp151(vκ3/vh5)的syn0012的15種人源化igg4(s241p)復合變體，并使用基于預測的氨基酸序列的消光系數(shù)(ec(0.1％)＝1.51)根據(jù)od280nm將抗體量化。在鼠igg1抗cad-11ec1抗體(syn0011)純化期間注意到，抗體在ph大約為7.5下沉淀為絮凝物；因此在酸洗脫后將所有抗體中和至ph大約6.5，并將緩沖液更換為10mm的醋酸鈉緩沖液ph5.5(1.4mm醋酸、8.6mm醋酸鈉)。純化各人源化抗cad-11抗體變體并通過還原sds-page進行分析。將樣品加載至nupage4-12％bis-tris凝膠(invitrogen目錄號np0322box)上，并在200v下跑樣30min。觀察到與vh和vκ鏈的預測大小相對應的條帶，沒有任何污染蛋白質的跡象(圖37)。

實施例14：人源化抗cad-11抗體與cad-11蛋白質結合的鑒定

材料與方法

純化的抗體與重組人cad-11ec1的結合

在競爭結合elisa中評估了純化的人源化復合變體抗體(sdp011至sdp151)與重組cad-11ec1人igg1融合蛋白的結合。將人源化或對照(syn0012/h1m1)抗體從5μg/ml至0.0022μg/ml的稀釋系列與恒定濃度的生物素化的鼠抗cad-11抗體syn0012/h1m1(最終濃度為0.1μg/ml)進行預混合，之后于室溫下在nuncimmunomaxisorp96孔平底微量滴定板(fisher目錄號dis-971-030j)上孵育1小時，該板用在pbs中稀釋的0.25μg/ml重組人cad-11ec1(r&dsystems目錄號1790-ca-050)預涂覆。用鏈霉親和素-hrp(sigma目錄號s5512)和四甲基聯(lián)苯胺(tmb)底物(invitrogen目錄號00-2023)檢測生物素化的mab的結合。

鈣粘著蛋白-肽交叉反應性elisa

為了評估哪一種人源化抗cad-11抗體對于cad-11顯示出最大特異性，以elisa形式測試了人源化抗體與連接至bsa的37-mer肽結合的能力，該肽包含cad-11免疫原或與cad-11免疫原最密切相關的6個序列(取自鈣粘著蛋白-7、-8、-9、-18、-20和-24)的相應序列。

在pbs(ph7.2)中，用0.05％吐溫(emd，產(chǎn)品編號9480)的(gibco(invitrogen)，#20012)中的500ng/ml的bsa偶聯(lián)的鈣粘著蛋白37-mer肽(ne肽)(對應于鈣粘著蛋白-7、-8、-9、-18、-20和-24)于4℃下以100μl體積/孔涂覆reactibind板(thermoscientific)過夜。將含有肽的溶液從孔中去除，并將板在22℃用pbs中的2％牛血清白蛋白(bsa)以200μl體積/孔封閉2h。之后將板用200μl/孔的pbs-吐溫(0.05％)在22℃下洗滌兩次，并吸干。將體積為100μl/孔的各人源化抗cad-11抗體從5μg/ml至8ng/ml的稀釋系列在肽涂覆的孔中孵育，并在22℃下孵育1小時。從孔中去除抗體溶液，并用200μl/孔的0.05％吐溫-pbs在22℃下洗滌板兩次，并吸干。將山羊抗小鼠igg(pierce#31432)以1∶1000稀釋度、100ul/孔加入到板的各個孔中，并在22℃下孵育30min。移除第二抗體溶液，并用200μl/孔的0.05％吐溫-pbs在22℃洗滌板兩次，并吸干。通過將100μl/孔的四甲基聯(lián)苯胺(tmb)試劑igg(pierce#34022，1步turbotmb-elisa)加入到板中而使反應顯色，并在22℃下顯色5min。用100μl室溫2n硫酸終止反應并在酶標儀(wallac1420)上于450nm讀板。

在表面等離子體共振(spr)中與cad-11的結合

為了確定sdp051對重組his標記的人cad-11的親和力，將rhcad-11(r&dsystems)以單一濃度固定在芯片上，確定sdp051的高分辨率動力學，并且2態(tài)反應結合模型成功地與動力學數(shù)據(jù)擬合。

在40μl/min的流速下獲得動力學數(shù)據(jù)以最小化任何潛在的傳質效應。通過系列稀釋制備12.5nm至0.195nm的分析物濃度系列。將兩個重復的空白(無mab)和3.125nm(第一個和最后一個循環(huán))濃度的分析物編程至動力學過程中以檢查表面和分析物在動力學循環(huán)中的穩(wěn)定性。將sdp051在fc上注射360秒，該時間的長度足以觀察締合相中的曲率。

cad-11細胞結合試驗

將冷凍的表達cad-11的431d細胞(k.johnson，u.nebraska，omaha)或非cad-11表達的親本431d細胞(k.johnson，u.nebraska，omaha)解凍，洗滌并以2×10⁶個細胞/ml重懸浮，且向各個孔中加入50μl。之后在冰上利用從1ng/ml至30μg/ml的濃度增加的人源化sdp051或sdp071抗體將細胞染色45分鐘。染色后將細胞用含有1％胎牛血清(fbs)的漢克斯平衡鹽溶液(hbss)洗滌兩次，重懸浮，并用小鼠抗人igg4-pe(100×稀釋)在冰上避光染色45分鐘。在用第二種試劑染色細胞之后，將細胞用含有1％fbs的hbss洗滌兩次，重懸浮于200μl含有1％fbs的hbss中的2％甲醛中，之后用bdfacscalibur進行分析。

鈣粘著蛋白-肽交叉反應性facs試驗

將冷凍的表達cad-11的431d細胞或非cad-11表達的親本431d細胞解凍，洗滌，并以2×10⁶個細胞/ml進行重懸浮，并且將100,000個細胞加入各個孔中。利用0.5μg/mlsdp051以濃度增加的37-mercad-11肽或cad-7、cad-8、cad-9、cad-18、cad-20或cad-24肽與在冰上染色細胞45分鐘。染色之后，將細胞用含有1％胎牛血清(fbs)的漢克斯平衡鹽溶液(hbss)洗滌兩次，重懸浮，之后用100μl的山羊抗-小鼠igg-pe(100×稀釋度)在冰上避光染色30分鐘。在細胞用第二種試劑染色之后，用含有1％fbs的hbss洗滌細胞兩次，重懸浮，并在200μl含有1％fbs的hbss中的2％甲醛中固定，之后用bdfacscalibur進行分析。

結果

所有人源化抗cad-11抗體均有效地與syn0012競爭結合cad-11融合蛋白(圖38a-c)。這表明它們結合與syn0012相同的表位或cad-11上的重疊表位，并且它們與重組人cad-11的結合至少與syn0012一樣好或者更好。利用曲線計算各抗體的ic50值，并將其相對于syn0012的ic50進行標準化，syn0012包括在各個elisa板上以便可以進行板間比較(表3)。還示出了各細胞系的表達水平和各抗體的計算的等電點(pi)(表3)。

sdp051，一種vκ1/vh5抗體，以最高的特異性結合cad-11，證明它與cad-11抗原的結合比來自其他鈣粘著蛋白的相關抗原高100倍以上(圖39a-o)。針對cad-8發(fā)現(xiàn)最高的交叉反應性。sdp031、sdp061和sdp071也顯示出對于cad-11的顯著特異性，表明它與cad-11抗原的結合比來自其他鈣粘著蛋白的相關抗原高20倍以上。sdp031、sdp051、sdp061和sdp071的輕鏈和重鏈氨基酸序列在圖40a-40d中示出。

表3：復合人抗cad-11抗體的表征

相對ic50通過用syn0012的值除測試抗體的值來計算。所給出的抗體表達水平是t形瓶中的靜置培養(yǎng)的水平。pi被計算得到。

在以500ng/ml涂覆的針對cad-11抗原和cad-7、-8、-9、-11、-18、-20、-24抗原的人源化抗cad-11抗體的初步篩選(圖41a)中，證明sdp051與cad-11的結合遠高于與任何其他鈣粘著蛋白的結合。對于cad-8抗原發(fā)現(xiàn)了最大程度的交叉反應性。用50ng/ml的較低抗原涂覆濃度以及較寬稀釋系列的sdp051抗體，對cad-11、cad-8和cad-18抗原重復該試驗(圖41b)。在該試驗中，sdp051對于cad-11具有6.8ng/ml的ec50，對于cad-8具有1421ng/ml的ec50，結合差異為200倍以上。對于cad-18的ec50由于觀察到低結合水平而未能確定。這些結果證實sdp051對于cad-11是高度特異性的。利用cad-11ec1結構域的序列的blast檢索表明最接近的匹配在cad-7、-8、-9、-11、-18、-20和-24抗原之間。利用在cad-11ec1結構域中闡明的六肽sdp051結合表位的blast檢索表明沒有其他已知的人類蛋白質具有該序列。

sdp051對于rhcad-11蛋白質具有亞納摩爾的親和力，其平衡解離常數(shù)(kd)為0.37nm(表4)。

表4：sdp051的物理性質

對芯片表面的表征和對照實驗表明，以單一密度固定的rhcad-11適合于確定抗cad-11抗體相互作用的動力學值。

對于動力學分析，基于關聯(lián)的反應對照結果使用了2態(tài)反應模型(方程1，圖42)，其表明一旦抗原結合至抗體上則發(fā)生另一時間依賴性的事件。因為rhcad-11是同型二聚的，因此含有兩個相同的結合表位，有可能單獨的mab分子通過第一結合位點，而后通過兩個結合位點順序結合。

方程1：雙態(tài)反應

在細胞結合試驗中，證明sdp051和sdp071與表達cad-11的細胞劑量依賴性地結合，而不與cad-11陰性親本細胞系結合(表43)。

確定sdp051對于cad-11的特異性的可選方式為測量不同的鈣粘著蛋白阻斷sdp051與表達cad-11的細胞結合的能力。這針對鈣粘著蛋白-7、-8、-9、-18、-20、-24或-mn中的各種進行。只有cad-11肽顯著阻斷sdp051與cad-11⁺細胞的結合。分析結果在圖44a-c中示出。

實施例15：sdp051，一種人源化抗cad-11ec1抗體，在使用人類細胞的試驗中表現(xiàn)出低免疫原性

材料與方法

抗體的純化

從生長至飽和的表達抗體的細胞的5l培養(yǎng)物中純化sdp051。將上清液與細胞和碎片分離，調節(jié)至ph7.4，過濾除菌，并以5ml/min的流速通過事先已用0.5mnaoh消毒的5mlhi-trapmabselectsure蛋白a親和柱(gehealthcare，amersham，uk)跑樣。用100mlpbsph7.4洗滌該柱。用0.1m的檸檬酸鈉ph3.0洗脫抗體至5ml的級分中，并立即用0.25ml1mtris-hcl中和各級分。根據(jù)280nm處的紫外吸收來監(jiān)測各級分的蛋白質含量，并將含有蛋白質的級分合并，將緩沖液更換為10mm的醋酸鈉ph5.5并進行濃縮。使用16/60sephacryls200柱(gehealthcare，amersham，uk)通過尺寸排阻色譜法進一步純化抗體。收集主峰級分、合并、過濾除菌，并使用-ptstm(charlesriver，margate，uk)測定內毒素水平。將純化的抗體保存于+4℃下。使用計算的摩爾消光系數(shù)通過紫外吸收來確定最終濃度，其中a2801.0＝1.51mg/ml。之后將各種抗體在aimv培養(yǎng)基(invitrogen，paisley，uk)中稀釋至100μg/ml。

免疫原性分析

從自國家輸血服務中心(addenbrooke’shospital，cambridge，uk)獲得的健康供體血沉棕黃層(來自24小時內抽取的血液)中分離pbmc。通過(axis-shield，dundee，uk)和密度離心從血沉棕黃層分離pbmc，并使用cd8+(stemcelltechnologiesinc.，london，uk)耗盡cd8+t細胞。通過使用基于biotestssp-pcr的組織分型試劑盒(biotest，landsteinerstraβe，denmark)確認hla-dr單元型并通過確定t細胞對“再現(xiàn)性”對照抗原(klh：pierce，cramlington，uk)的反應來鑒定供體。之后將pbmc冷凍并儲存在液氮中直至需要時。

將來自各個供體的pbmc解凍、計數(shù)并評估生存力。將細胞在室溫aimv培養(yǎng)基(invitrogen，paisley，uk)中復蘇，并在aimv中重懸浮至4-6×10⁶pbmc/ml。對于各個供體，建立大批培養(yǎng)，在其中將總共1ml的增殖細胞儲備液加入24孔板中。將總共1ml的各稀釋試驗樣品加入pbmc中以得到每個樣品50μg/ml的最終濃度。對于每個供體，還包括陽性對照(與100μg/mlklh一起孵育的細胞)和陰性對照(僅用培養(yǎng)基孵育的細胞)。對于前4個供體，包括附加對照以測試試驗樣品對t細胞反應的調節(jié)，其中將試驗樣品和klh兩者加入pbmc中。這些樣品與單獨的klh的對比可用于評估試驗樣品對增殖的影響。

將培養(yǎng)物在37℃、5％co2中孵育共8天。在第5、6、7和8天，將各個孔中的細胞輕柔地重懸浮，并將3×100μl的等份轉移至圓底96孔板的單個孔中。將培養(yǎng)物在100μlaimv培養(yǎng)基中用1μci[³h]-胸苷(perkinwaltham，massachusetts，usa)激發(fā)，并在使用machiii細胞收獲器收獲至過濾墊(perkinwaltham，massachusetts，usa)上之前再孵育18小時。通過在microplatebeta計數(shù)器上以paralux低背景計數(shù)模式進行meltilex^tm(perkinwaltham，massachusetts，usa)閃爍計數(shù)來確定各個孔的cpm。

細胞增殖試驗

對于增殖試驗，事先確立等于或大于2的si經(jīng)驗閾值(si≥2.0)，由此將誘導超過該閾值的增殖反應的樣品視為陽性(在包括時，突出顯示≥1.90的邊界si)。廣泛的試驗開發(fā)和先前的研究已經(jīng)表明，這是在不檢測到大量假陽性響應的情況下允許最大靈敏度的最小信噪比閾值。對于增殖數(shù)據(jù)組(n＝3)，通過統(tǒng)計學和經(jīng)驗閾值來定義陽性反應：

1.通過使用非配對雙樣品studentt檢驗比較測試孔與培養(yǎng)基對照孔的cpm獲得的反應顯著性(p＜0.05)。

2.等于或大于2的si(si≥2.0)。

結果

為了進一步評估潛在的免疫原性，在8天的試驗中測試人源化抗cad-11ec1抗體sdp051誘導來自25個不同的人類t細胞供體的cd8耗盡的pbmc(cd4t細胞)增殖的潛能。盡管嵌合syn0014抗體(其為親本鼠h1m1/syn0012抗體的小鼠-人igg4fc嵌合形式)在28％的供體中誘導增殖，但sdp051抗體不誘導任何t細胞供體的增殖。這些結果支持了較早的計算機發(fā)現(xiàn)，即sdp051具有低免疫原性特征。

來自使用對照嵌合syn0014抗體和人源化sdp051抗體的免疫原性時間進程增殖試驗的結果分別在圖45a和圖45b中示出。小鼠-人嵌合syn0014抗體刺激25個供體的7個(28％的供體)中的反應，其中一個供體的反應為邊界值(供體16，為1.98)，但是仍與背景顯著不同(p＜0.05，圖45a)。人源化抗體sdp051不在任何供體(25個中的0個或供體的0％)中刺激任何反應，表明其具有低潛在免疫原性。

實施例16：sdp051，一種人源化抗cad-11ec1抗體，抑制滑膜細胞侵入和mmp3表達

材料與方法

fls侵入試驗

將原代人fls細胞系在flsmm培養(yǎng)基(dmem、10％fcs、1％青霉素-鏈霉素、1％l-谷氨酰胺、0.05％慶大霉素、1％hepes)中培養(yǎng)直至90-100％匯合。在試驗開始前一天，將fls在無血清fls培養(yǎng)基中進行血清饑餓24h。在試驗當天將培養(yǎng)基從血清饑餓的fls移除，并用0.05％的胰蛋白酶-edta將細胞從燒瓶中移出，之后用含有鈣的hbs洗滌2次。將胰蛋白酶消化的fls在mm培養(yǎng)基中重懸浮至4×10⁵個細胞/ml。將制備的基質膠包被的插入物置于含有具有5％胎牛血清(fcs)的mm培養(yǎng)基的24孔板中，該fcs充當fls的化學引誘物。在室的另一側放置50μl含有6μg/ml或0.6μg/ml的sdp051(工作濃度的兩倍)或6μg/ml的對照ac1-p抗體的mm培養(yǎng)基，之后向其中加入每個孔50μl的4×10⁵個細胞/ml的細胞懸液。將含有fls和抗體的室在37℃培養(yǎng)箱中孵育18h。

24小時后，將含有細胞的插入物在100％的甲醇中于-20℃固定30分鐘，并將粘附在基質膠包被的膜內部的非侵入fls用棉拭子去除。將該膜干燥，之后用碘化丙啶(pi)在室溫下于黑暗中染色30min。去除pi染色劑并將插入物用d-葡萄糖(1mg/ml)洗滌，之后在黑暗中干燥。將膜切下并使用熒光顯微鏡在載玻片上成像，并對通過膜遷移的fls的數(shù)目進行定量。

結果

cad-11是fls生物學所需的關鍵的鈣粘著蛋白。因此，cad-11拮抗劑有望抑制人原代fls降解以及侵入分隔兩個孔的基質膠層的能力?；|膠由多種細胞外基質蛋白質組成。fls生物學的這種體外模型復制了fls生物學的多個方面，包括它們降解以及鉆入軟骨中的能力。

sdp051顯著地抑制fls向基質膠中的侵入。與同種型對照抗體相比，0.3μg/ml的sdp051抗體足以抑制50％的原代人fls向基質膠膜內的侵入(圖46)。

fls表達mmp3，其被認為是參與體內軟骨和體外侵入試驗中的基質膠的降解的酶之一。收獲來自侵入試驗的上清液，之后固定細胞，并在-80℃冷凍。將這些上清液解凍，并測試培養(yǎng)基中mmp3的存在。mmp3水平在含有對照抗體(ac1-p)處理的fls的孔中顯著增加，該fls受到fcs刺激以遷移(圖47)。mmp3水平在sdp051處理的、用fcs刺激的fls中顯著降低。與用對照抗體處理的細胞相比水平降低了約50％。

實施例17：sdp051，一種人源化抗cad-11ec1抗體，抑制關節(jié)炎動物模型中的關節(jié)炎癥

為了在關節(jié)炎動物模型中測試sdp051抗體，選擇了由d.mathis和c.benoist開發(fā)的關節(jié)炎k/bxn血清轉移模型(korganowas，jih，mangialaios，duchatellev，pelandar，martint等人.fromsystemictcellself-reactivitytoorgan-specificautoimmunediseaseviaimmunoglobulins.immunity1999；10：451-61)。該模型呈現(xiàn)出廣泛的滑膜炎，并因此是針對sdp051抗體的抗炎和關節(jié)保護性能的良好測試。

在第0天和第2天對六至八周齡的c57bl/6小鼠腹膜內(ip)注射75μlkbn血清(jacksonlabs，barharbor，me)。在第-1天、第0天、第1天、第2天、第4天和第6天用10mg/kg的sdp051或對照(ac1-p)對小鼠進行ip給藥。在研究的第0天、第2天、第4天、第6天、第8天和第10天，在保持踝關節(jié)處于完全屈曲位的各個小鼠的兩個后腳踝處，使用帶彈簧的帶表卡尺(7308型mitutoyo測厚儀，longislandindicatorservice，hauppauge，ny)測量關節(jié)腫脹或踝最小厚度。確定在第0天和測量當天的關節(jié)厚度之間的差異。踝最小厚度隨著研究進程的變化在圖48中用曲線圖表示。踝最小厚度得分的差異在第6天、第8天和第10天是顯著的。在第10天，sdp051組中的踝關節(jié)腫脹比對照組中的腫脹低47％。

在第10天，從各個研究小鼠的末梢放血收集血清。將血清在干冰上冷凍，并儲存在-80℃。通過使用cad-11肽作為捕獲試劑在elisa中檢測血清，之后用抗人igg檢測sdp051，由此確定sdp051的血清水平。sdp051可以很容易地在小鼠的血清中檢測到(圖49)。

在第10天時獲取踝關節(jié)，并對組織病理學進行評估。軟骨侵蝕、骨侵蝕以及炎癥(細胞浸潤)的嚴重程度由對研究組不知情的合格技術人員按照0-5的得分來評估。第10天的組織病理學結果總結于表5中。sdp051處理的動物顯示軟骨侵蝕得分下降35％，骨侵蝕得分下降27％，而炎癥得分下降25％。

表5.第10天的組織病理學結果(kbn013)

*＝p＜0.05；±＝平均值的標準誤差

實施例18：kbn關節(jié)炎模型中的sdp051劑量反應

小鼠在第0天和第2天給予kbn血清。小鼠在第0天、第2天、第4天和第6天腹膜內給予10mg/kg、3mg/kg或1mg/kg的sdp051或對照ac3-1-p。踝最小厚度的變化在圖50中示出。在用3mg/kg或10mg/kgsdp051處理的小鼠中觀察到踝最小厚度的降低趨勢。在10mg/kg組中踝關節(jié)腫脹的減輕在第6天、第8天和第10天是顯著的。在第10天，該組中的踝關節(jié)腫脹比對照組中的腫脹低44％。在一系列研究中，10mg/kg的sdp051顯著地減輕了關節(jié)腫脹。在3mg/kg時具有減輕關節(jié)腫脹的趨勢。

實施例19：sdp051降低與類風濕性關節(jié)炎的病理學有關的細胞因子

在第0天、第1天、第2天、第4天和第6天通過尾靜脈靜脈內給予小鼠10mg/kg的sdp051或ac3-1-p對照抗體。在第6天，sdp051組顯示比對照組低33％的踝關節(jié)腫脹(表6)。對在第7天從這些小鼠獲取的踝關節(jié)進行如下細胞因子分析：收獲踝關節(jié)，去除皮膚和毛皮，并將關節(jié)在液氮中快速冷凍。之后將關節(jié)溶解在補充有2mmpmsf(sigma產(chǎn)品編號p7626)和1×蛋白酶抑制劑混合物(sigma產(chǎn)品編號p8340)、0.1m吲哚美辛的勻漿緩沖液(affymetrix組織勻漿緩沖液(產(chǎn)品編號pc6002))中，并離心，并且在多重分析(oceanridgebiosciences)中測定所得到的上清液的各種細胞因子和趨化因子的水平。

sdp051處理組顯示破骨細胞分化因子、可溶性核因子κb受體活化因子配體(srankl)、破骨/淋巴趨化因子、巨噬細胞炎性蛋白-1(mip1α)、單核細胞趨化因子單核細胞趨化蛋白-1(mcp1)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)以及白細胞趨化因子、活化調節(jié)的正常t細胞表達和分泌因子(rantes)的水平降低了29％-51％(表6)。對于il-6或tnfα水平?jīng)]有觀察到影響或只有極小的影響。血管內皮生長因子(vegf)觀察到適度的增加，而在試驗組中未檢測到il-23。

提出的sdp051的作用機制是，抗體結合小鼠關節(jié)中成纖維細胞樣滑膜細胞上的cad-11，引起促炎細胞因子和趨化因子表達的降低。確實，在sdp051處理的小鼠中，提示參與fls生物學的幾種白細胞趨化因子(包括mcp-1、rantes和mip1α)在ra患者的關節(jié)中減少(-vicunar，gomez-gavirom，dommguez-luism，pecm，gonzalez-alvarom，alvaro-graciam和-gonzalezf，2004arth&rheum，50，第3866-3877頁)(表6)。此外，srankl是成骨細胞發(fā)育的重要介質，且由各種炎性細胞因子在fls上誘導rankl的表達(hashizumem，hayakawan和miharam，2008，rheumatology47第1635-1640頁)。sdp051處理的小鼠顯示在它們的關節(jié)處的srankl水平的降低(表6)。雖然這些效果適中，但這些變化的局部區(qū)域效應可以放大。

本文引用的所有專利、公開的申請以及參考文獻的有關教導均通過引用整體并入本文。

雖然已經(jīng)參考本發(fā)明的示例性實施方式對本發(fā)明進行了具體說明和描述，但是本領域技術人員應當理解，在不背離由隨附的權利要求所涵蓋的本發(fā)明的范圍的情況下，可在形式和細節(jié)上對其做出各種改變。